Содержание к диссертации
Введение
1. Морфофункциональная и молекулярная организация лимфоцитов 12
1.1. Особенности морфологии и дифференцировки лимфоцитов 12
1.2. Молекулярная организация лимфоцитов 18
2. Роль мембранного аппарата лимфоцитов в процессе адаптации 28
2.1. Рецепторы лимфоцитов 28
2.2. Активация мембран лимфоцитов 30
2. Краткосрочная адаптация лимфоцитов 33
3. Роль апоптоза и некроза в адаптационном процессе 37
3.1. Морфология апоптоза 38
3. Некроз и деструкция 40
4. Универсальность механизмов стресса на клеточном уровне и адаптивных ответов клеток 43
5. Материал и методы исследования 54
5.1. Объект исследований 54
5.2. Методы исследований 56
6. Морфология и молекулярная организация лимфоцитов 71
7. Адаптационные перестройки лимфоцитов при бронхолегочных заболеваниях 85
8. Восстановление лимфоцитов после обострения бронхолегочных заболеваний 115
9. Срыв процессов адаптации 128
9.1. Роль биогенных аминов в срыве процессов адаптации 128
9.2. Роль апоптоза и некроза в процессах срыва адаптации лимфоцитов 143
10. Пути повышения адаптационных возможностей лимфоцитов 156
10.1. Активация лимфоцитов низкоэнергетическим гелий-неоновым лазером 156
10.2. Повышение адаптационных возможностей лимфоцитов под влиянием плазмафереза 192
11. Обсуждение результатов исследований 203
Выводы 236
- Молекулярная организация лимфоцитов
- Краткосрочная адаптация лимфоцитов
- Методы исследований
- Повышение адаптационных возможностей лимфоцитов под влиянием плазмафереза
Введение к работе
Актуальность исследований. Адаптация к условиям среды является характерным и важнейшим свойством живых систем любых уровней организации, на всех этапах филогенеза. В процессе эволюции, путем отбора, клетки приобрели способность в неблагоприятных условиях переводить свой метаболизм на аварийный режим, при котором происходит сужение их метаболической и функциональной активности, но обеспечивается поддержание и сохранение жизни (Насонов Д. Н., 1959; Александров В. Я., 1985; Рыскулова С. Т., 1986; Браун А. Д., Моженок Т. П., 1987; Craig Е. А. 1985; Wei Y. Н. et al., 1998; Melov S., 2000; Cadenas E.. et al., 2000).
Исследование неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы, его причин, симптомов, молекулярных механизмов относится к фундаментальным проблемам биологии клетки. Интерес к этим вопросам вызван многими причинами, прежде всего самой практикой. Это механизм реакций живых систем на действие экстремальных по интенсивности и характеру раздражителей (Суханова Г. А., Серебров В. Ю., 2000; Давтян Т. К., Аванесян Л. А., 2001). Велико значение этой проблемы для биологии, медицины, ветеринарии. Для постановки правильного диагноза, контроля за эффективностью лечения, профилактики болезней людей и животных необходимо проведение исследований на клеточном и молекулярном уровнях.
Исследование адаптационного синдрома клеточной системы привлекает внимание и с теоретической точки зрения. Адаптационный синдром - это реакция клетки на действие альтерирующих факторов (экзо- и эндотоксинов). При адаптационном синдроме нарушение свойств клетки проявляется в разнообразных изменениях морфологического, физиологического, физико-химического и биохимического характера. Для многих современных работ по адаптационному синдрому клеточной системы характерно выявление особенностей действия различных факторов, специфики реагирования различных клеточных типов (Тиунов Л. А., 1986; Соловьян В. Т., 1990). Для исследования адаптационного синдрома очень важно наряду с изучением его специфических черт исследовать общие (неспецифические) признаки реакции.
Интерес к проблемам адаптационного синдрома обусловлен открытием и введением в практику в последние годы большого числа новых физических, химических и биологических альтерирующих агентов, способных оказывать неблагоприятное действие на клетки. При коррекции эндотоксикоза необходим анализ действия на клетку указанных агентов, что важно для установления доз, с которыми можно безопасно работать.
Первоначально понятие стресса (общего адаптационного синдрома, по Селье) рассматривалось как комплекс физиологических или патологических реакций мобилизации на уровне целого организма, обеспечивающих поддержание его гомеостаза в меняющихся условиях окружающей среды, оно вполне применимо и к единичным клеткам (Селье Г., 1972; Александров В. Я., 1985; Браун А. Д., Моженок Т. П., 1987; Барабой В. А., 1991; Киселева Р. Е„ 1994; Мельникова Н.А. 1994; Кузьмичева Л. В., 1995). При этом реакция клеток на действие раздражителей, к которым относятся и эндотоксины мембранотропного действия, является неспецифической. В начальный период действия неблагоприятных факторов изменения метаболизма в основном сходны с физиологическим возбуждением (Браун А. Д., Моженок Т. П., 1987). При усилении неблагоприятного фактора изменения обмена направлены в наиболее выгодную для данных условий сторону: часть метаболических реакций блокируется, и одновременно включается ряд процессов, не функционирующих или слабо функционирующих в норме (например, аэробный гликолиз, синтез белков стресса). Еще одним характерным ответом клетки на стрессовые воздействия является накопление в просвете цитоплазматического ретикулума «незаконченных» белков, т. е. белков без соответствующей нативной трехмерной конформации (Kautman R. J., 1997), при этом одновременно активируется интерферон-зависимая Ser/Thr-протеинкиназа, что приводит к апоптозу. Такое развитие событий характерно для вирусной инфекции. Аккумуляция незавершенных белков в цитоплазматическом ретикулуме приводит к индукции транскрипции ряда генов, кодирующих шапероны белков цитоплазматической сети.
Перекрытие клеточных адаптационных ответов, возможно, объясняется активацией в клетках под действием стресса универсального плейотропного посредника (сигнала тревоги), способного воспринимать индуцирующие сигналы и запускать каскад ответных реакций (Соловьян В. Т., 1990). По мнению В. А. Барабой (1991, 1992), таким универсальным сигналом служит смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия в направлении активации ПОЛ в биологических мембранах (Киселева Р. Е., Кузьмичева Л. В., 1995 - 2002; Halliwel В. et al., 1992; Behl С, Skutella et al., 1997; Blumberg J. В., Halpner A. D., 1999).
Интенсивные исследования апоптоза как механизма программированной клеточной гибели (Ellis R. Е. et al., 1991; Новиков В. С, 1996; Ярилин А. А., 1996, 1998; Хансон К. П., 1997) рассматривают вопрос о соотношении некроза и апоптоза в ответе клетки на разнообразные внешние неблагоприятные воздействия, включая токсические эффекты ксенобиотиков. Основные отличия некроза и апоптоза хорошо известны и широко обсуждаются в литературе (Лушников Е. Ф., Загребин В. М., 1987; Ярилин А. А., 1996; Новожилова с соавт., 1996; Скулачев В. П., 1996; Уманский С. Р. 1996; Lockshin R. A., Zakeri Z., 1991; Arends М. J., Wyllie А. Н., 1991; Fesus L., 1993; Harris С. С, 1996; Hardwick J. V., 1997; Golstein P., 1997).
Интенсивность повреждающего стимула является решающим аргументом в развитии токсического ответа клетки по линии некроза или апоптоза, что находит многочисленные экспериментальные подтверждения (Скулачев В. П., 2001; Berger N. А., 1985; Buttke Т. М, Dypbukt J. М., 1994).
Для активизации процессов адаптации к различным альтерирующим факторам и снижения уровня эндотоксикоза в организме в последнее время интенсивно ведутся исследования в области фотобиологии живой клетки и разработке методов активной хирургической детоксикации, среди которых ведущее место занимает обменный плазмаферез (Рыжко В. В. с соавт., 1995; Пиксин И. Н. с соавт., 1996; Саматолкин А. К., 1996; Ишина Т. И. с соавт., 2001). Одним из направлений в области лазеротерапии стало изучение влияния лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм на иммунокомпетентные клетки, в частности на лимфоциты периферической крови человека (Федосеева Г. Е. с соавт. 1987; Свиридова С. П. с соавт., 1989; Маянский Д. Н., 1991; Козлов В. И. с соавт., 1992, 1993; Киселева Р.Е., Кузьмичева Л.В., 1992 - 2004). В нашей работе рассматривается спектр различных доз, действующих на лимфоциты и их эффекты в пострадиационный период, с целью выявления механизмов адаптации и оптимальной дозы как лечебного фактора.
Цель исследования — изучить основные морфофункциональные особенности краткосрочной адаптации лимфоцитов под влиянием экзо- и эндогенной интоксикации, вызванной бронхолегочной патологией.
Задачи исследования:
1. Выявить общебиологические закономерности реализации стресс-реакции на клеточном уровне.
2. Дать морфофункциональную оценку процессам краткосрочной адаптации и выявить роль стрессорных факторов (эндотоксинов мембранотропного действия) на уровне популяций и субпопуляций клеточного звена иммунитета.
3. Исследовать роль биогенных аминов в срыве процессов адаптации. Раскрыть роль апоптоза и некроза как результата срыва процессов адаптации.
4. Дать общую морфофункциональную оценку повышению адаптационных возможностей лимфоцитов под влиянием НЭГНЛ и плазмафереза.
Научная новизна исследования. Предложена схема развития стресс-реакции на клеточном уровне на основе комплексного подхода в оценке краткосрочной адаптации лимфоцитов, базирующаяся на общебиологических закономерностях перестройки клеточных мембран, связанных с увеличением их текучести и проницаемости, энергизованности митохондрий, изменением в гетерогенности клеточного хроматина.
Впервые дана морфофункциональная оценка начала стрессорной реакции, сопровождающейся в первую фазу процессами активации мембранного аппарата лимфоцитов, изменением пула фосфолипидов и отношением НЖК/ННЖК, энергизованностью митохондрий, повышением уровня эухроматина в ядрах. Затем наступает спад биоресурсов клетки, и если она способна адаптироваться (вторая фаза), то происходит развитие компенсаторно-приспособительных реакций, приводящих к восстановлению нормальных процессов; если нет, то клетка переходит в третью фазу, завершающуюся апоптозом или некрозом, в зависимости от силы альтерирующего фактора.
Показана роль стрессорных факторов (эндогенных токсинов, образующихся в период обострения бронхолегочных заболеваний) в первую фазу — активации. Результаты биохимических и гистохимических исследований свидетельствуют, что при действии на клетки раздражителей после некоторого периода подъема метаболической активности, продолжительность которой зависит от типа Т-лимфоцитов (Тх, Тс, Тк) или В-клеток, наступает вторая фаза — адаптации, или третья — фаза истощения, характеризующаяся развитием апоптоза и некроза. Показана роль антиоксидантного стресса в этом процессе. Избыток АФК инициирует цепную реакцию ПОЛ, ведущую к повреждению клеточных мембран, уменьшению их текучести, повышению проницаемости, снижению энергизованности митохондрий.
Изучена корреляционная зависимость между биогенными аминами и отдельными фазами краткосрочной адаптации, апоптозом и некрозом, в зависимости от тяжести заболевания (бронхит, пневмония, бронхиальная астма).
Дана морфофункциональная оценка общебиологических закономерностей повышения адаптационных возможностей, развивающихся в лимфоцитах после воздействия НЭГНЛ или плазмафереза. Выявлены механизмы влияния на стрессовую реакцию в плане ее ослабления за счет активации лимфоцитов НЭГНЛ и удаления эндотоксинов в результате использования плазмафереза. Использование различных доз НЭГНЛ отчетливо документируют морфологическую картину активации, выражающуюся повышением аффинитета популяций и субпопуляций лимфоцитов; увеличением микровыростов на плазматической мембране; повышением люминесценции ДСМ, возгорании «желто-зеленой» люминесценции мембран лимфоцитов и плазматической мембраны; увеличением флуоресценции акридинового оранжевого, свидетельствующей об интенсификации биосинтетических процессов в лимфоцитах.
Практическая новизна исследования. Результаты исследований позволили систематизировать, углубить и расширить сведения о морфологических, ультраструктурных, гистохимических, иммунофлуоресцентных и биохимических характеристиках лимфоцитов. Установлены популяционные и субпопуляционные морфофункциональные особенности лимфоцитов. Выявлены функциональные и морфологические особенности этапов краткосрочной адаптации, связанные с изменениями, происходящими на уровне плазматической мембраны, ее текучести и проницаемости, опосредованной через изменение фосфолипидного, жирно-кислотного и холестеринового обмена, коррелирующего с показателями изменения аффинитета, спектров флуоресценции пирена; на уровне митохондрий - документированных электронно-микроскопическими картинами, изменением флуоресценции ДСМ и активности СДГ; на уровне ядра - изменение степени гетерогенности хроматина, интенсивности флуоресценции, свидетельствующее об усилении биосинтетических процессов; биогенных аминов.
Теоретическая значимость исследования. Результаты диссертационного исследования расширяют представления о краткосрочной адаптации лимфоцитов. Выявленные изменения первой фазы - активации, второй - адаптации и третьей фазы - истощения, которые вносят новое понимание в причины перехода из одной фазы в другую при развитии стресс-реакций. На основе этого обсуждаются возможности оказания влияния на стрессовую реакцию в смысле ее ослабления за счет повышения активности лимфоцитов под влиянием НЭГНЛ и плазмафереза в фазу их адаптации к стрессорным факторам.
Для практической медицины и фотобиологии могут быть важны полученные результаты о том, как эндотоксины влияют на лимфоциты, как осуществляется реализация действия биогенных аминов в процессах срыва адаптации и усиления апоптоза и некроза. Все это целесообразно учитывать в практической медицине при одновременном использовании препаратов, влияющих на медиаторный обмен и свободнорадикальное окисление липидов.
Полученные в диссертации данные используются в учебном процессе и отражены в двух монографиях.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Выявлены закономерности молекулярной и структурной организации иммунокомпетентных клеток. Определена степень аффинитета отдельных популяций и субпопуляций лимфоцитов на основе фосфолипидного состава их мембран и рецепторных детерминант, расположенных на плазматической мембране. В ядре выявлена степень гетерогенности хроматина.
2. Установлены закономерности активации лимфоцитов, происходящие в результате воздействия различных доз НЭГНЛ, реализующиеся через мембранный аппарат повышением аффинитета; энергизованность митохондрий и ядерных структур, связанной с возгоранием желтой люминесценции; перераспределение фосфолипидов и жирных кислот мембран в сторону увеличения их текучести; диспергирование хроматина и повышение биосинтетических процессов, свидетельствующих об интенсификации синтеза в клетках, зависящих от дозы облучения.
3. В модельных опытах (использованы лимфоциты крови больных БЛЗ: хроническим бронхитом, острой пневмонией, обострение ИАБА и АБА) выявлено влияние действия как экзогенных, так и эндогенных токсинов мембранотропного действия, характеризующихся накоплением Р-белков, МСМ, ЦИК, ПОЛ, повышением ИТ, характеризующимся снижением детоксикационных способностей альбумина. Показана роль эндотоксинов, приобретающих самостоятельное значение в развитии деструктивных процессов, сопровождающихся снижением аффинитета лимфоцитов, изменением текучести мембран (индекс отношения Х/ФЛ сдвинут в сторону повышения содержания холестерина), снижением энергизованности митохондрий и биосинтетических процессов. Выяснено, что до 20 % лимфоцитов погибает под влиянием эндо- и экзогенных токсинов.
4. Установлены некоторые особенности влияния биогенных аминов в процессе срыва краткосрочной адаптации. При хроническом бронхите и пневмонии ведущую роль в этом процессе играют адреналин и норадреналин, при бронхиальной астме - гистамин и серотонин.
5. Установлена роль апоптоза и некроза в срыве краткосрочной адаптации.
6. Выявлено, что на активацию процессов адаптации к воздействию НЭГНЛ или обменному плазмаферезу исключительное влияние имеет правильное дозирование фактора, к которому адаптируются клетки, так как адаптация имеет свою «цену», связанную с чрезмерной активацией синтеза нуклеиновых кислот и белков, составляющих основу адаптации, но вместе с тем означает и значительную трату структурных ресурсов клеток.
Молекулярная организация лимфоцитов
Рассмотрение цитоструктур лимфоцитов и их роли в иммунном ответе необходимо начинать с описания мембраны. В клетке много разных мембран - плазмолемма, или плазматическая мембрана (окружает клетку); внутренняя и наружная мембраны ядерной оболочки, внутренняя и наружная мембраны митохондрий, мембраны ЭПС (эндоплазматической сети), лизосом, пероксисом и прочих мембранных структур. Между этими мембранами существуют определенные различия, но имеется много общего. Самое главное они построены по одному и тому же принципу. Строение клеточных мембран. Мембрана лимфоцитов представляет собой сложную структуру, отличающуюся высокой степенью динамичности, «текучести» ее элементов, образующих подвижную мозаичную структуру, в составе которой крупные молекулы могут перемещаться относительно друг друга. Эти перемещения возникают вследствие взаимодействия компонентов мембраны с молекулами антигена, иммуноглобулинов и их комплексами. Все эти особенности в равной мере присущи мембранам как Т- так и В-лимфоцитов (Болдырев А. А., 1985; Брондз Б. Д., 1987; Адо А. Д., 1993; Федорова М. 3., Левин В. Н., 2001). Одним из свойств мембран является их подвижность. Липидный бислой - по существу жидкое образование, в пределах которого молекулы могут свободно передвигаться и перестраиваться практически в любую форму, причем без потери контактов, что соответствует их взаимному притяжению. Вторым важным свойством бислоев липидов является их способность самозамыкаться, на основе чего возможно слияние и расщепление липидных слоев. Мембрану можно разделить на две части, каждая из них вновь образует замкнутую структуру. Слияние мембран также играет важную роль во многих внутриклеточных процессах, например, образовании вторичных лизосом. К третьей особенности липидных мембран относится их непроницаемость для молекул, растворимых в воде. Такие молекулы не в состоянии пройти через бислой, ибо для этого им необходимо преодолеть гидрофобный участок. Чтобы физически проникнуть через такую пленку, вещество само должно быть гидрофобным или воспользоваться случайными щелями, открывшимися в бислое в результате молекулярных перемещений. Основным строительным материалом биологических мембран являются липиды и белки.
По данным Т. М. Баглаева (1983) 70 % поверхности мембран Т-лимфоцитов занимают липиды, а около 30 % - интегральные белки, тогда как у В-лимфоцитов - соответственно 60 и 40 %. Фосфолипиды, составляющие главную часть липидной фракции, составляют 40 - 90 % общего количества мембранных липидов. В мембранах наиболее часто встречаются фосфолипиды пяти типов: фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, кардиолипин, дифосфатидилглицерол, сфингомиелин. В состав мембраны входят в небольшом количестве и углеводы, образующие комплексы с белками и липидами (Крепе Е. М., 1981; Добрецов Г. Е., 1987, 1989; Петров Р. В., Атауханов Р. И., 1991; Баглаев Т. М. и соавт., 1998). Одним из важных факторов, определяющих текучесть мембран является наличие холестерола. Холестерол обеспечивает подвижность липидов и в тоже время увеличивает механическую прочность бислоя. Молекулы холестерола ориентируются в бислое таким образом, чтобы их гидроксильные группы примыкали к полярным головкам молекул. При этом плоские стероидные кольца молекул холестерола частично иммобилизуют участки углеводородных цепей, непосредственно примыкающих к полярным головам. Суммарное содержание холестерина в мембранах лимфоцитов у взрослых людей составляет — 40 % и детей — 30 % . Значение фракции жирных кислот и холестерина для функционирования мембран лимфоцитов становится очевидным при сравнении их липадного спектра с таковым эритроцитов. Так, у здоровых детей в лимфоцитах индекс отношение холестерина к фосфолипидам ниже (0,83 ± 0,06), чем в эритроцитах (1,15 ± 0,08), что обеспечивает большую подвижность мембран иммунокомпетентных клеток, необходимую для выполнения ими основных иммунологических функций (распознавание, кооперативные взаимодействия, цитотоксичность и т. д.). Концентрация свободных жирных кислот в лимфоцитарных мембранах в 10 раз превышает ее содержание в эритроцитах. Это служит показателем высокого уровня метаболизма жирных кислот в лимфоцитах и свидетельствует о повышении роли этой фракции в осуществлении иммунологических функций. Энергетический обмен в мембранах лимфоцитов соответствует той функциональной нагрузке, которую они выполняют (Халилов Э. М. и соавт., 1982; Извекова В. А., 1991; Мартынова Е. А., 1998; Когтева Г. С. и соавт, 1998; Трофимов В. А. и соавт., 2000). Большая группа мембранных белков - белки, участвующие в передаче сигналов от одних клеток к другим. Такая передача осуществляется в очень многих случаях и самыми разными способами. Многие мембранные белки погружены в бислой липидов и имеют гидрофобные участки, которые взаимодействуют с гидрофобными хвостами липидных молекул внутри бислоя, и гидрофильные участки, обращенные к воде с одной или с обеих сторон мембран. Гидрофобность некоторых мембранных белков увеличивается за счет ковалентного присоединения одной или более цепей жирных кислот, которые помогают этим белкам удержаться в бислое. Внутри мембраны полярные группы полипептидной цепи стремятся образовать связи друг с другом. Число водородных связей между полипептидными группами оказывается максимальным, если участок полипептидной цепи, проходящий через бислой, образует а-спираль или р-слой. В формировании современных представлений о механизмах функционирования лимфоцитов большое значение приобретают исследования их мембранного аппарата, так как мембраны несут на себе основную функциональную нагрузку при распознавании «своего» и «чужого» в процессах активации и кооперации клеток, регуляции иммунного ответа (Владимиров Ю. А., 1979; Чучалин А. Г. и соавт., 1992; Горошинская И. А. и соавт., 1999; Антонова Т. В. и соавт., 1999). Строение ядерной мембраны лимфоцитов. Почти вся ДНК эукариотической клетки сосредоточена в ядре, объем которого составляет приблизительно 10,0 % от общего объема клетки.
Ядро окружено ядерной оболочкой, состоящей из двух концентрически расположенных мембран (Белоконева О.С., 1993; Губский Ю. И. и соавт., 1994; Стручков В.А., 2000). Ядерная оболочка включает две мембраны - внутреннюю и наружную. Между ними находится перинуклеарное пространство шириной 20-50 нм. Двойная ядерная мембрана изолирует центральные генетические процессы -репликацию ДНК и синтез РНК - от рибосом цитоплазмы, где происходит синтез белка. В основе каждой мембраны лежит липидный бислой. Мембранные белки могут быть интегральными (принизывают липидный бислой насквозь) и периферические (связаны с какой-нибудь из поверхностей мембраны). Наружная ядерная мембрана со стороны цитоплазмы нередко покрыта рибосомами. При этом она может непосредственно переходить в мембраны эндоплазматической сети. С внутренней поверхностью внутренней мембраны связана тонкая пластинка (ядерная ламина) белковой природы. Эта пластинка образована промежуточными филаментами (d = 10 нм) и рассматривается как компонент ядерного матрикса. Кроме того, матрикс включает внутриядерную фибриллярную сеть. К ядерной ламине и внутриядерной сети крепятся хромосомы, а также разнообразные белковые комплексы с ферментативной или регуляторной функцией. Хроматин расположен вдоль внутренней ядерной мембраны, но отсутствует вокруг каждой ядерной поры и под ней. Кроме белковых компонентов гетеро- и эухроматин богат нейтральными липидами, которые по видимому участвуют в компактизации фибрилл хроматина (Зайцев В. Г., 1989; Стручков В.А., 1993). Гетерохроматин - сильно конденсированные и потому функционально неактивные участки хромосом. Они имеют вид плотных глыбок и интенсивно красятся базофильными красителями. Многие глыбки находятся на периферии ядра и прилежат к ядерной оболочке. Напротив, эухроматин — функционально активные, практически деконденсированные и потому светлые участки хромосом, расположенные между глыбками гетерохроматина.
Краткосрочная адаптация лимфоцитов
Проблема адаптации - одна из центральных в биологии, так как с ней связаны основные функции: 1 - поддержание структурной целостности макромолекул (ферментов, сократительных белков, нуклеиновых кислот и др.) при их функционировании в специфических условиях; 2 - достаточное снабжение клетки макроэргами, восстановительными эквивалентами, необходимыми для протекания процессов биосинтеза, пластическим материалом, используемым при синтезе запасных веществ; 3 - поддержание систем, регулирующих скорости и направления метаболических процессов в соответствии с потребностями клетки. Адаптация к неблагоприятным условиям среды — важнейшее свойство организма. Она реализуется через основные регуляторные системы: нервную, эндокринную и иммунную. В ответ на воздействие различных неблагоприятных факторов среды развиваются множественные неспецифические реакции как всего организма, так и отдельных клеточных популяций. Одна из наиболее изученных общих неспецифических реакций организма, определенная Г. Селье как стресс, является стереотипной эволюционно древней генетически детерминированной адаптивной реакцией организма в ответ на воздействие необычных по силе, качеству или продолжительности действия раздражителей, угрожающих нарушением гомеостаза (Давтян Т. К., 2001). Весь синдром стресса, или иначе «общий адаптационный синдром», протекает стадийно, характеризуется определенным комплексом изменений в нейроэндокринной системе и оказывает влияние на уровень неспецифической резистентности организма, его воспалительный потенциал и обмен веществ (Селье Г., 1972). Стресс-реакция развивается в ответ на действие разных по качеству, но сильных раздражителей и состоит их следующих стадий: 1. «Реакция тревоги», во время которой мобилизуются защитные силы организма. Эта стадия длится 24 - 48 часов, для неё характерно уменьшение тимуса, лейкоцитоз, определенное соотношение форменных элементов крови: лимфопения, анэозинофилия, нейтрофилез, развитие кровоизлияний и язв в слизистой желудочно-кишечного тракта. В эндокринной системе происходит стимуляция секреции кортикотропина в гипофизе, приводящая к повышению секреции глюкокортикоидов коры надпочечников. Секреция минералокортикоидов угнетена. Угнетена также деятельность щитовидной и половых желез. 2. «Стадия сопротивления, или устойчивости». Селье показал, что в этой стадии устойчивость организма к вредным воздействиям повышена.
Происходит нормализация деятельности желёз внутренней секреции и тимико-лимфатической системы, а иногда даже повышение функциональной активности желез, угнетенных в первую стадию реакции. 3. «Стадия истощения», которая наступает, если стрессор оказывается достаточно силен и действует достаточно долгое время. Сильное или длительное напряжение приводит к повторному угнетению защитных сил организма. Характер деятельности эндокринных желез очень близок к тому, что наблюдается при реакции тревоги: глюкокортикоиды преобладают над минералокортикоидами, снижена активность щитовидной и половых желез, угнетены системы: соединительной ткани, тимико-лимфатическая, иммунная. Переход между тремя типичными стадиями синдрома не резкий: наблюдается некая размытость границ. Развитие адаптивных процессов осуществляется постепенно и документируется полиморфизмом клеточных форм в составе ткани. Именно ступенчатость, постепенность развития изменений определяют различия структурно-функционального состояния клеток. В тоже время на внутриклеточном (органоидном) уровне спектр структурных перестроек довольно однообразен и отражает в основном степень выраженности развивающихся изменений. Хотя понятие стресса (общего адаптационного синдрома, по Селье) первоначально рассматривалось как комплекс физиологических или патологических реакций мобилизации на уровне целого организма, обеспечивающих поддержание его гомеостаза в меняющихся условиях окружающей среды, оно вполне применимо и к единичным клеткам (Селье Г., 1972; Александров В. Я., 1985; Браун А. Д., Моженок Т. П., 1987; Барабой В. А., 1991; Киселева Р. Е., 1994; Мельникова Н.А. 1994; Кузьмичева Л. В., 1995). При этом реакция клеток на действие раздражителей, к которым относятся и эндотоксины мембранотропного действия, является неспецифической. В начальный период действия неблагоприятных факторов изменения метаболизма в основном сходны с физиологическим возбуждением (Браун А. Д., Моженок Т. П., 1987). При усилении неблагоприятного фактора изменения обмена направлены в наиболее выгодную для данных условий сторону: часть метаболических реакций блокируется, и одновременно включается ряд процессов, не функционирующих или слабо функционирующих в норме (например, аэробный гликолиз, синтез белков стресса). Этот защитный комплекс, направленный на сохранение жизненно важных центров, и есть неспецифический адаптационный синдром клеточной системы (Кондрашова М. Н. и соавт., 1973; Соловьян В. Т., 1990; Малышев В. В.. 1993; Пузырев А. А. и соавт., 1997; Кузьмичева Л. В., Киселева Р. Е., 2002; Еропкин М. Ю., Еропкина Е. М., 2003)
Процессы структурно-функциональной перестройки осуществляются на протяжении всего жизненного цикла клеток как в условиях нормального функционирования, так и при воздействии неблагоприятных факторов. В связи с этим явление адаптации ткани рассматривается как единый процесс, осуществляющейся на всем протяжении онтогенеза. Апоптоз - вид гибели клетки (Buja L. М. Et al., 1993; Dive С et al., 19944 Thomson С. В., 1995; Majno G., Jons I., 1995; Hug H., 1997; Ярилин A. A., 1996; Новиков В. С, 1996; Лушников Е. Ф., Абросимов А. Ю., 2001), характеризующийся: функционально - необратимым прекращением ее жизнедеятельности; морфологически - потерей микроворсинок и межклеточных контактов, конденсацией хроматина и цитоплазмы, уменьшением объема клетки (сморщиванием), образованием пузырьков из плазматической мембраны, фрагментацией клетки и образованием апоптозных телец; биохимически - гидролизом белков цитоплазмы и межнуклеосомным распадом ДНК; генетически - структурно-функциональной перестройкой генетического аппарата и завершающийся ее поглощением макрофагами и (или) другими клетками без воспалительной реакции. Как видно из сравнения определений некроза и апоптоза, между двумя видами гибели клетки имеется как сходство, так и существенные различия. Во взрослом организме клеточная гибель необходима для регуляции популяций клеток. Апоптоз составляет основу таких важных процессов, как позитивная и негативная селекция Т- и В-лимфоцитов, гибель лимфоцитов, индуцированная глюкокортикоидами, интерфазная гибель тимоцитов при облучении, гибель при дефиците ростовых факторов. Благодаря апоптозу организм защищен от вирусных инфекций. В свою очередь, многие вирусы содержат гены, кодирующие белки с антиапоптотической активность На биохимическом уровне для апоптоза характерна энзиматическая межнуклеосомная фрагментация ядерной ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 200 - 250, 50 - 70 тысяч пар оснований (т.п.о.), несколько позже 30 - 50 т.п.о. Уже на этой стадии регистрируются конденсация хроматина и выпячивание ядерной мембраны, характерные для апоптоза. При электрофорезе ДНК апоптотических клеток выявляется характерная «лесенка». Этот показатель широко используется для идентификации апоптоза. Анализ электрофореграмм при некрозе, развивающемся как следствие нарушения целостности клетки, свидетельствует о «размазанном» характере зоны миграции ДНК. Наличие «лестницы» при электрофорезе ДНК характеризует процессы: - межнуклеосомной деградации ДНК (Wyllie А. Н., 1987; Уманский М. А., 1996), - появление двунитевых разрывов между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180 - 190 т.п.о., соответствующих протяженности нитей ДНК в нуклеосоме. Именно эти фрагменты выявляются в виде «лестницы» (Carson D. А., 1993; Nishimoto J. et al., 1997; Pan H. et al, 1997; Shugar D. 1997; Wallach D., 1997; Hug H., 1997; Лукьянова H. Ю. и соавт., 2000).
Методы исследований
Определение жизнеспособности клеток. Количество живых клеток в суспензии определяли после их окраски 0,2 % трипановым синим. Подсчет клеток производили в камере Горяева объектив 20 X и окуляр 10 X. Жизнеспособность клеточной суспензии, используемой в эксперименте, составила не менее 98 %. Электронная микроскопия. Ультраструктуру лимфоцитов исследовали на электронограммах полученных на электронном микроскопе ЭМ-125 в лаборатории электронной микроскопии университета. Препараты для электронного микроскопирования готовили по следующей методике: 0,5 мл клеточной суспензии лимфоцитов заливали 2 мл 3 % глутарового альдегида, приготовленным на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4. Фиксацию проводили в пластмассовых пробирках d 0,7 см на холоде с последующим хранением в течение 12 часов t +4 С. По окончании фиксации взвесь центрифугировали до получения плотного осадка при 1740 об/мин в течение 10 мин. Затем удаляли надосадочную жидкость и промывали клеточный осадок в 0,15 М фосфатном буфере рН 7,4 3 раза по 30 мин на холоду. Дофиксировали в 1 % осьмиевой кислоты в течение 1 часа. Отмывали в фосфатном буфере 2 раза по 20 мин. Обезвоживали в спирте с возрастающей концентрацией (50 %, 70 %, 96 %, 100 %), а затем в ацетоне и проводили заливку в эпон-аралдит. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Ultracut и контрастировали уранилацетатом. Гистохимические методы исследования. Выявление нуклеиновых кислот (ДНК И РНК). Нуклеиновые кислоты выявляли по методу Браше. Мазки крови фиксировали в метаноле в течение 20 мин. Затем окрашивали метиловым зеленым и пиронином в течение двух часов. Промывали в дистиллированной воде, высушивали на воздухе. Полученные препараты изучали в световом микроскопе. Выявление нуклеиновых кислот по Берталанффи и Биксу с применением акридинового оранжевого. Мазки окрашивали акридиновым оранжевым в течение 15 мин. Затем удаляли красящий раствор фильтровальной бумагой и промывали мазки забуференным раствором Кребса-Рингера. Исследовали в люминесцентном микроскопе в синем свете. Ядра (ДНК) окрашиваются в зеленый цвет, РНК ядрышек и цитоплазмы в красный цвет. Метод выявления кислой неспецифической эстеразы. Кислую неспецифическую эстеразу выявляли с применением фосфата нафтола AS-B1 (по Беретону). Мазки инкубировали с фосфатом нафтола AS-B1 при температуре 37 С в течение 60 мин. После промывки в проточной воде мазки докрашивали гемалаунолом Майера в течение 1,5 мин. Под микроскопом наблюдали участки, обладающие активностью кислой фосфатазы, окрашенные в красный цвет, а ядра - в синий. Гистохимические препараты проденсиметрированы на денситометре-100, количество нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) выражали в относительных единицах плотности. Иммунологические методы.
Определение Ig Е методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Во все лунки 96 ячеечного планшета вносили по 50 мкл синего ИФА-буфера. Далее быстро вносили в лунки по 50 мкл калибраторов, контроля и исследуемых проб (в двух параллелях). Планшет инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Содержимое лунок удаляли. Планшет трижды отмывали добавляя в каждую лунку по 250 мкл отмывочного буфера. Отмывочный буфер из лунок удаляли насосом. Затем в лунки вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Планшет инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После удаления содержимого из лунок планшет промывали 5 раз, как сказано выше. Далее в лунки быстро вносили по 100 мкл субстрата тетраметилбензидина. Планшет оставляли на 20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 100 мкл 5 % раствора серной кислоты, содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет. Оптическую плотность измеряли на фотометре при длине волны 450 нм. Метод определения циркулирующих иммунных комплексов ЩИК). Концентрацию ЦИК в плазме крови определяли методом Вельбри, Миллеорг (1980). 3,5 % раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) способен осаждать иммунные комплексы средних размеров. Сыворотку разводили в 2 раза боратным буфером (рН ) (проба 1). В опытную пробирку (проба 2) добавляли 2,7 мл 3,5% ПЭГ и 0,3 мл разведенной сыворотки (из пробы 1). Контроль (проба 3) - 2,7 мл боратного буфера и 0,3 мл сыворотки (из пробы 1). Оставляли на один час при комнатной температуре. Учитывали результаты измеряя оптическую плотность при длине волны 450 нм. Определение Р-белков (Кульберг А. Я., 1989). Для определения Р-белков в плазме крови пробы предварительно разводили в 10 раз физиологическим раствором. В планшеты для агглютинации наливали в первую лунку каждого ряда 0,9 мл физраствора, во вторую лунку - 0,4 мл физраствора, во все остальные лунки ряда - по 0,1 мл физраствора. Затем в первую лунку добавляли 0,1 мл плазмы разведенной 1:10, что соответствует разведению проб 1:100. Тщательно перемешивали. 0,1 мл из первой лунки переносили во вторую лунку и тщательно перемешивали. Это разведение 1:500. Приготовляли серию двухкратных разведений исследуемой пробы, начиная с третьей лунки по одиннадцатую включительно, перенося по 0,1 мл. Во все лунки, начиная с третьей, добавляли по 0,1 мл анти-Р-сыворотки в рабочем разведении и по 1 капле 4 % суспензии эритроцитов человека. Тщательно перемешивали и оставляли на 6 - 18 часов при t +4 С. Реакцию учитывали визуально. Титром Р-белка считали последнее разведение исследуемой плазмы, которое дает ингибицию тест-системы. Иммунофлюоресцентные методы. Определение популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов с моноклональными антителами, меченными ФИТЦ. Для определения Т-зрелых лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), Т- киллеров/супрессоров (CD8+), Т-киллеров (CD16+), В-лимфоцитов (CD72+), апоптирующих клеток (CD95+) использовали соответственно моноклональные антитела (МКА) ЛТЗ, ЛТ4, ЛТ8, ЛНК16, 3F3, ИКО-160 (Институт Иммунологии АМН РФ). К 50 мкл суспензии лимфоцитов добавляли 5 мкл тестируемого моноклонального антитела и инкубировали 30 мин при 4С. Затем добавляли 150 мкл раствора Хенкса и центрифугировали 5 мин при 200 g. Удаляли супернатант и ресуспендировали клетки в 50 мкл раствора Хенкса, вносили 150 мкл раствора Хенкса и центрифугиовали 5 мин при 200 g. Удаляли супернатант. К осадку отмытых клеток добавляли 50 мкл Р(аЬ)2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и инкубировали 30 мин при t +4 С. После инкубации клетки дважды отмывали в растворе Хенкса и измеряли их иммунофлуоресценцию на спектрофлуориметре «Signe-4». Длина волны возбуждения ФИТЦ составила 490 нм, интервал регистрации от 500 до 570 нм.
Повышение адаптационных возможностей лимфоцитов под влиянием плазмафереза
В настоящее время плазмаферез занял прочное место в лечении бронхолегочных заболеваний, протекающих особенно тяжело. Это связано с высокой эффективностью, отсутствием серьезных осложнений. Обладая относительной доступностью, плазмаферез может проводиться как стационарно, так и амбулаторно (Рыжко В. В., Городецкий, 1995; Пиксин И. Н. соавт., 1996). Исследования ультраструктуры лимфоцитов уже после первого сеанса плазмафереза выявили некоторые изменения. В ядрах отмечаются зоны эухроматина и гетерохроматина, причем конденсация хроматина происходила в виде мелкогранулярных структур, занимающих практически всю площадь ядра. Протяженные участки оболочки ядра имели расширенное перинуклеарное пространство. Установлены расширение канальцев эндоплазматической сети и комплекса Гольджи, наличие везикул в периферических отделах последнего. На поверхности лимфоцитов образуются цитоплазматические выросты (рис. 10.2.1). При электронно-микроскопическом исследовании лимфоцитов больных после II сеанса плазмафереза выявлены следующие изменения. Микрорельеф клеточной поверхности характеризуется многочисленными, ярко выраженными выростами цитоплазматической мембраны. Ядро четко контурировано, содержит значительные участки перинуклеарно расположенного высококонденсированного хроматина, в центральной части имеются участки эухроматина, с отдельными вкраплениями глыбок конденсированного хроматина. Цитоплазматический матрикс лимфоцитов представлен относительно гомогенным мелкогранулярным материалом. Широкий ободок цитоплазмы включает многочисленные округлой формы митохондрии, некоторые из которых попарно объединены (рис. 10.2.2). После 3-го сеанса плазмафереза у больных хроническим бронхитом активность CD3 увеличилась в 2,2 раза, CD 20 - в 2,7 раза, CD 26 - в 2,3 раза, CD 25 - в 2,75 раза по сравнению со стадией обострения, но не достигала контрольного уровня (см. рис. 10.2.4). У больных пневмонией активность после 3-го сеанса CD3 и CD20 повышается в 3 раза, CD 26 - в 2,8 раза, CD 25 - в 3,7 раза (см. рис. 10.2.5). Полученные нами данные свидетельствуют об эффективности проведенного плазмафереза в лечении бронхолегочных заболеваний, так как из организма часть эндотоксинов удаляется, в результате происходит восстановление активности клеток иммунной системы. По данным П. А. Воробьева с соавт. (1996), несмотря на широкое применение плазмафереза в клинической практике, механизм его терапевтического действия во многом остается непонятным.
Большинство авторов связывают его действие с элиминацией патологических веществ из крови (медиаторы воспаления, бронхоконстриции, циркулирующие иммунные комплексы). Наряду с чисто элиминационным эффектом плазмаферез может оказывать влияние на функцию Т-лимфоцитов, которая, по многим данным, у пациентов с бронхолегочными заболеваниями угнетена и является одним из звеньев патогенеза заболевания. При обсуждении механизмов терапевтического действия плазмафереза при бронхолегочных заболеваниях необходимо учитывать его влияние на гемостаз, улучшение в связи с этим микроциркуляции в легочной ткани (Порядин Г. В. с соавт., 1998). Однако эти результаты не позволяют понять механизм лечебного эффекта плазмафереза, поэтому особый интерес представляет анализ изменений СВ95+-лимфоцитов, поскольку СД95+ служит рецептором, стимуляция которого запускает апоптоз, поэтому увеличение интенсивности свечения клеток, несущих маркер СД95+, под влиянием плазмафереза можно рассматривать как механизм, способствующий включению апоптоза клеток. Так, после трех проведенных сеансов плазмафереза больным БЛЗ (хронический бронхит, острая пневмония, бронхиальная астма) наиболее стойкое снижение показателей эндотоксикоза (СЮ, АО А, МСМ, ЦИК, ИТ по альбумину) наблюдалось во всех группах обследуемых уже после второго сеанса плазмафереза (рис. 10.2.6; 10.2.7; 10.2.8). Согласно результатам исследований С. П. Бякина (1993), отсутствие стабильного детоксикационного эффекта ПФ связано, во-первых, с постоянным наличием воспалительного очага в легких, а во-вторых, с тем, что при плазмаферезе происходит лишь механическое удаление плазмы, богатой токсичными продуктами, клетки же крови возвращаются больному, практически в неизменном виде. Поэтому активность их антиоксидантных систем, видимо остается низкой, а замещение донорской плазмы незначительно увеличивает активность АО-ферментов. Необходимо учесть и удаление при плазмаферезе эндогенных плазменных антиоксидантов из-за отсутствия селективности данного метода. Этим можно объяснить и высокий уровень ПОЛ. По данным Б. Л. Лурье с соавт. (1990) у всех больных уровень средних молекул под влиянием плазмафереза значительно снижался. Косвенным доказательством высокой токсичности средних молекул является тот факт, что снижение уровня средних молекул в большинстве случаев коррелировало с уменьшением общей токсичности. Так, нормализация уровня средних молекул соответствовала снижению токсичности крови на 55 - 60 % . При проведении всего курса детоксикационной терапии содержание МСМ в плазме снижалось у больных хроническим бронхитом на 44,5 %, больных острой пневмонией - 37,0, бронхиальной астмой - на 40,0 % по сравнению с исходным уровнем обострения. Содержание ЦИК снизилось на 18,0 % в плазме крови больных хроническим бронхитом, острой пневмонией и бронхиальной астмой - на 21,0 % (см. рис. 10.2.6; 10.2.7; 10.2.8). Синдром эндогенной интоксикации, неизменно сопровождающий воспалительные заболевания бронхолегочного аппарата, протекает с повышением индекса токсичности по альбумину. После проведения 3-го сеанса плазмафереза ИТ снижался у больных хроническим бронхитом на 32,0 %, острой пневмонией - на 34,5, бронхиальной астмой - на 37,0 % по сравнению с обострением на фоне повышения ОКА и ЭКА в крови. Хотя показатели эндотоксикоза у всех групп больных не доходят до значений контрольного уровня, все же данные результаты являются более положительными по сравнению с группой больных, прошедших базовую терапию. Это говорит о том, что традиционное лечение, даже с включением антибиотиков целенаправленного действия (с учетом состава микрофлоры), многие из которых обладают антиоксидантными действиями, не приводят к стабилизации возросших деструктивных процессов в клетке при течении данных заболеваний. Уровень СРО мембран лимфоцитов больных БЛЗ после I сеанса плазмафереза составил 5,95 ± 0,76 имп/сек, что на 14,5 % ниже стадии обострения. СРО постепенно снижалось к 3 сеансу плазмафереза от 14,5 до 32,0 %, АОА повышалась после 3 сеанса плазмафереза на 77,0 % (рис.10.2.9). После 2-го сеанса плазмафереза ПОЛ митохондрий лимфоцитов больных хроническим бронхитом снизился по отношению к обострению на 55,3 %, острой пневмонией - на 52,0 %. АОА возростала по сравнению с 1-м сеансом незначительно (см. рис. 10.2.10).
Активность СДГ митохондрий выросла на 38,0 % по сравнению со стадией обострения. После окончательного 3-го сеанса ПФ зарегистрировано снижение уровня процессов СЮ в митохондриях лимфоцитов больных бронхитом на 65,0 %, острой пневмонией - на 60,0 %, при этом АОА увеличивалась при хроническом бронхите в 2,2 раза, при острой пневмонии - в 2 раза (см. рис. 10.2.10). Активность СДГ митохондрий увеличилась на 46,0 % по сравнению со стадией обострения, но не достигала контрольных значений. Результаты, полученные при изучении уровня процессов СРО и АОА митохондрий лимфоцитов больных БЛЗ после сеансов ПФ, являются более эффективными, чем после стационарного базисного лечения. Механизмы терапевтического действия ПФ связывают с коррекцией окислительно-восстановительных процессов, воздействием на систему гемостаза, иммунную систему и микроциркуляцию, а также уменьшением степени бронхиальной обструкции. ПФ влияет на функцию Т-лимфоцитов, активность которых восстанавливается в результате деблокирования рецепторов или удаления ингибитора Т-супрессорной активности (Саматолкин А. К., 1996). Как показали наши исследования, изучение динамики элиминации продуктов эндотоксикоза в процессе плазмафереза подтверждают данные об их высокой патологической активности. Применение плазмафереза в комплексе с детоксикационной терапии позволяет быстро снизить токсичность крови путем активного удаления из внутренних сред организма широкого спектра токсических метаболитов и, в частности, наиболее биологически активных из них - МСМ сыворотки крови. Таким образом, включение плазмафереза в комплексную программу лечения больных БЛЗ приводил к купированию явлений эндотоксикоза и нормализации показателей гомеостаза. Наиболее выраженный детоксикационный эффект плазмафереза наблюдался не на следующий день после перфузии, а после 2-3 сеансов. Вероятно, это происходит за счет улучшения функционирования естественных детоксицирующих систем организма больного, и прежде всего печени, что влечет за собой повышение адаптационных процессов в иммунной системе.
