Введение к работе
Актуальность исследования. В Красноярском крае более 80 % лесного фонда (около 61,3 млн га) представлено хвойными бореальными лесами. Составляя основу лесосырьевой базы, эти леса выполняют важнейшие экологические и биосферные функции. В условиях Сибири главным абиотическим фактором, отрицательно влияющим на метаболизм растения, являются зимние температуры. Неслучайно для многих отраслей экономики РФ, несущих потери в холодные годы, актуален вопрос низкотемпературной устойчивости древесных видов. Дополнительную остроту вопросу придают возрастающие в последние годы темпы вырубки лесов не только в Красноярском крае, но и в других регионах Восточной Сибири и на Дальнем Востоке. Проблема приобретает особое природно-эколо-гическое значение, поскольку способность вида адаптироваться к низкотемпературному стрессу в конечном итоге определяет его ареал и возможность интродукции. Для успешной селекционной работы важно развивать фундаментальные исследования ответных реакций морозоустойчивых лесообразующих видов на низкие температуры, выявлять те свойства, которые позволяют им выживать зимой, устанавливать пределы толерантности.
Повышенной чувствительностью к морозам обладают меристематические ткани почек деревьев и кустарников. Очевидно, что структурные и химические превращения в меристемах при действии низких температур в первую очередь направлены на такое изменение содержания и состояния внутриклеточной воды, при котором ее фазовые переходы становятся относительно безопасны (или невозможны). Механизмы низкотемпературного поведения воды в почках хвойных разной морфологии существенно отличаются. У лиственницы, ели, пихты - внеорганное льдообразование, а у сосны и кедра - внеклеточное (Миронов, 2002). Предполагается, что при этом в меристематических тканях почек происходят и различные структурно-химические трансформации, приводящие к состоянию низкотемпературной устойчивости. В то же время, исследованию природы низкотемпературной устойчивости меристем почек (зачаточных тканей хвои и побегов) наиболее морозостойких представителей растительного мира до сих пор должного внимания не уделялось.
Цель работы. Выяснение закономерностей сезонных структурно-химических изменений меристематических тканей почек лиственницы, ели, пихты, сосны и кедра в экологических условиях Сибири, а также механизмов, объясняющих сохранение жизнеспособности меристем при воздействии низких зимних температур.
Основные задачи:
1 Изучить состав и закономерности сезонной динамики содержания в меристемах
водорастворимых веществ цитоплазмы (белков, углеводов, свободных аминокислот),
нерастворимых компонентов клеток (комплекса клеточных стенок и мембран), а также
липидов и их индивидуальных групп (нейтральных, глико-, фосфолипидов).
2 Выяснить закономерности сезонных структурно-химических изменений
клеточных мембран (содержание, фракционный и аминокислотный состав мем
бранных белков; групповой и жирнокислотный состав мембранных липидов).
3 Установить закономерность изменения водосодержания меристем в ходе годо
вого цикла, особенности распределения воды между водорастворимыми и нераство
римыми компонентами меристематических клеток; оценить водоудерживающие
свойства высоко- и низкомолекулярных компонентов цитозоля, нерастворимых ком-
понентов клеток, степень концентрирования внутриклеточных растворов при отрицательных температурах; выяснить первичный механизм, инициирующий повреждения структурно-метаболических систем клеток при замораживании.
4 Оценить криозащитное действие водорастворимых и мембранных белков; установить механизм формирования устойчивого состояния меристематических тканей, объясняющий сохранение их жизнеспособности в зимних условиях.
Защищаемые положения:
Экспериментально установленные закономерности изменений в меристемах почек хвойных древесных растений состава и свойств водорастворимых веществ при снижении температуры в осенне-зимний период. У I группы видов (лиственница, ель, пихта) в составе водорастворимых веществ до 30-50 % возрастает содержание высокомолекулярных соединений (белков), у II группы (сосна, кедр) - до 90-94 % увеличивается количество низкомолекулярных соединений.
Структурные и химические превращения клеточных мембран в осенне-зимний период и весной. При снижении температуры окружающей среды осенью в мембранах до 70-75 % возрастает доля белков и уменьшается доля липидов. В составе мембранных белков зимой присутствуют высокомолекулярные (ММ > 100 кД) фракции, исчезающие весной; липидный матрикс на 65-80 % сформирован фосфолипидами.
Теоретические модели механизмов устойчивости меристем, объясняющие специфику сохранения жизнеспособности двух групп хвойных видов в условиях действия низких отрицательных температур. К ним относятся:
Механизм, объясняющий стабилизацию мембран при обезвоживании меристематических клеток и льдообразовании, который заключается в формировании твердоупругого белкового "каркаса" при снижении доли липидного мат-рикса с одновременной его модификацией. Для исследованных видов данный механизм является универсальным;
Механизм формирования устойчивого состояния клеток у I и II групп хвойных видов, реализующих различные системы криозащиты, обусловленные физико-химическими свойствами высоко- и низкомолекулярных соединений.
Научная новизна. Установлены закономерности сезонных биохимических, физико-химических и структурных изменений в меристематических тканях почек морозоустойчивых лесообразующих древесных видов семейства Pinaceae.
У лиственницы, ели и пихты (видов с высоким зимним содержанием водорастворимых белков) выявлено существенное сходство состава мембранных периферических и водорастворимых белков. В составе водорастворимых белков впервые обнаружены пептиды (ММ < 5 кД) с аномально высоким содержанием пролина - до 35 %. Эти белки оказывают криозащитное действие: в зимующих почках слой периферических белков, адсорбированных на поверхности мембран, обладает высокой водоудерживающей способностью и антинуклеационной активностью, обеспечивая возможность переохлаждения цитозоля, сохраняя, тем самым, нативную структуру биологических мембран при низких температурах. У лиственницы, ели и пихты водорастворимые белки, синтезирующиеся в большом количестве весной в набухающих почках, также способствуют переохлаждению внутриклеточной воды.
Обнаружены достоверные видоспецифичные различия суммарного содержания непротеиногенных аминокислот у ели и сосны (существенно отличающихся по ко-
личеству водорастворимого белка в зимующих меристемах). У обоих видов уровень непротеиногенных аминокислот зимой повышен по сравнению с весной вдвое.
Выявлена взаимосвязь между морозоустойчивостью вида и величиной соотношения фосфолипиды/гликолипиды в клеточных мембранах: у лиственницы (самый морозоустойчивый вид) соотношение самое высокое - 7,5/1; у сосны (наименее морозоустойчивый вид) соотношение самое низкое - 2,1/1. Предложена и обоснована гипотетическая схема биосинтеза фосфолипидов в меристемах при формировании состояния низкотемпературной устойчивости. Установлено, что у ели и сосны воздействие низких температур на живые клетки индуцирует экспрессию десатуразных генов, обеспечивающих жидкостные свойства липидного бислоя; у лиственницы сохранение таких свойств контролируется активацией ацил-липидных десатураз и синтезом низкомолекулярных жирных кислот преимущественно с нечетным числом атомов углерода.
Показано, что даже в предельно обезвоженных меристемах вплоть до минус 40 С остается жидкая фаза в виде высококонцентрированного раствора. При температурах минус 20 С и ниже всю способную к кристаллизации воду в клетке в основном удерживают низкомолекулярные водорастворимые вещества, обеспечивая защиту клеточных мембран от повреждения кристаллами льда. Концентрация водорастворимых веществ в цитоплазме меристематических клеток при низкотемпературном обезвоживании может возрастать почти в три раза; максимальных значений (65-69 % сухого вещества) концентрация достигает около минус 40 С, когда способная кристаллизоваться вода уже мигрировала к зонам льдообразования и фазовые переходы воды в клетках становятся невозможны.
Практическая значимость. Исследования влияния низких температур на живые ткани морозоустойчивых хвойных видов в природных и лабораторных условиях имеют важное значение для факториальной экологии и вносят вклад в понимание механизмов взаимодействия древнейших представителей растительного мира с окружающей средой на уровне основных классов биомолекул, клеточных мембран, клеток и тканей. Кроме того, новые данные помогут в решении таких практически значимых современных проблем сельского и лесного хозяйства, как расширение ареалов хозяйственно ценных видов; оценка морозостойкости и возможности интродукции; разработка новых способов повышения устойчивости древесных растений; создание новых методов криоконсерви-рования генетического материала и генетического конструирования устойчивых к холоду растений. Все это, в конечном итоге, позволит обеспечить защиту экологически и экономически важных для человека растений от губительного влияния абиотических стрессоров и сохранение биоразнообразия бореальных лесов.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлялись на конференциях всесоюзных: «Проблемы физиологии и биохимии древесных растений» (Красноярск, 1982); всероссийских: «Химико-лесной комплекс - проблемы и решения» (Красноярск, 2000-2005, 2007-2010), «Проблемы экологии и развития городов» (Красноярск, 2001), «Непрерывное экологическое образование и экологические проблемы Красноярского края» (Красноярск, 2004), «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2006), «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007, 2009), «Дендроэкология и лесоведение» (Красноярск, 2007), «Химия и химическая технология растительного сырья» (Уфа, 2008), «Химия и технология растительных веществ» (Санкт-
Петербург, 2010); международных: «Химико-лесной комплекс - научное и кадровое обеспечение в XXI веке. Проблемы и решения» (Красноярск, 2000); «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2003, 2005); «Современная физиология: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), «Лесной комплекс и перспективы развития» (Брянск, 2009), International Symposium and Summer School «Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter. 6th meeting: NMR in Heterogeneous Systems» (Saint Petersburg, Russia, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано более 80 научных работ, в том числе 30 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, две монографии в соавторстве.
Личный вклад автора. Автором определены цели и задачи исследования, планирование эксперимента и методы, организация лабораторных исследований. Подготовка проб и анализы выполнялись при непосредственном участии или под контролем автора. Автором лично выполнена обработка и обобщение полученных результатов.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, 6 приложений. Библиографический список включает 668 источников. Материал изложен на 462 с, содержит 104 рисунка и 42 таблицы.
