Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Теоретические методы исследования ХА с учетом внутри- и межхромосомных контактов в интерфазном ядре .
1.1 Общая схема исследования
Глава 2. Влияние крупномасштабной структуры хромосом на типы и частоты внутрихромосомных обменных аберраций с учетом различных механизмов образования аберраций
2.1 Роль «контактного» и «кинетического» механизмов в формирование простых и комплексных обменов в зависимости от крупномасштабной структуры хромосом
Глава 3. Теоретическое исследование механизмов образования межхромосомных обменов в лимфоцитах человека под действием редко- и плотноионизирующего излучения
3.1 Определение частот межхромосомных обменов, индуцированных рентгеновским излучением в лимфоцитах человека
- Общая схема исследования
- Роль «контактного» и «кинетического» механизмов в формирование простых и комплексных обменов в зависимости от крупномасштабной структуры хромосом
- Определение частот межхромосомных обменов, индуцированных рентгеновским излучением в лимфоцитах человека
Введение к работе
Актуальность темы
Хромосомные аберрации (ХА) считаются одним из наиболее чувствительных индикаторов радиационно-индуцированных генетических изменений. Определение дозовых зависимостей частот хромосомных обменных аберраций (дицентриков, транслокаций) т vitro используется в биодозиметрии для оценок поглощенных доз у людей, пострадавших в результате облучения (ликвидаторы аварии на ЧАЭС, жители загрязненных территорий, космонавты и т д) Хромосомным аберрациям принадлежит, по современным представлениям, важная роль в злокачественной трансформации клеток [UNSCEAR 2000] Это связано с нарушением регуляции экспрессии генов, например, вследствие того, что активные гены в результате перестроек хромосом могут оказаться в репрессированном состоянии, удалены от ре-гуляторных участков и/или попасть в гетерохроматиновую область хромосом ХА могут быть использованы в качестве доклинического маркера канцерогенного риска для выявления онкологических заболеваний
Определение частот ХА в большинстве случаев производится методом FISH для отдельных хромосом, а затем частоты пересчитываются на геном При пересчете частот ХА с одной хромосомы на геном предполагается, что вероятность участия хромосом в обменных перестройках пропорциональна количественному содержанию в них ДНК. К настоящему времени накопилось достаточно данных, не согласующихся с этим предположением, что указывает на необходимость исследования механизмов образования ХА, в том числе для объяснения причин неслучайного участия хромосом в обменных перестройках
Внедрение в 2001 году метода одновременного флюоресцентного окрашивания всех хромосом ш situ (mFISH) позволило обнаружить, что частоты сложных (комплексных) ХА намного выше, чем предполагалось ранее Объяснения этому нет до сих пор, поскольку неясно, как образуются комплексные ХА, т.е неизвестны механизмы их образования
Механизмы образования ХА различаются (*) видом первичного повреждения (разрыв хроматидной нити - теория разрывов и воссоединений, или повреждение неразрывного типа - обменная теория), (**) образуются ли обмены между участками хромосом, находящимися в контакте в момент
облучения (механизм «предсуществовавшего контакта», «contact-first») или поврежденные участки хромосом приходят в контакт после облучения («кинетический механизм»). По современным представлениям, основным повреждением ДНК, ведущим к ХА, являются двойные разрывы (ДР) ДНК, и аберрации образуются вследствие ошибочной репарации ДР. В любом из механизмов для образования обменных аберраций требуются контакты поврежденных участков хромосом (либо в момент облучения, либо со временем после него) Поэтому одной из важнейших проблем при изучении ХА является проблема внутри- и межхромосомных контактов Это приводит к необходимости анализа контактов участков хромосом, в которых определяющую роль играет структура и динамика хромосом в интерфазном ядре Учет структуры и динамики хромосом на основе всех существующих на сегодняшний день моделей образования ХА принципиально невозможен
О том, что крупномасштабная структура хромосом (т.е. не на уровне ДНК и фибриллы хроматина, но на высших уровнях организации хроматина в хромосомах и упаковки хромосом в интерфазном ядре) влияет на образование ХА, свидетельствует ряд фактов Существующая на сегодняшний день модель случайных взаимодействий повреждений, основанная на предположении о том, что вероятность участия повреждения в обмене не зависит от того, где находится это повреждение (т е без учета структуры хромосом), предсказывает в 7 4 раза меньше межплечевых внутрихромосомных обменных аберраций в хромосоме 1 лимфоцитов человека, чем было обнаружено в эксперименте [Boei et al 98] (рентгеновское излучение в дозе 3 Гр) Соотношение между частотами ацентрических фрагментов и центрических колец составляет 5-12 (в зависимости от типов клеток и качества излучения), что существенно выше, чем предсказывает модель случайных взаимодействий (около 2.5) Распределение точек (мишеней), участвующих в обменных аберрациях (breakpoints), неслучайно по длине хромосомы, R-участки хромосом (генно-богатые) участвуют в обменах чаще, чем G-участки (генно-бедные) Частота образования дицентриков при у-облучении лимфоцитов в Gi-фазе выше, чем в G0, где хроматин более конденсирован
Цель и задачи исследования
Цель работы изучить зависимость типов и частот хромосомных аберраций, индуцированных ионизирующей радиацией, от структурной органи-
зации интерфазных хромосом путем развития методов биофизического моделирования
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи 1 Разработать методы моделирования радиационно-индуцированных хромосомных аберраций, учитывающие структурную организацию хромосом (внутри- и межхромосомные контакты) в интерфазном ядре 2. Разработать биофизическую модель образования комплексных ХА
Выяснить влияние структурной организации интерфазных хромосом на количественные характеристики ХА типы и частоты ХА, форма дозовых кривых, неслучайный характер распределения повреждений по длине хромосом.
Разработать методы, позволяющие воспроизводить в компьютерных экспериментах основные свойства экспериментальных систем исследования ХА (например, наблюдение фрагментов, размер которых превышает пороговый, задержка между облучением и подсчетом ХА), что позволит корректно сопоставлять расчетные и экспериментальные данные
Научная новизна
Разработаны методы биофизического моделирования образования хромосомных обменных аберраций под действием радиации. Впервые учтена роль крупномасштабной структуры и динамики хромосом в интерфазном ядре
Использование информации о структуре хромосом и хромосомных контактах показало, что параметры структуры хромосом (степень конденсации хромосом и пространственная близость хромосомных плеч), а также степень подвижности хромосомных субъединиц являются факторами, оказывающими влияние на частоту образования ХА и форму дозовых кривых как для плотноионизирующего (тяжелые заряженные частицы), так и для редкоионизирующего (фотоны) излучения
Впервые показано, что превышение числа комплексных обменов над простыми, наблюдаемое в эксперименте методом mFISH (дифференциальное флюоресцентное мечение всех хромосом в ядре), может быть обусловлено наличием одновременно двух механизмов образования ХА: в момент облучения по местам контактов повреждений на поверхности хромосомных
территорий (механизм «предсуществовавшего контакта») и со временем после облучения («кинетический механизм»)
Впервые теоретически показано, что клетки с ХА, индуцированными редкоионизирующим излучением, могут достигать первого митоза раньше, чем клетки без ХА, а также что частота ХА в метафазных клетках первого митоза (лимфоциты человека) практически не зависит от временного интервала между облучением и подсчетом ХА Оба этих результата согласуются с экспериментальными данными
С помощью разработанных теоретических методов показано, что один из наиболее точных экспериментальных методов исследования внут-рихромосомных аберраций - индивидуальное окрашивание плеч хромосом (CAP-FISH) -приводит к систематическим погрешностям при определении частот ХА. Выход комплексных внутрихромосомных обменов с помощью этого метода недооценивается (при малых дозах - до 10 раз по сравнению с числом образовавшихся комплексных обменов), выход простых переоценивается (до 1 5 раз)
Практическая значимость
Созданные методы дают возможность проводить компьютерные эксперименты по определению типов и частот ХА, воспроизводящие основные особенности реальных экспериментальных методов Это позволяет корректно интерпретировать экспериментальные данные, полученные с помощью метода FISH (в т ч метода многоцветного FISH с окрашиванием всех хромосом, mFISH, и с окрашиванием всех полос (бендов) одной хромосомы, тВАМЭ), прогнозировать типы и частоты ХА в области малых доз и получать количественную информацию о ХА, недоступную прямым экспериментальным измерениям Расчеты зависимостей доза-эффект на основании разработанных методов могут быть использованы при определении поглощенной дозы в биодозиметрии, а также при прогнозировании результатов облучения в сложных условиях4 радиационные аварии, космические полеты и т д Применение разработанных методов для расчета выхода специфических аберраций, ассоциируемых с различными типами раков, позволит прогнозировать радиационные риски этих заболеваний
Положения, выносимые на защиту
Вклад механизмов «предсуществовавшего контакта» и «кинетического» в формирование ХА зависит от степени компактизации интерфазных хромосом
Структура интерфазных хромосом определяет форму лозовых зависимостей частот простых внутрихромосомных аберраций, индуцированных рентгеновским излучением дозовые кривые квадратичны для деконденсированных структур (полимерный клубок) и сигмоидны для конденсированных (глобула)
Для плотноионизирующего излучения (а-частиц) форма дозовых кривых частот простых внутрихромосомных аберраций также зависит от структуры хромосом дозовые кривые линейно-квадратичны для деконденсированных структур и линейны для конденсированных
Крупномасштабная структура интерфазных хромосом (степень конденсации, взаимное расположение плеч) является фактором, определяющим наблюдаемое гетерогенное распределение участков, по которым образуются внутрихромосомные аберрации
Для корректного сравнения расчетных и экспериментальных данных созданы методы «виртуального эксперимента», позволяющие рассчитывать типы и частоты ХА с учетом особенностей экспериментальных методик: однородное окрашивание хромосом или хромосомных плеч, конечное разрешение метода FISH, временная задержка между облучением клеток и наблюдением ХА
Апробация работы и публикации
Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях, школа-конференция «Горизонты Физико-Химической Биологии», Пущино, 28 мая - 2 июня 2000 г, 30th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, Warsaw, Poland, August 27-31,2000, International conference "Modern Problems of Radiobiology, Radioecology and Evolution" dedicated to centenary of N W Timofeeff-Ressovsky, Dubna, September 6-9, 2000, 13th Symposium on Microdosimetry, Stresa (Lago Maggiore), Italy, May 27 - June 1, 2001, IV съезд по радиационным исследованиям, Москва, 20 - 24 ноября 2001, International Workshop "New Models
and Nuclear Methods m Biophysics and Biochemistry", Dubna, 24 - 25 January, 2002, П Международный симпозиум "Механизмы действия сверхмалых доз". Москва, декабрь 2002 г; COSPAR colloquium "Radiation safety of manned Mars mission", Дубна, 26 сентября - 1 октября 2003 г, 33rd Annual meeting of European Society for Radiation Biology, Budapest, Hungary, August 25-28, 2004, конференция «Фундаментальные науки - медицине», 2-3 декабря 2004, семинар «Биофизика онкологических процессов», Санкт-Петербург, 7-8 декабря 2004, 14th Symposium on Microdosimetry, Venice, Italy, November 12-18, 2005, конференция «Фундаментальные науки - медицине», 14-15 декабря 2005, V съезд по радиационным исследованиям, Москва, 10-14 апреля 2006
По материалам диссертации опубликовано 10 статей и 17 тезисов на российских и международных конференциях.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитированной литературы (102 наименования), изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 33 рисунка.
Общая схема исследования
Число и расположение контактов хромосомных субъединиц внутри отдельных хромосом и между хромосомами определялись в ходе биофизического моделирования структур отдельных хромосом или хромосом в составе клеточного ядра. Структуры хромосом были рассчитаны ранее с помощью динамического варианта метода Монте-Карло, описанного в [46,47,48]. Интерфазные хромосомы моделировались как свободносочле-ненные полимерные цепи. Элементы цепей (хромосомные субъединицы) представляли собой розеткообразные структуры, образованные петлями 30-нанометровой фибриллы хроматина, основания которых расположены на ядерном матриксе. Содержание ДНК в субъединице составляет 1-3 миллиона пар оснований (мпо) [46,48], что соответствует размерам наименьших бендов метафазных хромосом. Субъединицы соединены между собой линкерами постоянной длины. Количество субъединиц хромосомы соответствует содержанию ДНК в этой хромосоме согласно работе [49]. Размеры субъединицы, содержание ДНК в которой составляет 1.3 мпо, следующие: средний гидродинамичекий диаметр d=350 нм, средний диаметр огибающей поверхности 520 нм, что примерно равно 1.5d. Крупномасштабная структура хромосом формировалась за счет взаимодействия элементов цепей между собой: притяжения на больших расстояниях (r d) и отталкивания на малых (r d, исключенный объем). Энергия взаимодействия / и j элементов хромосомы в общем виде представляет собой степенную функцию расстояния между ними, п=г / д
Коэффициенты kjj„ обобщенно учитывают мультиполярные взаимодействия различных белков с ДНК хромосом, внутриядерную среду (ионную силу, рН), прикрепление элементов хромосомы к ядерному матриксу, ламине, и т.д. В общем случае эти коэффициенты индивидуальны для каждой пары элементов (i, j). Поскольку система моделируется при постоянной температуре, в коэффициенты ку„ включен также множитель 1/кТ, т.е. эти коэффициенты и потенциальная энергия обезразмерены. Для получения крупномасштабных структур хромосом 1 и 6 человека, количественные и качественные характеристики которых согласуются с экспериментальными данными, были использованы наборы коэффициентов, отличающиеся для пар элементов, расположенных в одном хромосомном плече, либо в различных плечах, либо в одном из плеч и в прицентромер-ной области хромосомы.
Алгоритм, лежащий в основе использованного нами метода моделирования структуры интерфазной хромосомы, был предложен в работе [50] и модифицирован в [46,47] для исследования динамики полимерных систем. Он состоит в следующем: 1) Начальное состояние системы выбирается произвольно. В представленной работе система изначально находится в состоянии идеального гауссова клубка либо реального полимерного клубка с исключенным объемом. 2) В начале к-го шага Монте-Карло вычисляется потенциальная энергия системы Е0: E0=ftU, (1.2) 3) Генерируется новое состояние системы. В работе [50] оно генерируется произвольно; в использованной нами модификации метода новое состояние системы отличается от предыдущего произвольным изменением местоположения трех соседних элементов цепи. Расстояние между соседними элементами по цепи при этом остается постоянным. 4) Вычисляется потенциальная энергия системы в новом состоянии Е по формуле (1.2). 5) В случае если Е Ео, новое состояние принимается с вероятностью единица; в случае если Е Е0, новое состояние принимается с вероятностью ехр(Ео-Е) [50]. 6) Независимо от того, было принято или отвергнуто новое состояние, осуществляется переход к к+\ шагу Монте-Карло.
Пункты 2-6 повторяются N раз. Каждый шаг Монте-Карло соответствует интервалу времени At, весь расчет - времени T=NAt. В работе [50] было показано, что независимо от того, каким образом генерируется начальное состояние системы и как моделируется новое состояние на основе предыдущего, система стремится к термодинамическому равновесию при N—»оо. В данной работе величина N выбиралась таким образом, чтобы все полученные кинетические кривые (гидродинамический радиус хромосомы, число внутрихромосомных контактов), усредненные по ансамблю 100 историй, выходили на плато. Для хромосом, состоящих из -100 субъединиц, использовались значения N l О5.
Соотношение между числом шагов Монте-Карло и временем определялось путем сопоставления расчетных данных по динамике хромосомных субъединиц с экспериментальными данными [51]. Временная зависимость расстояния между хромосомными субъединицами, наблюдаемая в эксперименте, имела характер либо ограниченной диффузии («взаимная диффузия», [51]), либо осцилляции. В наших расчетах после прихода системы к равновесию расстояние между парами субъединиц менялось со временем осцилляторно. Период колебаний в эксперименте составлял примерно 4 часа. Определяя число шагов Монте-Карло, составляющее период колебаний в расчетах (оно различно в зависимости от степени конденсации полимерной цепи, а также от количества субъединиц), мы для каждого конкретного расчета вычисляли величину шага Монте-Карло. Для глобулярной цепи, состоящей из 202 субъединиц, одному часу времени соответствовали примерно 40000 шагов Монте-Карло.
Для расчета типов и частот внутрихромосомных аберраций, индуцированных излучением с различными ЛПЭ, были смоделированы структуры хромосом 6 [46] и 1 [52] человека. Выбор хромосомы 6 был обусловлен наличием как количественных, так и качественных экспериментальных данных по ее структуре, полученных с помощью метода флюоресцентной гибридизации in situ (FISH): распределения расстояний между теломерами хромосомы [53], распределения степени перекрытия хромосомных плеч [54], морфологии хромосомной территории [53]. Предсказание хромосомных аберраций проводилось для структур, приведенных на рис.2: гетерогенная глобула (структура с пространственно разделенными глобулярными плечами, перекрывающимися в области центромера, рис.2, А) и деконденсированная структура (полимерный клубок с исключенным объемом, рис.2, Б).
Роль «контактного» и «кинетического» механизмов в формирование простых и комплексных обменов в зависимости от крупномасштабной структуры хромосом
Одна из главных проблем при исследовании ХА заключается в том, что механизмы их образования точно неизвестны; в частности, неизвестно, происходит ли взаимодействие повреждений по местам контактов, уже имевших место в момент облучения (механизм «предсуществовавше-го контакта»), либо контакты повреждений образуются уже после облучения («кинетический механизм»), либо имеют место оба механизма. Мы попытались ответить на вопрос, зависит ли преобладающий механизм образования внутрихромосомных аберраций от структуры хромосомы. Для этого мы провели компьютерный эксперимент по рентгеновскому облучению индивидуальной хромосомы, в которой повреждения могли взаимодействовать как сразу после облучения (если они находились в контакте изначально), так и со временем (если они приходили в контакт раньше, чем элиминировались в ходе репарации).
На рис.7 представлена расчетная зависимость от времени числа простых и комплексных внутрихромосомных аберраций, образовавшихся под действием рентгеновского излучения в хромосоме 6 человека. Скорость взаимодействия повреждений в данном расчете бесконечно велика, т.е. взаимодействие происходит с вероятностью 1, как только поврежденные субъединицы приходят в контакт, либо если они находятся в контакте изначально. Скорость репарации составляет 1.25 ДР/час, это значение вычислено по данным [66]. На рис.7, А-Г приведены результаты расчета для конденсированной структуры (рис.1, А); на рис.7, Е-3 - для клубка (рис.1, Б).
Из графиков А-Г видно, что в конденсированной хромосоме 6 при всех рассматриваемых дозах большинство аберраций образуется сразу после облучения, т.е. по механизму «предсуществовавшего контакта». Со временем число аберраций возрастает менее чем в полтора раза (максимум на 43%, для простых ацентрических колец при дозе 0.5 Гр). Таким образом, для конденсированной хромосомы 6 механизм образования внутрихромосомных аберраций «предсуществовавшего контакта» является основным.
В то же время в хромосоме 6 в состоянии реального полимерного клубка большая часть обменов образуется со временем после облучения, графики Д-3. Число аберраций со временем возрастает в среднем в 3 раза, а для простых центрических колец и дозы 0.5 Гр - в 8 раз. Таким образом, в клубке лишь небольшая доля аберраций (-1/4) образуется по механизму «предсуществовавшего контакта», а остальные - по «кинетическому» механизму.
Это различие между глобулой и клубком связано с тем, что динамика субъединиц в глобуле заторможена, в то время как в клубке она более свободна. В глобуле поврежденные субъединицы, находившиеся в момент облучения на некотором расстоянии друг от друга, могут прийти в контакт в течение 6 часов (время, за которое практически полностью осуществляется восстановление повреждений, индуцированных рентгеновским излучением, [66]) с небольшой вероятностью. Приход в контакт двух поврежденных субъединиц, находившихся в момент облучения на разных краях хромосомной территории, практически невозможен (если структура в результате облучения не претерпевает масштабных кооперативных перестроек, (О
Кинетика образования аберраций, индуцированных рентгеновским излучением в хромосоме 6. А-Г - глобула, Д-3 - клубок. А, Д - D=0.5 Гр; Б, Е - 1 Гр; В, Ж - 2 Гр; Г, 3 - 3 Гр. 1 - простые ацентрические кольца, 2 - простые центрические кольца, 3 -комплексные обмены. рассмотрение которых выходит за рамки данной работы). В реальном клубке ограничение динамики субъединиц накладывается только исключенным объемом (цепь субъединиц не может самопересекаться), поэтому поврежденные субъединицы, находившиеся в момент облучения на некотором расстоянии друг от друга, с большой вероятностью могут прийти в контакт и взаимодействовать между собой.
Результаты, представленные на рис.7, получены для бесконечно большой скорости взаимодействия и являются модельными. Уменьшение скорости взаимодействия должно привести к общему снижению числа аберраций; при этом обнаруженная тенденция (в глобуле аберрации образуются преимущественно по механизму «предсуществовавшего контакта», в клубке - преимущественно по «кинетическому») сохранится. Это связано с тем, что различие вызвано разным характером динамики субъединиц в глобуле и клубке и не обусловлено скоростью взаимодействия.
На рис.8 и 9 приведены расчетные дозовые зависимости числа простых ацентрических колец (рис.8) и комплексных аберраций (рис.9). Данные - те же, что на рис.7. На каждом из рисунков левый график представляет аберрации, образованные сразу после облучения (по механизму «предсуществовавшего контакта») На правом графике приведены данные по аберрациям через 7 часов после облучения, когда число аберраций становится постоянным (см. рис.7), то есть с учетом обоих рассматриваемых механизмов образования аберраций. На каждом из графиков приведены в сравнении данные для глобулы и для клубка. Из графиков видно, что число аберраций в глобуле выше, чем в клубке. Это относится и к простым, и к комплексным обменам, образованным как сразу, так и со временем после облучения. Разница составляет до 5 раз при больших дозах и до 10 раз при малых. Со временем различие между клубком и глобулой по числу аберраций уменьшается. Это объясняется тем, что в клубке, в отличие от глобулы, большинство обменов образуется по «кинетическому» механизму, спустя некоторое время после облучения.
Определение частот межхромосомных обменов, индуцированных рентгеновским излучением в лимфоцитах человека
При исследовании хромосомных аберраций важно знать не только количество образовавшихся обменов, но и их «качество», т.е. насколько эти аберрации сложны. Степень сложности аберраций можно оценить по ряду критериев: соотношение простых и комплексных обменов, количество хромосом в составе аберрации, количество повреждений, взаимодействие которых привело к образованию аберрации, количество «циклов воссоединения» (термин, предложенный в работе [34]) и т.д. В данной работе для оценки степени сложности межхромосомных аберраций используются два критерия: соотношение простых и комплексных обменов и распределение числа хромосом, образующих комплексную аберрацию. Из рис.23 видно, что при хорошем количественном согласии расчетных и экспери ментальных частот простых обменов, индуцированных рентгеновским излучением, расчетные частоты комплексных обменов ниже, чем экспериментальные; таким образом, по первому из вышеприведенных критериев сложность ХА, индуцированных рентгеновским излучением, в расчетах недооценивается. На рис.24 приведено отношение числа простых и комплексных обменов, индуцированных а-частицами (ЛПЭ 115 кэВ/дм) в дозе 0.5 Гр, к общему числу обменов. Соотношения, рассчитанные в данной работе с учетом различных механизмов образования ХА при различных наборах параметров (рис.24, А-Г), сопоставлены с экспериментально измеренным (рис.24, Д). Доза 0.5 Гр соответствует попаданию в среднем одной а-частицы в ядро диаметром 8 дм. Видно, что при всех исследованных наборах параметров (см. подпись к рис.9) расчеты недооценивают долю комплексных обменов по отношению к простым. Учет образования ХА как по механизму «предсуществовавшего контакта», так и по кинетическому механизму, в случае низкой эффективности репарации повреждений, индуцированных плотноионизирующей радиацией (пренебрежение репарацией приводит к увеличению эффективного расстояния взаимодействия до 2d), позволяет получить результат, качественно согласующийся с экспериментальными данными - превышение числа комплексных ХА над простыми (рис.24, Г).
Проверка степени сложности ХА, индуцированных а-частицами, по критерию числа хромосом в составе ХА была проведена путем сопоставления расчетного и экспериментального [35] распределений числе хромосом в составе комплексной аберрации. Из рис.25 видно, что рассчитанная вероятность образования комплексных обменов, включающих в себя большое число хромосом (больше 4), ниже, чем измеренная экспериментально; в то же время теория (контактный механизм, как «предсуществовавшего контакта», так и кинетический) предсказывает более высокую вероятность образования комплексных обменов из двух хромосом. 0,8 0,6 т
Отношение числа простых и комплексных обменов к общему числу аберраций. Лимфоциты человека, альфа-частицы (ЛПЭ 115 кэВ/дм), D=0.5 Гр. А-Г - расчеты: А -механизм «предсуществовавшего контакта», Р=1; Б - механизмы «предсуществовавшего контакта» и кинетический, эффективная репарация, Р=1; В — механизмы «предсуществовавшего контакта» и кинетический, эффективная репарация, Р=0.14; Г - механизмы «предсуществовавшего контакта» и кинетический, неэффективная репарация, Р=1; Д - эксперимент [35]. Слева - простые, справа - комплексные обмены. 4 5 6 7
Распределение числа хромосом, входящих в состав комплексной аберрации. Лимфоциты человека, а-частицы (ЛПЭ 115 кэВ/цм), D=0.5 Гр. 1 - расчет, механизмы «предсуществовавшего контакта» и кинетический, эффективная репарация, Р=1; 2 -эксперимент [35]. Таким образом, при помощи разработанного биофизического метода предсказания выхода межхромосомных аберраций впервые удалось теоретически оценить степень сложности межхромосомных аберраций. Показано, что контактный механизм недооценивает степень сложности образующихся обменов. В проведенном расчете не учитывались указанные во 2 главе особенности экспериментальных методов, могущие вносить искажения в наблюдаемые частоты ХА: особенности окрашивания хромосом, конечное разрешение метода FISH (недетектируемость фрагментов, размер которых меньше некоторой пороговой величины) и задержка клеточного цикла. Первый из этих факторов для межхромосомных ХА, исследуемых с помощью метода mFISH, не должен играть существенной роли. Поскольку в этом экспериментальном методе каждая пара хромосом окрашивается в индивидуальный цвет, детектируются все межхромосомные обмены, за исключением части обменов между гомологичными хромосомами, а доля таких обменов мала (по расчетам, она не превышает 5% от общего числа обменов). Учет конечного разрешения метода FISH (в т.ч. mFISH) для межхромосомных обменов не проводился. Исходя из данных по внутрихромосомным обменам (см. рис. 11), частота комплексов, видимых в эксперименте с конечным разрешением, ниже частоты комплексов, наблюдаемых в «идеальном эксперименте», т.е. с абсолютным разрешением. Таким образом, учет этого фактора должен привести к снижению частоты комплексных ХА и, следовательно, к еще большему превышению наблюдаемых простых ХА над комплексными, чем видно на рис.23 и 24. Что касается третьего фактора, задержки клеточного цикла, его влиянию на частоты ХА будет посвящена глава 4.
Возможное объяснение недооценки сложности образующихся ХА заключается в том, что, моделируя структуру ядра лимфоцита человека, мы могли недооценить число контактов хромосомных субъединиц между различными хромосомами. Однако при большей степени деконденсации хромосом, чем в данной работе, хромосомные территории начинают существенно перекрываться, что противоречит данным [42]. Кроме того, подвижность субъединиц деконденсированных хромосом выше, чем наблюдается в эксперименте [51].
Вероятным объяснением недооценки доли комплексных обменов по отношению к простым является наличие нового механизма образования комплексов. Одним из факторов, влияющих на соотношение комплексных/простых ХА, может быть изменение структуры хроматина после облучения, т.е. его перестройка в процессе элиминации радиационных повреждений ДНК [83,84].
Концепция структурных перестроек хроматина, индуцированных облучением, была впервые предложена в работе [28]. Согласно этой концепции, одним из ответов ядра клетки на повреждения ДНК является изменение конформации интерфазного хроматина. Это должно приводить к изменению положения различных локусов интерфазных хромосом, в том числе не содержащих повреждений ДНК. Идея динамических перестроек хроматина с учетом открытия ядерных центров транскрипции, репарации и репликации [85] приводит к двум возможным динамическим механизмам образования ХА вследствие движения локусов, а именно: движение по направлению к ядерным центрам или от них.
В первом случае межхромосомные обмены могут формироваться как по предсуществующим контактам на ядерных центрах (быстрая компонента), так и в результате движения повреждений от нескольких хромосом к одному и тому же центру, где происходит репарация и взаимодействие элементов разных хромосом (медленная компонента). Это предположение согласуется с двухкомпонентной кинетикой формирования дицен-триков, наблюдаемой в эксперименте [75]. Образование комплексных ХА по динамическому механизму на центрах (репарации) позволяет объяснить повышенную частоту комплексных ХА по отношению к простым за счет увеличения со временем числа локусов от разных хромосом на данном центре. Во втором варианте движение локусов (как поврежденных, так и неповрежденных) происходит от центров, возможно как часть механизма задержки клеточного цикла, в процессе увеличения диаметра ядра после облучения. При этом ХА могут образовываться в процессе движения локусов от центров и образования дополнительных контактов поврежденных хромосом.
Можно предположить, что имеют место оба варианта, т.е. открепление от одних центров (репликации) и прикрепление к другим (транскрипции/репарации). Вклад обоих процессов в образование ХА, а также диапазон смещения локусов хроматина могут зависеть от качества излучения, микроокружения поврежденных участков хроматина, экспрессии генов, диапазона доз и др. Дальнейшие количественные оценки вклада этого механизма пока затруднены. Недавнее экспериментальное наблюдение, в котором была визуализирована динамика у-Н2АХ фокусов, индуцированных альфа частицами [86], качественно согласуются с динамическим механизмом образования ХА.
