Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ NAC1 17
1.1. Влияние засоления на рост и развитие растений 17
1.2. Влияние засоления на анатомо-морфологическую структуру растений 21
1.3. Изменение водно-солевого обмена растений при засолении почв 25
1.4. Влияние засоление на показатели фотосинтетической активности растений 31
1.5. Изменение интенсивности дыхания растений в условиях засоления почвы NaCl 39
1.6. Содержание пролина 46
1.7. Изменение содержания Сахаров в условиях засоления NaCl 54
1.8. Продуктивность и структура урожая 56
ГЛАВА 2. РОЛЬ ФИТОГОРМОНОВ В РЕГУЛЯЦИИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ДЕЙСТВИЮ СТРЕСС-ФАКТОРОВ 58
2.1. Роль фитогормонов в регуляции засухоустойчивости растений 60
2.2. Изменение содержания фитогормонов у растений в условиях избытка влаги. Роль гормонов в повышении устойчивости растений к затоплению 82
2.3. Содержание гормонов и их роль в регуляции устойчивости растений к действию стрессовых температур 86
2.4. Изменение содержания фитогормонов и их роль в адаптации растений к засолению 95
ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 103
ГЛАВА 4. ДИНАМИКА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ NAC1 110
4.1. Влияние различного уровня засоления NaCl на динамику фитогормонов 110
4.2. Особенности водообмена пшеницы в условиях засоления NaCl 125
4.3. Влияние различного уровня засоления NaCl на показатели фотосинтетической активности пшеницы 131
4.4. Влияние засоления NaCl на процесс дыхания пшеницы 142
4.5. Изменение содержания пролина в условиях засоления NaCl 147
4.6. Влияние различного уровня засоления NaCl на рост и продуктивность растений пшеницы 149
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ ФИТОГОРМОНАМИ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ NAC1 164
5.1. Особенности обработки 6-БАП и АБК на гормональный статус при различном уровне засоления 164
5.2. Изменение водообмена пшеницы в связи с обработкой гормонами при действии засоления NaCl 178
5.3. Влияние засоления NaCl и обработки гормонами при их совместном применении на процесс фотосинтеза 187
5.4. Влияние обработки гормонами на интенсивность дыхания пшеницы в условиях засоления NaCl 197
5.5. Изменение содержания пролина в условиях засоления NaCl и экзогенной обработки гормонами 206
ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ ГОРМОНАМИ НА РОСТ И ПРОДУКТИВНОСТЬ ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ NAC1 211
6.1. Влияние обработки 6-БАП на темпы роста и продуктивность пшеницы при различном уровне засоления NaCl 211
6.2. Влияние обработки АБК рост и продуктивность пшеницы в условиях различного засоления почвы NaCl 221
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 228
ВЫВОДЫ 233
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 235
ПРИЛОЖЕНИЕ 276
- Влияние засоления на рост и развитие растений
- Роль фитогормонов в регуляции засухоустойчивости растений
- ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Факторы среды могут существенно влиять на интенсивность и характер протекания биолого-физиологических процессов. Живой организм является открытой системой, которая, взаимодействуя с определённой средой, осуществляет постоянный процесс функционирования (Грин, 1996). Активная реакция живой системы на экстремальный фактор обеспечивается процессами регуляции разнообразной степени сложности, сформировавшимися в процессе эволюции. Вместе с тем, зависимость от среды имеет противоречивый характер (Дажо, 1975; Риклефс, 1979). В ряде работ убедительно показано, что у растений под действием различных неблагоприятных факторов, как правило, развивается особое состояние - фитостресс (Генкель, 1979; Пахомова, 1995).
С точки зрения сельскохозяйственной экологии, конечным результатом переживания того или иного стрессового фактора является изменение продуктивности растений (Удовенко, 1993; Андрианова, Тарчевский, 2001). Предполагается, что неблагоприятные внешние условия могут вызывать потери, составляющие более 65% от оптимального урожая (Строганов, 1953; Саркеридр., 1999).
К важнейшим стресс-факторам, лимитирующим рост и продуктивность растений, относится засоление (Строганов, 1953; Шевякова, 1980; Кузнецов Вл. и др., 1999; Кун и др., 2001).
Актуальность исследования экологической устойчивости растений в условиях засоления обусловлена наличием на территории России площадей с большим содержанием солей (Приложение рис. 1, 2; табл. 6).
В литературе накоплено немало сведений об изменении физиологических параметров у растений в условиях засоления (Келлер, 1923; Генкель, 1954;
Шахов, 1956; Строганов, 1949, 1958; Шевякова, 1983; Журба, 1986; Кузнецов и др., 1992; Филатова, 1993; Ларина, 1994; Таланова и др., 2001; Рамазанова, 2005).
В большинстве случаев исследования физиологической реакции растений в условиях засоления касались приспособленных к солевому стрессу видов и культур, таких, как хлопчатник (Строганов, 1958), рис (Журба, 1986), кукуруза (Ларина, 1994). Между тем, широкое распространение условий засоления заставляет обращать внимание и на реакцию растений, более широко используемых в сельскохозяйственном производстве, в частности пшеницу.
Нельзя не отметить, что в процессе онтогенеза физиологический ответ растительных организмов на условия среды значительно варьирует, таким образом, весьма важным является изучение физиологических изменений на одном и том же объекте на протяжении всей вегетации.
Имеются данные, согласно которым реакция различных показателей при стрессе опосредована изменению в содержании гормонов (Тарасов, 1983; Кузнецов В. и др., 1992; Филатова, 1993; Бахтенко и др., 2001; Бахтенко, Платонов, 2004; Zeisler et al., 2001). Одной из проблем при изучении гормональной системы в процессах адаптации остаётся исследование возможностей корректировки гормонального баланса для повышения толерантности растений. Несмотря на ряд публикаций, указывающих на роль таких фитогормонов, как цитокинин и абсцизовая кислота, в повышении устойчивости растений к засухе (Кузнецов В. и др., 1992; Бахтенко и др., 2001; Пустовойтова, 2003), избытку влаги (Бахтенко, Платонов, 2004), действию стрессовых температур (Тарасов, 1983; Четверикова, 1999), в отношении солевого стресса данных практически нет.
Большинство исследований не связывали также влияние засоления на водный обмен, содержание ионов с изменением гормонального статуса.
Не всегда также действие гормонов сопоставляется с другими защитно-приспособительными механизмами, в частности синтезом осмолитов. Такие центральные процессы энергетического обмена, как фотосинтез и дыхание, изучались лишь в отдельных случаях на проростках (Кун и др., 2001). Между тем, изучение этих вопросов вносит вклад в проблему агроэкологии и представляет практический интерес.
Целью работы служило выяснение характера физиологической ответной реакции двух сортов пшеницы (сорт МИС и сорт Приокская) в онтогенезе при засолении NaCl и их роль в адаптации растений. Особое внимание, в этой связи, уделялось фитогормонам.
В соответствии с поставленной целью решались следующие экспериментальные задачи:
1. Сравнительная агроэкологическая характеристика комплекса
физиологических показателей при выращивании пшеницы в
условиях засоления. В качестве параметров были выбраны:
содержание и соотношение гормонов энергетический обмен (фотосинтез и дыхание) водный режим
содержание осмолитов (пролин) интенсивность ростовых процессов
Оценка толерантности сортов пшеницы к NaCl по показателю продуктивности.
Проанализировать взаимосвязь между изменениями в содержании и соотношении фитогормонов и физиологическими параметрами при действии засоления NaCl.
Исследовать характер действия фитогормонов при их экзогенном внесении во взаимосвязи с процессами адаптации к условиям засоления.
Научная новизна работы. Проведено комплексное изучение изменения содержания цитокининов, ИУК и АБК, показателей водного и энергетического обменов, пролина, темпов роста в онтогенезе пшеницы при засолении почвы NaCl.
Исследования показали, что гормональный баланс органов пшеницы на всём протяжении онтогенеза под действием засоления NaCl претерпевает значительные изменения: уменьшается содержание цитокининов и ауксинов, увеличивается уровень АБК, в результате отношение 3-ЗР+ИУК/АБК падает.
Указанные изменения гормонального баланса являются не только результатом стрессового ответа, но и имеют приспособительное адаптивное значение.
Проведённые исследования позволили выяснить взаимосвязь между изменениями гормонального баланса и энергетическими процессами (фотосинтезом и дыханием).
Определена роль пролина как показателя солевой нагрузки.
Выявлена сортоспецифичность яровой пшеницы к засолению NaCl и экзогенному внесению гормонов.
Показано различие в механизме защитного действия 6-БАП и АБК.
Практическая значимость. Проведённые исследования вносят определённый вклад в понимание роли гормонального баланса в адаптации растений к засолению почвы NaCl. Найдены подходы к корректировки гормонального баланса, с помощью которых можно повысить толерантность пшеницы. Представляется возможным использование анализа эндогенного содержания гормонов и их баланса в качестве теста в селекционной работе.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на научно-практической конференции МГОУ (2004), Ш международной научной конференции (Минск, 2003), X международной конференции
студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), годичном собрании общества физиологов растений России и Международной научной конференции «Проблемы физиологии растений севера» (Петрозаводск, 2004); VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2005), VII съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Структура и объём диссертации. Работа изложена на 283 страницах машинописного текста. Содержит 65 таблиц, 53 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части (4 главы), заключения, выводов и приложения. Список использованной литературы включает 382 наименования, из них 109 на иностранном языке.
СТРЕСС. АДАПТАЦИЯ К СТРЕССУ.
Растения в процессе роста и развития часто испытывают воздействие неблагоприятных факторов внешней среды, которые, в свою очередь, могут существенно влиять на характер и интенсивность протекания биологических процессов.
Устойчивость физиологических функций обусловлена способностью растительных организмов сохранять относительно стабильное состояние при изменяющихся условиях внешней среды (гоместаз).
В ряде работ убедительно показано, что у растений под действием различных неблагоприятных факторов, как правило, развивается особое состояние - фитостресс (Генкель, 1979; Урманцев, Гудков, 1986; Пахомова, 1995).
Проблема стресса, несмотря на длительную историю своего существования, продолжает оставаться актуальной темой. Об этом свидетельствует количество публикаций и обзоров (Шилов, 1984; Веселовский и др., 1993; Веселова и др., 1993; Пахомова, 1995; Удовенко, 1995; Пронина, 2000). В последние годы получен важный фактический материал, позволяющий скорректировать и развить некоторые ранее сделанные выводы. Большое внимание уделяется изучению факторов, вызывающих стресс и способам их устранения. Активно исследуются механизмы развития стресс-реакции и адаптации.
Для фитофизиологии эти проблемы являются особенно актуальным, так как теория стресса у растений находится еще в стадии становления (Пахомова, 1995). Некоторые авторы вообще считают неоправданным приложение концепции стресса к растениям, как и к низшим животным, не имеющим нервной системы (Шилов, 1984).
Понимание этих вопросов играет существенную роль для решения эколого-физиологических проблем, являющихся приоритетными для физиологии растений (Курсанов, 1997; Мокроносов, 2000).
В настоящее время как отечественная, так и зарубежная литература изобилует большим количеством различных наименований стрессов: климатический, физиологический, водный, солевой, осмотический, температурный и др. Так, по Grime (1979) стрессы - это факторы, снижающие скорость роста и продуктивность растений, но не повреждающие их непосредственно. При этом понятие стресс отождествляется с фактором (Удовенко, 1979). Можно подумать, что существует множество различных стрессов. На самом деле в, данных случаях этими терминами явно подменяются сами воздействия, т.е. факторы, вызывающие стресс. Сам Селье называет действующие на организм внешние факторы "стрессорами", стресс же он рассматривает как состояние организма, формирующееся в ответ на их воздействие: "Общее свойство разнообразных агентов, в силу которого все они вызывают стандартную реакцию, названо было стрессорным эффектом, а состояние, вызываемое ими в организме, — стрессом" (Селье, 1960. С. 162). При этом комплекс реакций стрессорные воздействия можно назвать патологическим лишь при некоторых условиях, в принципе же эти реакции имеют адаптивное значение и поэтому были названы Селье "общим адаптационным синдромом". В более поздних работах он объединяет термины "стресс" и "общий адаптационный синдром" и употребляет как синонимы: "Стресс есть неспецифический ответ организма на любое предъявленное ему требование" (Селье, 1982. С.27). Поэтому правильнее говорить: "температурный стрессор" (а не стресс), "осмотический стрессор" и т.д.
Другие авторы акцентируют на биологическом значении стресса в жизни организма (Соловьян, 1990). Под стрессом понимают процесс мобили-
зации защитных сил организма, т.е. начальный этап управления приспособительными процессами, рассматривая стресс как механизм развертывания общей адаптации для осуществляющихся специфических функций.
Но наиболее оправдан по нашему мнению взгляд на стресс как на физиологическое состояние (Веселова и др., 1993; Веселовский и др., 1993; Веселое, 2001). По мнению В.А. Веселовского с соавт. (1993) стресс является новым дискретным функциональным состоянием повышенной резистентности, в которое клетка переходит при определенном пороговом воздействии раздражителя. Следовательно, значение стресса заключается в том, что это состояние является формой преодоления живой системой экстремальных условий. И на наш взгляд, именно такой подход к пониманию стресса дает основу для дальнейших физиологических исследований. Это определение основывается на представлении о клетке как биологическом триггере, что предусматривает возможность наличия нескольких устойчивых состояний. Их количество невелико: нормальное состояние (поведение клетки контролируется гомеостатическими механизмами); защитное состояние, отличающееся повышенной резистентностью и пониженным метаболизмом (стресс); летальное (мертвое) состояние. Переход (переключение) триггерной системы из одного устойчивого состояния в другое происходит через неустойчивое состояние (бифуркационную точку), для которого характерна повышенная вариабельность (Веселова и др., 1990). Таким образом, нарушение гомеостаза является не предпосылкой обязательной гибели клетки, а условием для перехода в новое устойчивое состояние - стресс (Веселовский, 1992; Веселова и др., 1990,1993; Веселовский и др., 1993).
В экспериментах по изучению стресс-реакций растения, как правило, подвергают воздействию факторов либо неестественных, к которым организм не имеет специфических адаптации (например, действие кислот,
щелочей и пр.), либо выраженных в завышенных дозах (действие экстремальных температур, высоких концентраций солей и т. п.). В естественных условиях внезапное действие таких "запредельных" факторов — явление относительно редкое. В большинстве случаев колебания силы естественных факторов укладываются в диапазон эффективного действия адаптивных механизмов.
Общая картина адаптации к воздействию факторов, резко уклоняющихся от нормы, лучше всего описывается концепцией "двух уровней адаптации" (Корниенко и др., 1965; Шилов, 1977).
Взгляды Веселовского В.А. развивают термодинамический подход к характеристике живых организмов (Озернюк и др., 1971; Зотин, 1980, 1988), согласно которому существует два вида состояний: стационарное и конечное, к которому живая система приближается. Процесс уклонения или приближения к конечному стационарному состоянию называют конститутивным, а временное уклонение или приближение к текущему стационарному состоянию после воздействия факторов — индуцибилъным. Индуцибильное уклонение организма может сопровождаться переходом системы в новое стационарное состояние без возвращения на каком-то участке времени к исходному. Можно называть такой процесс индуцибилъно адаптивным Переход живой системы после уклонения к прежнему состоянию называется индуцибилъно импульсным.
Таким образом, можно согласиться с тем, что стресс-реакция может рассматриваться как экстренная мобилизация адаптационного потенциала, облегчающая временное переживание "неожиданных" воздействий и имеющая в связи с этим адаптивное значение. Собственно стрессом как физиологическим состоянием следует считать только первый этап адаптационного синдрома - фазу раздражения (реакции). В эту фазу протекают как адаптивные, так и дестабилизирующие процессы, и результат их наложения и составляет суть стрессорных реакций. Эта
стадия предшествует следующей (адаптации в узком значении этого слова), в ходе которой преобладают приспособительные реакции. Каждая фаза характеризуется определенными биохимическими и физиологическими процессами, которые осуществляют мобилизацию и адаптацию стрессируемого организма. Истинно стрессорные реакции преобладают лишь на стадии тревоги. Стадия истощения - это патологическое состояние, которое приводит к гибели организма.
Характер ответа растения на различные факторы включают в себя как неспецифические реакции (синтез стрессовых белков; изменение напряженности энергетического обмена, гидролитических процессов; накопление протекторных соединений; изменения в гормональной системе и др.), возникающие при действии любых неблагоприятных условий. Так и специфические реакции, зависящие от особенностей воздействия.
Адаптивный потенциал каждого вида растений, который рассматривается в настоящее время как "...функция генетических программ онтогенетической и филогенетической адаптации в их взаимодействии" (Жученко, 1988), является специфичным. Но, несмотря на большое разнообразие приспособительных реакций, сформировавшихся в процессе эволюции цветковых растений, отмечается универсальность механизмов адаптации, проявляющаяся на разных уровнях организации живого (Любименко, 1923; Генкель, 1982; Хочачка, Сомеро Дж, 1988).
В системе Раменского - Грайма (Раменский, 1935; Grime, 1979; Работнов, 1980; Миркин, 1983) выделено три основных типа первичных экологических "стратегий" у растений, представители которых различаются общими условиями обитания и устойчивостью к экологическому стрессу: конкуренты, рудералы (г) и стресс-толеранты (s). Помимо указанных. Grime (Grime, 1979) выделил несколько вторичных экологических "стратегий", сочетающих в себе разные типы первичных.
Исходя из того, что регуляция и координация основных функций растений (рост, развитие, фотосинтез, транспорт ассимилятов, водообмен и др.) находятся под гормональным контролем (Кулаева, 1973; Мокроносов, 1981; Дерфлинг, 1985; Чайлахян, 1988; Кефели и др., 1989), можно предположить, что виды с разными типами экологических «стратегий» характеризуются также определенными особенностями гормонального статуса. Такое предположение вытекает еще и из того, что при разнообразных стрессах происходит изменение гормонального баланса растений и установлена роль фитогормонов в адаптации и проявлении специфической стресс-устойчивости (Кефели и др., 1989; Пустовойтова, 1981; Кузнецов и др., 1992; Четверикова, 1999; Борзенкова, 2001).
К важнейшим факторам, лимитирующим продуктивность сельскохозяйственных растений, относят недостаток и избыток воды, высокие и низкие температуры, а также высокую концентрацию солей в почве.
Засоленные почвы - группа почв, характеризующаяся наличием легкорастворимых солей в количестве, ухудшающим их плодородие и отрицательно влияющем на рост развитие растений (Панкова, Новикова, 1995). Засоление почвы - распространенное явление, которое отрицательно сказывается на росте и урожайности растений. В настоящее время около 18% всех посевных площадей в России засолены (Приложение рис. 1, 2, табл. 6) (Панкова, Новикова, 1995). Главным диагностическим показателем засоленных почв принято считать наличие хотя бы в одном горизонте почвенного профиля до глубины 2 м легкорастворимых солей в количествах, превышающих принятый порог токсичности для слабо - и среднесолестойких культур. (Панкова, Новикова, 1995). По сумме солей пороги токсичности для почв хлоридно-и сульфатно-хлоридного засоления составляют 0,1 %, для почв сульфатно-
натриевого засоления - 0,15 %, для почв сульфатного засоления с участием гипса - 1,0 %; для щелочного ряда - 0,1 % (Ковда и др., 1960; Ковда, 1968). Засоленные почвы на территории России широко распространены и занимают 3926,0 тыс. га (Панкова, Новикова, 1995).
Устойчивость к действию стресс-фактора имеет комплексную природу и включает в себя механизмы избегания и толерантности. Толерантность в условиях засоления выражается в способности выдерживать токсические и осмотические эффекты ионов соли в цитоплазме (Головко, 1999). При этом действие солей на растительный организм двойственно. С одной стороны, засоление понижает водный потенциал и тем самым вызывает развитие водного дефицита, а с другой стороны - солевой стресс сопровождается токсическим воздействием избыточного содержания ионов на клеточный метаболизм (Строганов, 1953; Захарин, 1986; Кузнецов Вл., 1999).
Растения по их отношению к засоленности почвы разделяют на 2
основные группы: галофиты и гликофиты. Согласно определению
П. А. Генкеля (1954), «галофитами называются растения засоленных
местообитаний, легко приспосабливающиеся в процессе своего онтогенеза
к высокому содержанию солей в почве благодаря наличию признаков и
свойств, возникших в процессе эволюции под влиянием условий
существования». Соленепроницаемые галофиты при засолении
испытывают только водный (осмотический) стресс, а соленакапливающие галофиты, наоборот, только солевой (Захарин, 1986). К гликофитам относят растения пресных местобитаний, обладающие сравнительно ограниченной способностью приспосабливаться к засолению в процессе индивидуального развития (Генкель, 1954). Гликофиты испытывают при засолении одновременно водный и солевой стресс в различных сочетаниях (Захарин, 1986).
Вопросы физиологического состояния растений в условиях засоления рассмотрены в ряде классических работ: в монографиях Шахова А. А. «Солеустойчивость растений», 1956; Строганова Б. П. «Физиология солеустойчивости хлопчатника», 1949; Строганова Б. П. «Растения и засоленные почвы», 1958; Генкеля П. А. «Солеустойчивость растений и пути ее направленного повышения», 1954; Келлера Б. А. «Экология растений и борьба земледелия с засолением почв и засухой», 1923.
В данном разделе изложены современные представления о влиянии засоления на физиологические параметры растительных организмов.
Влияние засоления на рост и развитие растений
Действие солей на растение проявляется с самых ранних ступеней его развития. Период прорастания семян и получения всходов является одним из самых чувствительных к воздействию почвенного засоления (Тур и др., 1979; Тур и др., 1981; Асамов, 1986, Петров, Попов, 1986; Асалиев, 1986; Саркер, 1999; Безрукова и др., 2002; Кильдибекова, 2004; Вечникова, 2004).
В литературе встречаются несколько противоречивые данные по влиянию солевого стресса на прорастание семян. В ряде работ показано стимулирующее действие NaCl на энергию прорастания и лабораторную всхожесть. Так, при концентрации 50 мМ NaCl энергия прорастания семян яровой пшеницы составила 104,5% к контролю, тогда как лабораторная всхожесть - 102,9% соответственно (Холодова и др., 2001). Сходные данные были получены Асамовым Д. К. (1986) на хлопчатнике. Показано, что NaCl в концентрации 1,0 атм. не только стимулирует прорастание хлопчатника, но и усиливает превращение запасных соединений (Асамов, 1986). Вместе с тем, немало данных об ингибирующем действии солей на всхожесть семян (Журба, Воробьев, 1986; Якимов, Новак, 1986; Усманов, Мартынов, 1986; Титова, 1986; Луценко, Федюкина, 1986; Захарин, 1986; Белянская и др., 1991; Захарин, 2002). Так, при прорастании семян риса показано уменьшение поглощения воды зародышами (в 2 раза), что, в свою очередь, приводит к снижению прорастания и всхожести семян (Удовенко, Алексеева, 1972; Удовенко, Журба, 1983). Важно отметить, что при изучении влияния солевого стресса на растительные организмы немалое значение имеет концентрация соли в почвенном растворе. Достоверно показано различия в реакции растения на концентрационную составляющую солевого стресса. Так, если при концентрации 1% NaCl всхожесть семян риса составила 100%, то увеличение концентрации вызывало снижение энергии прорастания на 60-70% (Белянская и др., 1991). Сходные данные были получены на пшенице (Саркер, 1999), хлопчатнике (Асамов, 1986).
В литературе показана сортоспецифичность в реакции риса на засоление: сорта, обладающие большей солеустойчивостью, способны сохранять всхожесть при значительных концентрациях солей. Так, Белянская С.Л. с сотр. (1991) отмечает, что более солеустойчивый сорт риса Альтаир при концентрации 1,8% NaCl (критическая концентрация для риса - 1,0% NaCl) сохраняет энергию проростання на уровне 30-40%) к контролю, тогда как сорт Союзный не прорастал вовсе.
Немаловажным является также разнокачественность засоления. Так, Асамовым Д. К. (1984) достоверно показано более губительное действие сернокислого натрия по сравнению с хлористым. Наряду с этим выявлено, что активность липазы, протеазы и фитазы у прорастающих семян хлопчатника при действии низкоосмотических концентраций хлорида и сульфата натрия (2,5 и 4,0 атм) значительно снижается (Асамов, 1986).
Ряд авторов (Тур и др., 1981; Алешин и др., 1986; Крогулевич, 1986; Шоррин, Леонтье, 1986; Холодова, 2001) связывают снижение ростовых процессов с необходимой затратой генерируемой энергии на процессы детоксикации поглощенных солей. Важную роль в поглощении ионов солей клетками растений играет проницаемость мембран и ее регуляция (Балконин, Строганов, 1986), что в свою очередь, зависит от состояния липидного комплекса клеток (Zarrouk, Cherif, 1984). Алешин Е.П. с сотр. (1987) показал, что у устойчивых сортов риса в условиях засоления доля ненасыщенных жирных кислот повышается (до 80%), тогда как у неустойчивых практически не изменяется. В связи с тем, что липиды главным образом входят в состав мембран, увеличение ненасыщенности у устойчивых сортов ведет к большей лабильности мембранных структур, регулирующих ионный гомеостаз (Журба, Воробьев, 1986).
Как известно, наиболее общей ответной реакцией культурных растений на засоление является угнетение ростовых процессов. (Строганов, 1986; Лапина и др., 1991; Даскагнок и др., 1992; Костюк и др., 1994; Шевякова, Королевски, 1994; Dolgykh et al., 1992). Так, в исследованиях по динамике побегообразования в условиях засоления NaCl у риса показано торможение процесса кущения, отмечается угнетение образования боковых побегов по сравнению с контролем (Алешин и др., 1987). Сходные изменения показаны у ячменя (Леонова, 1986), бобов (Захарин и др., 1982), пырее (Титова, 1986), пшенице (Кун и др., 2001). Важно отметить, что в литературе есть указания на стимулирующий эффект умеренных концентраций соли. Так, в опытах Холодовой В. П. с сотр. (2001) достоверно показана активация роста проростков пшеницы при низких концентрациях соли.
Роль фитогормонов в регуляции засухоустойчивости растений
Одной из первых основных защитных реакций растений на слабый водный стресс является остановка роста надземных органов и снижение интенсивности синтетических процессов. Это именно защитная реакция, поскольку полная остановка роста наблюдается при потере 6—10% воды, когда ни о каком повреждении не может быть речи (Wright, 1978). По мнению ряда авторов (Мелехов, 1983), остановка роста вызывается сдвигом гормонального баланса, в первую очередь увеличением содержания АБК. Мелехов Е.И. (Мелехов, 1983) развивает представление об универсальной защитной реакции клетки на повреждение, выражающейся в торможении метаболизма. По его представлению, повреждение является своего рода метаболическим процессом, развивающимся за счет метаболической энергии клетки. Торможение метаболизма снижает скорость развития повреждения и позволяет растению таким образом пережить стрессовую ситуацию с наименьшими потерями. Поэтому накопление АБК, этилена и других ингибиторов роста в условиях стресса является одним из проявлений защитной реакции торможения метаболизма. Другие авторы, разделяющие ту же точку зрения, рассматривают защитную реакцию растений не только в повышении уровня ингибиторов, но и в одновременном снижении уровня стимуляторов биосинтетических процессов цитокининов, гиббереллинов, ауксинов (Itai, Ben-Zioni, 1976). В последнее время АБК привлекает к себе наибольшее внимание исследователей в связи с проблемой гормональной регуляции засухоустойчивости растений (Wright, 1978). Интерес к АБК возник после работ Wright и Hiron (Wright, 1978), обнаруживших резкое увеличение содержания АБК в отделенных листьях пшеницы под влиянием водного дефицита. Впоследствии увеличение содержания АБК в процессе завядания листьев было обнаружено у 70 видов растений. Затем аналогичное явление было установлено для листьев интактных растений (Wright, 1978). Для ряда видов был найден пороговый водный потенциал, который является триггером ускоренного биосинтеза АБК, его величина связана с засухоустойчивостью вида. Например, для пшеницы водный дефицит, соответствующий аккумуляции АБК, составляет около 9% (—10...—12 бар), для кукурузы около 10% (—16 бар) (Wright, 1978). По данным Пустовойтовой Т.Н. (Пустовойтова и др., 2000), содержание АБК в срезанных побегах бобов, клещевины, пшеницы и конопли возрастало в несколько раз при потере воды, равной соответственно 2,9, 5,7, 4,3 и 4% от исходного веса. При завядании содержание АБК в листьях некоторых видов увеличивается в несколько десятков раз.
Davies и Mansfield (Davies, Mansfield, 1983) развивают представление о том, что не снижение водного потенциала, а снижение тургора — та первичная реакция, которая является сигналом для синтеза АБК. Установлено, что реакция растений на наступление засухи и на обработку экзогенной АБК в основных чертах совпадает: это снижение проводимости устьиц, торможение роста и уменьшение площади листьев, ускорение колошения и цветения, уменьшение числа колосков в колосе. Отсюда многие авторы делают вывод, что воздействие засухи на растение опосредовано действием АБК, т. е. АБК регулирует реакцию растений на засуху (Quarrie, Jones, 1977; Титова и др., 1986).
В связи с этим возник вопрос о связи между устойчивостью растений и аккумуляцией АБК в условиях стресса. Для ряда сортов сорго и кукурузы была установлена положительная корреляция между засухоустойчивостью способностью синтезировать АБК при наступлении засухи (Пустовойтова, 1978; Косаковская, Майдебурга, 1990; Белынская и др., 1994; Барзенкова и др., 1995; Чернядыв, 1995; Soto et al., 1987; Hahi et al., 1982). Но в отношении яровой пшеницы Quarrie (Quarrie, 1978), который исследовал 50 сортов, пришел к обратным выводам: более устойчивые сорта накапливают в листьях при дегидратации меньшее количество АБК. У риса также не обнаружено прямой связи между устойчивостью сорта и накоплением АБК в листьях (Чумаковский, 1986).
Объекты и методы исследования
Определение содержания фитогормонов проводили методом иммуноферментного анализа (Кудоярова и др., 1990). Количество свободных форм цитокининов (зеатина), индолилуксусной кислоты (ИУК), абсцизовой кислоты (АБК) определяли из одной навески растительного материала.
Экстракция. Навеску растительного материала фиксировали и экстрагировали 80 % этанолом в соотношении 1:10 в течение двух недель на холоде. Спиртовой экстракт центрифугировали и упаривали под вакуумом при 40С до водного остатка. Водный остаток подкисляли 4н НС1 до рН = 3 и трижды экстрагировали диэтиловым эфиром (2:1). Водную фазу использовали для дальнейшей экстракции цитокининов, а эфирную - индолилуксусной и абсцизовой кислот. Водный остаток подщелачивали 5 % NaHC03 до рН = 8 и экстрагировали бутанолом в соотношении 2:1 в течение 16 часов. Объединенную бутанольную фракцию, содержащую цитокинины, упаривали досуха. Из эфирной фракции ИУК и АБК реэкстрагировали 1% NaHC03. Эфирную фазу отбрасывали, а из водной после подкисления 4н НС1 до рН = 3 трижды извлекали индолилуксусную и абсцизовую кислоты диэтиловым эфиром в соотношении 3:1. Объединенную эфирную фракцию, содержащую свободные формы ИУК и АБК, метилировали диазометаном и упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 1 мл 96 % этанола. Твердофазный иммуноферментный анализ проводили в лунках полистиролового планшета (фирма «Linbra», США), используя сыворотки против зеатина, ИУК и АБК (НПО «Башинвест», УФА). На первом этапе коньюгант гормона сорбировали на твердой фазе в течение 20 часов при 4С. После трехкратной промывки физиологическим раствором, содержащим 0,05% твина-20, в лунки вносили антисыворотку к гормону, разведенную физиологическим раствором, содержащим 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% твина-20 и добавляли растворы стандарта гормона или количества веществ, иммунореактивность которых необходимо было оценить. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37С количество антител, специфически связанных на планшете, оценивали с помощью бараньих антител против иммунноглобулинов кролика, меченных пероксидазой. Количество иммунносорбированных антител определяли по пожелтению субстрата (0,4 мг/л ортофенилендиамина в 0,06 М фосфатном буфере рН=5,3, содержащем 0,006% перекиси водорода). Оптическую плотность раствора после фиксации 4н серной кислотой измеряли на «Specord М40». Количество фитогормонов в растительном экстракте определяли по калибровочной кривой. В качестве стандарта использовали известные количества метилированных АБК и ИУК ("Serva", США) и зеатина ("Serva", США). Содержание фитогормонов выражали в нг/г сухой массы-Иммуноанализ проводили в 2-х кратной биологической и 3-х кратной химических повторностях.
Определение содержания углеводов (Roe, Epsnein, 1949; Hynarimen, 1962). Экстракция. Экстракцию углеводов из растительного материала проводили 3 раза 80 % этанолом. После испарения спирта осадок смывали дистиллированной водой.
Определение содержания сахарозы. 0,5 мл водного экстракта кипятили на водяной бане с 0,05 мл 5 М раствора NaOH. После охлаждения добавляли 0,5 мл резорцинового реактива и 3,5 мл 30 % НС1 прогревали на водяной бане и после охлаждения измеряли оптическую плотность исследуемого раствора при X = 520 нм.
Определение содержания фруктозы. К 0,5 мл водного экстракта добавляли 0,5 мл резорцинового реактива и 3,5 мл 30 % НС1 прогревали на водяной бане и после охлаждения измеряли оптическую плотность исследуемого раствора при "к = 520 нм.
Количественно содержание углеводов определяли по калибровочной кривой, для построения которой готовили стандартные растворы углеводов.
