Введение к работе
Актуальность проблемы
Мужское бесплодие – состояние, которое, как правило, является следствием совокупности патологических воздействий на репродуктивную систему мужчины. Доля мужского бесплодия составляет не менее половины причин бесплодия в браке (Matzuk, Lamb, 2002 Сегал, 2010; Щеплев, 2012). Несмотря на совершенствование современных методов диагностики, доля идиопатического бесплодия, т.е. бесплодия с неустановленной причиной, остается стабильной и составляет около 1/3 случаев мужского бесплодия (Курило, 2002; Сегал, 2010; Diemer, Desjardins,1999). В последние годы идет интенсивное накопление информации об ультраструктуре мужских половых клеток, которая указывает на необходимость расширения современных представлений о структуре патологии репродуктивной системы, регуляции сперматогенеза, об усовершенствовании методов и схем комплексной лабораторной диагностики нарушения репродуктивной функции.
Причинами бесплодия у мужчин могут являться функциональная неполноценность сперматозоидов. Нарушение функциональных свойств сперматозоидов при традиционном светооптическом исследовании в ряде случаев выявить невозможно. Для определения различных структурных параметров сперматозоидов может быть применен метод ультраструктурного анализа. Этот подход позволяет выявить особенности органоидов сперматозоидов – состояние акросомы, компактизации хроматина, строение жгутика и его компонентов, состояние и функционирование митохондрий, центриолей.
Внедрение методов молекулярной биологии в изучение генома человека позволило накопить информацию о различных генетических дефектах, приводящих к нарушениям характеристик сперматогенеза. За последние несколько лет были не только картированы некоторые гены, продукты экспрессии которых влияют на развитие и функции гамет, гонад и других органов половой системы, но и описаны мутации этих генов. Это позволило в настоящее время четко идентифицировать причину некоторых форм нарушения центральных звеньев эндокринной регуляции и определить влияние этих мутаций на процессы стероидо- и гаметогенеза в гонадах, морфогенеза органов половой системы (Черных, Курило, 2001; , 2007).
Цель исследования - изучить ультраструктурные и молекулярно-генетические нарушения двигательной активности сперматозоидов на репрезентативной выборке пациентов с астенозооспермией.
Для достижения поставленной цели исследования были сформулированы следующие задачи:
-
Проанализировать вклад астенозооспермии в структуру патозооспермии на репрезентативной выборке пациентов.
-
Выявить особенности ультраструктуры жгутика сперматозоида и его компонентов у пациентов при астенозооспермии и бесплодии.
-
Исследовать возможные сочетания нарушений ультраструктур сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией и бесплодием.
-
Определить, имеется ли взаимосвязь между такими параметрами спермограммы, как подвижность сперматозоидов и наличие повреждений ДНК (одно- и двунитевые разрывы ДНК).
-
Провести исследование состава незрелых половых клеток из эякулята на разных стадиях их развития в группе мужчин с астенозооспермией и бесплодием.
-
Определить роль наиболее распространенных мутаций митохондриальной ДНК на репрезентативной выборке пациентов с астенозооспермией, провести сравнительный анализ частоты и спектра мутаций митохондриальной ДНК сперматозоидов во фракциях с различными параметрами подвижности сперматозоидов.
-
Изучить характер возможных перестроек гена GAPDHS, экспрессирующего спермоспецифичную изоформу глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, одного из ферментов гликолиза.
-
Расширить протокол комплексного медико-генетического обследования пациентов с астенозооспермией и бесплодием.
Научная новизна
Впервые на репрезентативной выборке российских пациентов установлено, что снижение подвижности сперматозоидов (астенозооспермия, астенотератозооспермия, олигоастенозооспермия, олигоастенотератозооспермия) вносит ведущий вклад (93%) в структуру патозооспермии. Анализ результатов статистической обработки показал, что структура астенозооспермии неоднородна: в 70 % случаев она сочетана с тератозооспермией, олигоастенотератозооспермия составляет 26% , олигоастенозооспермия - 0,25%, астенозооспермия встречается лишь 4% обследованных.
Количественный кариологический анализ соотношения незрелых половых клеток на разных стадиях их развития из эякулята впервые позволил выявить блок сперматогенеза на стадиях прелептотены-лептотены-зиготены у большинства пациентов с астенозооспермией, сопровождающейся полизооспермией. Также выявили повышенное количество незрелых половых клеток с признаками дегенерации и нарушением анафазы 1 и 2 делений мейоза.
Выявлено отсутствие ассоциации астенозооспермии и нарушений структуры хроматина и целостности ДНК.
При исследовании ультраструктурных основ нарушения двигательной активности сперматозоидов показано, что морфологические аномалии затрагивают различные компоненты жгутиков сперматозоидов – аксонему (центральные и периферические микротрубочки, динеиновые ручки), наружные плотные фибриллы, фиброзный слой.
У всех исследованных пациентов с дисплазией фиброзного слоя впервые обнаружен полиморфизм в гене GAPDHS - замена аденина на гуанин rs29381 (660-22 G>A) в гетерозиготном состоянии.
Практическая значимость
В работе расширена схема протокола комплексного медико-генетического обследования пациента с астенозооспермией неясного генеза. Полученные новые данные об особенностях нарушения ультрастуктуры сперматозоида у пациентов с астенозооспермией, проясняющие патогенез астенозооспермии, а также полученные данные о полиморфизме в гене GAPDHS у пациентов с астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя открывают возможности для оптимизации диагностики пациентов с астенозооспермией. Полученные данные важны для понимания ультраструктурных и молекулярно-генетических механизмов патогенеза астенозооспермии. Выявленное отсутствие ассоциации между количеством сперматозоидов с нарушением целостности ДНК и низкой подвижностью сперматозоидов расширяют современные представления о роли одно- и двунитевых разрывов ДНК сперматозоидов в этиологии астенозооспермии.
Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников (урологов-андрологов, акушеров-гинекологов, медицинских генетиков).
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в работу лаборатории генетики нарушений репродукции Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический генетический научный центр» Российской академии медицинских наук. В практикеу лаборатории внедрен расширенный протокол комплексного медико-генетического обследования, включающий обязательное проведение электронно-микроскопического анализа ультраструктур сперматозоидов, цитогенетического исследования и молекулярно-генетического анализа гена GAPDHS для пациентов с анастенозооспермией неясного генеза.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Астенозооспермия, одна из самых распространенных форм патозооспермии, имеет неоднородную структуру и в 70% случаев сочетана с тератозооспермией, астенозооспермия, несочетанная с другими формами патозооспермии встречается у 4% обследованных. Это свидетельствует о различных механизмах, приводящих к нарушению важной функции – нарушению двигательной активности сперматозоидов.
-
Количественный анализ структуры сперматозоидов показывает, что морфологические аномалии затрагивают различные компоненты – акросому, митохондрии, микротрубочки аксонемы, динеиновые ручки, наружные плотные фибриллы, фиброзный слой.
-
Распространенная делеция мтДНК 4977 не имеет клинической значимости для пациентов с астенозооспермией, данная протяженная делеция была обнаружена нами в образцах эякулята у обследованных пациентов с астенозооспермией и в контрольной группе примерно с равной частотой.
-
У пациентов с тотальной астенозооспермией и дисплазией фиброзного слоя в гене GAPDHS кодирующего фермент ГАФДс впервые обнаружили полиморфизм, rs29381 (660-22 G>A) в гетерозиготном состоянии.
Апробация работы
Результаты данной работы были представлены на Ежегодных российских научно-образовательных форумах "Мужское здоровье и долголетие" в 2009 и 2010 (г. Москва); 4th Utah-Florence Symposium on the Genetics of Male Infertility 2010 (Park City, USA); 16-th European Workshop on Molecular and Cellular Endocrinology of the Testis 2010 (Elba, Italy); VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 (г. Ростов-на-Дону); European Human Genetics Conference, 2010 (Gothenburg, Sweden); 26-м съезде European Society of human reproduction and embriology 2010 (Rome, Italy); 20-th World Congress on Fertility and sterility 2010 (Munich, Germany) (5-м Международном конгрессе Всемирной ассоциации по репродуктивной медицине в 2010 (г. Москва); American Society of Human Genetics Annual Meeting 2010 (Washington, USA); Ежегодной конференции молодых ученых Медико-генетического научного центра РАМН в 2010 и 2011 (г. Москва). Основные результаты работы доложены на межлабораторном научном семинаре Медико-генетического научного центра РАМН (декабрь, 2011).
Публикации материалов исследования
По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация построена по традиционному плану, состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы». Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 30 иллюстраций и 10 таблиц. Список использованной литературы содержит 180 наименований (из них 32 в отечественных изданиях и 148 публикации в зарубежных изданиях)
