Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Обзор литературы
2.1. Структура, функции, метаболизм гликосфинголипидов (ГСФ) 8
2.2. Лизосомные болезни накопления ГСФ 15
2.3. Болезнь Гоше (БГ) 19
2.3.1. Характеристика клинических фенотипов БГ 20
2.3.2. Молекулярные механизмы этиологии и патогенеза БГ 22
2.3.2.1. Патологические метаболиты БГ 22
2.3.2.2. Патогенные маркеры БГ 24
2.3.2.3. Кислая p-D-глюкоцереброзидаза 27
2.3.3. Молекулярно-генетический анализ БГ
2.3.3.1. Характеристика гена p-D-глюкоцереброзидазы 29
2.3.3.2. Анализ мутаций в гене p-D-глюкоцереброзидазы 32
2.3.3.3. Гено-фенотипические корреляции при БГ 36
2.4. Методические подходы к диагностике БГ
2.4.1. Клинико-биохнмическая диагностика БГ 39
2.4.2. Молекулярно-генетическая диагностика БГ 41
2.5. Лечение БГ
2.5.1. Ферментзаместительная терапия 42
2.5.2. Субстратподавляющая терапия 43
2.5.3. Генотерапия 44
2.5.4. Другие методы лечения 44
2.6. Профилактика БГ 45
3. Экспериментальная часть
3.1. Материалы и методы 47
3.2. Результаты
3.2.1. Характеристика выборки обследованных больных 59
3.2.2. Пре- и постнатальная энзимодиагностика
3.2.2.1. Активность p-D-глюкозидазы 64
3.2.2.2. Активность хитотриозидазы 66
3.2.3. Пренатальная энзимодиагостика 74
3.2.4. Молекулярно-генетический анализ БГ 74
3.2.5. Исследование популяционного полиморфизма по обнаруженным мутациям 78
3.2.6. Гено-фенотипические корреляции 78
3.3. Обсуждение
3.3.1. Биохимическая диагностика 85
3.3.2. Молекулярно-генетическая диагностика 86
3.3.3. Гено-фенотипические корреляции 88
4. Заключение 94
5. Выводы 96
6. Приложения 98
7. Список литературы
- Структура, функции, метаболизм гликосфинголипидов (ГСФ)
- Молекулярные механизмы этиологии и патогенеза БГ
- Характеристика выборки обследованных больных
- Гено-фенотипические корреляции
Введение к работе
Актуальность работы.
Гликосфинголипидозы - группа наследственных болезней обмена веществ, характеризующихся нарушением ферментативного внутрилизосомного расщепления гликосфинголипидов (ГСЛ), важнейших структурных элементов клеточных мембран. Нарушение процесса расщепления ГСЛ сопровождается их внутрилизосомным накоплением в клетках-мишенях, что приводит к гибели этих клеток.
К гликосфинголипидозам относится и болезнь Гоше (БГ). Это аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, обусловленное мутациями в структурном гене P-D-глюкоцереброзидазы, фермента, участвующего в процессе расщепления ГСЛ и присутствующего в лизосомах всех типов тканей (Brady et al, 1965а). БГ является наиболее распространенным гликосфинголипидозом человека, однако три ее основных клинических фенотипа (I - III) распространены с различной частотой. Самым частым из них является тип I, не неврологический, (в различных популяциях от 1:40 000 до 1:60 000 новорожденных), типы II и III, неврологические, встречаются реже (1:100 000 и 1:50 000 соответственно).
Характерными особенностями БГ являются клиническая гетерогенность и полиморфизм (Beuller and Grabowski, 1995), что существенно затрудняет диагностику БГ. Поэтому на клиническом уровне заболевание может быть только заподозрено, а для точной диагностики необходимо проведение биохимических исследований (локусная дифференциация БГ) и молекулярно-генетических исследований (аллельная дифференциация БГ)- Использование таких диагностических процедур, очевидно, позволяет решать проблемы точной постнатальной диагностики, что необходимо для профилактики БГ в семьях высокого риска.
В исследовании, диагностике и разработке методов лечения БГ I типа последовательно реализовались все методические подходы, используемые для других наследственных болезней обмена веществ (НБО), что делает это заболевание своеобразной моделью в современной медицинской генетике. Методические подходы включают анализ патологических метаболитов, дефектного фермента, мутантного гена, разработку методов терапии (ферментзаместительной (ФЗГ), субстратподавляюшей (СПТ) и генотерапии). Метод измерения активности кислой p-D-глюкозидазы в клетках крови и фибробластах человека был разработан в 1965r (Brady et al, 1965b). Метод является простым, удобным и быстрым, а также не требует тяжелых инвазивных вмешательств. Кроме того, в 1994г. было обнаружено, что у больных с БГ макрофаги при накоплении негидролизованного субстрата начинают интенсивно синтезировать фермент хитотриозидазу (XT), в результате чего активность этого фермента возрастает более чем в сто раз (Hollak et al, 1994). Это позволяет использовать значение активности XT в качестве дополнительного маркера в диагностике БГ.
Расшифровка последовательности гена p-D-глкжоцереброзидазы, картированного на хромосоме lq 21, позволяет проводить анализ спектра мутаций при БГ (Sorge et al, 1985). По данным мировой литературы молекулярно-генетический анализ БГ начался в 90-х годах, тогда как в отечественной медицинской генетике еще не проводился (Beutler et al, 1990; Zimran et al, 1991; Sibille et al, 1993).
Настоящая работа важна как с научной, так и с практической точки зрения. Ее научная значимость определяется вкладом в исследование полиморфизма генома человека. Особенности формирования геномной структуры популяции обуславливают целесообразность изучения геномного полиморфизма, сопровождающегося как патологическим, так и нейтральным действием во всех популяциях, без чего представления о генофонде человека не могут быть полными.
Практическая значимость определяется задачами медико-генетического консультирования (МГК), т.е. точной диагностикой и дифференциацией различных по тяжести форм заболевания. Для значительного количества семей поводом для обращения в МГК является прогноз жизни ребенка. Тяжесть заболевания влияет на решение родителей о сохранении или прерывании беременности.
Все, выше изложенное, определяет актуальность выполненной работы. Цель и задачи исследования.
Целью данной работы являлись локусная и аллельная дифференциация различных клинических форм БГ. В ходе исследования решались следующие задачи:
формирование выборки больных с болезнью Гоше; сравнительный анализ активности дефектного фермента (P-D глюкоцереброзидазы) у пациентов с различными клиническими
формами БГ, носителей БГ и в контрольной группе;
сравнительный анализ активности маркерного фермента (хитотриозидазы) у пациентов с различными клиническими формами БГ, носителей БГ и в контрольной группе;
скрининг на частые мутации и поиск редких мутаций в гене БДГ;
анализ гено-фенотипических корреляций на исследуемой выборке больных. Научная новизна и практическая значимость работы.
Учитывая фенотипическое сходство БГ с другими заболеваниями (например, БГ тип I с болезнью Ниманна-Пика тип В или остеомиелитом, БГ тип II с Gml-ганглиозидозм), при клиническом обследовании БГ можно только заподозрить. В практике отечественной медицины до сих пор главным методом постановки диагноза БГ является исследование цитологических препаратов костного мозга. Процедура забора клеток костного мозга является болезненной для пациента, а результат цитологического исследования не всегда может быть однозначным. Отработанный метод биохимической диагностики, основанный на измерении активности p-D-глюкозидазы в лейкоцитах крови, дает возможность достоверно диагностировать БГ без применения сложного и болезненного для пациента исследования пункции костного мозга. А дополнительное исследование активности XT в плазме дает возможность контролировать не только правильность постановки диагноза в случаях пограничной активности p-D-глюкозидазы, но и процесс лечения БГ. Результаты, полученные при обследовании пациентов в нашей лаборатории, подтверждают значимость биохимических методов исследования в диагностике БГ. Так из 152 человек с направляющим диагнозом БГ, диагноз БГ был подтвержден только у 86 человек.
Разработанные подходы к анализу первичной структуры нормального и мутантных аллелей гена p-D-глюкозидазы позволяют выявить молекулярные дефекты, лежащие в основе болезни Гоше. Впервые был проведен анализ мутантного гена у 55 российских больных с I, II и III типами БГ. Это позволило создать базу для прямого исследования генетической гетерогенности БГ. Впервые определен спектр мутаций в гене P-D-глюкозидазы в выборке российских больных и предпринята попытка выявить влияние данных мутаций на клиническое проявление БГ. Разработанные методы исследования позволили идентифицировать 16 мутантных аллелей. В ходе исследования обнаружены три преобладающих мутациив 9 и 10 экзонах гена p-D-глюкозидазы. Эти результаты позволяют предположить наличие специфических генотипов для российских популяций. Положения, выносимые на защиту.
1. Проанализированы значения активности p-D-глюкозидазы в выборке пациентов с различными клиническими формами БГ, носителей БГ и в контрольной группе.
2. Проанализированы значения активности хитотриозидазы в выборке пациентов с БГ клиническими формами БГ, носителей БГ и в контрольной группе.
3. Обнаружено 16 мутаций в гене p-D-глюкозидазы у больных с различными клиническими формами БГ, в том числе 7 новых.
4. Выявлены особенности гено-фенотипических корреляций при БГ.
Структура, функции, метаболизм гликосфинголипидов (ГСФ)
ГСЛ представляют собой сложные соединения, состоящие из трех компонентов: 1) аминоспирта (у млекопитающих - сфингозина, у дрожжей и растений - фитосфингозина) (рис.1); 2) длинноцепочечной жирной кислоты (чаще стеариновой, или а- и й-гидроксилированных жирных кислот); 3) углеводной цепи (в гликосфинголипидах) или фосфорилхолина (в сфингомиелинах) (рис.2).
В соответствии с размером углеводной цепи, которая может быть представлена мопосахаридным остатком, или сложным углеводным полимером, ГСЛ разделяют на несколько классов. Цсрсброзиды - моногликозилцерамиды (галактоцереброзид или глюкоцереброзид). Сульфатиды - цереброзиды с сульфогруппой на углеводном остатке. Гл обоз иды - нейтральные ГСЛ, состоящие из церамида и олигосахарида. Ганглиошды - анионные ГСЛ, сходные по своему составу с глобозидами, но содержащие один или несколько остатков сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, NANA) в составе олигонуклеотидной цепи (рис.2).
ГСЛ входят в состав наружной поверхности плазматических мембран всех эукариотических клеток. Главная их функция, как мембранных липидов, формирование бислойного матрикса. Жирнокислотный амид сфингозина -церамид - погружен в плазменную мембрану, а углеводная цепь располагается снаружи. Обычно ГСЛ являются минорными компонентами, но иногда содержатся в значительных количествах (например, в плазматических мембранах эпителиальных клеток, в белом веществе мозга, миелиновой оболочке нервного волокна). В некоторых случаях ГСЛ локализуются не в плазматической мембране, а во внутриклеточных мембранах (Symington, et al, 1987). Количество и состав ГСЛ клетки зависит от вида ткани. Расположение ГСЛ на наружной поверхности клетки изменяется в зависимости от физиологических процессов (стадии дифференциации клетки, онкогенной трансформации).
До конца 1970-х годов считалось, что липиды являются в основном инертными структурными компонентами, формирующими двуслойный матрикс, в котором взаимодействуют белки, и способствуют стабилизации сильно искривленных участков мембраны (Cullis, et al 1986; Curatolo, Neuringer, 1986; De Kruiff, 1987), В настоящее время накоплены данные, указывающие на участие липидов в клеточных взаимодействиях, сигнальной транедукции, эмбриогенезе, в формировании антигенных химических маркеров клетки и химических маркеров стадий клеточной дифференциации, регуляции нормального роста клеток, в формировании способности клетки реагировать с некоторыми биологически активными соединениями (Curatolo, 1987).
Метаболизм липидов - активный процесс. Полярные липиды мембран (фосфолипиды и сфинголипиды) в организме животных не запасаются, поэтому они постоянно синтезируются для восполнения потерь, связанных с разрушением мембран в ходе метаболических процессов.
Биосинтез ГСЛ является сложным многокомпонентным процессом, сочетающим ферментативный биосинтез жирных кислот, сфингозина, церамида и олигосахаридных цепей ГСЛ.
Биосинтез жирных кислот (ЖК) включает два этапа: первый этап -образование пальмитата - протекает в цитоплазме; второй этап - образование из пальмитата более длинных насыщенных жирных кислот - протекает в эндоплазматическом ретикулюме (ЭПР) и митохондриях. Пальмитиновая и стеариновая кислоты являются предшественниками наиболее распространенных в животных тканях мононенасыщенных ЖК: пальмитолеиновой и олеиновой кислот. Биосинтез жирных кислот катализируется ацетил-КоА карбоксилазой, синтазой жирных кислот и соответствующими ацетил-КоА оксигеназами (Ленинджер, 1985).
Биосинтез сфингозина осуществляется конденсацией пальмитоил-КоА и серина в результате двух окислительно-восстановительных реакций. Первая реакция протекает с участием НАДФЬҐ в качестве донора водорода и катализируется серин-С-пальмитоил трансферазой. А вторая катализируется флавопротеинсодержащим ферментом, подобным ацил-КоА дегидрогеназе (3-дегидросфинганин редуктазой) (Ленинджер, 1985). При ацилировании аминогруппы сфингозина ацил-КоА с помощью фермента сфинганин-М-ацетил транс феразы образуется D-эритро-дигидроцерамид (дигидроцерамид).
Превращение дигидроцерамида в церамид происходит с помощью дигидроцерамид дезатуразы. В эукариотических клетках синтез сфингозина и образование молекулы церамида происходит в ЭПР.
Процесс образования олигосахаридных цепей требует согласованного действия группы гликозил трансфераз, которые могут быть тесно ассоциированы в субклеточных мембранах в мультиферментный комплекс. Последовательное присоединение моносахаров к церамиду происходит в аппарате Гольджи (Ленинджер, 1985). При синтезе молекул сфингомиелина или гликосфинголипидов в сфингозине замещается концевая гидроксильная группа. В качестве доноров остатков Сахаров выступают ЦДФ-холин, УДФ-глюкоза, УДФ-галактоза, УДФ-N-ацетилгалактозамин и ЦМФ-производное N-ацетилнейрамината (рис.3). Синтез цереброзидов может идти по альтернативному пути: сначала образуется производное галактозы и сфингозина - психозин, а затем при ацилировании психози на образуется цереброзид. Ганглиозиды также образуются из психози на (Ленинджер, 1985).
Структура образующегося ганглиозида определяется специфичностью гликозилтрансфераз данной клетки. На сегодня известно более 300 различных ганглиозидов (Hakomori, 1981; Hannun, Bell, 1989; Wiegandt, 1985).
Большинство ферментов, участвующих в биосинтезе ГСЛ, локализовано на цитоплазматической стороне мембраны ЭТТР. Последними стадиями биосинтеза ГСЛ являются дополнительные модификации Сахаров: сульфатация, эпимеризация и ацилирование.
Интенсивность метаболизма ГСЛ неодинакова в разных тканях. Очевидно, что для полноценного функционирования этих соединений необходима не только высокая скорость их синтеза, но и деградации.
Деградаций ГСЛ осуществляется в лизосомах набором лизосомных гидролаз, в число которых входят гликозидазы и сульфогидролазы. Эти ферменты осуществляют специфический ступенеобразный процесс гидролиза, начиная с невосстанавливаюшего фрагмента гликана, отщепляя по одному моносахариду на каждой стадии. Продукт каждой ферментной реакции является субстратом следующей реакции (рис. 4) (Sandhoff and Kolter, 1996; Sandhoff and van Echten, 1993; van Echten and Sandhoff, 1993).
Показано, что ферменты, осуществляющие синтез и гидролиз ГСЛ, имеют активаторные протеины, представляющие гликосфинголипиды гликогидролазам для деградации в лизосомах (Li, Li, 1976). In vivo некоторые гидрофобные гликосфинголипидные субстраты становятся доступны для гидролиза только при соединении со специфическими некаталитическими "активаторными" протеинами, которые действуют как биологические детергенты. Образующиеся в результате ГСЛ-гликопротеи новые комплексы являются субстратами соответствующих гликозидаз. Исключение составляет активатор глюкоцереброзида, который является кофактором этого фермента (Furst, Sandhoff, 1992; Sandhoff et al, 1992),
Молекулярные механизмы этиологии и патогенеза БГ
Первичный биохимический дефект при БГ обусловлен наследственной недостаточностью активности p-D-глюкоцереброзидазы (лизосомной гидролазы) контролирующей деградацию природного гликосфинголипида глюкозилцерамида на церамид и глюкозу (рис. 5). Таким образом, основной патогенетический механизм, ведущий к формированию клинического фенотипа болезни Гоше, состоит во внутрилизосомном накоплении субстрата блокированной ферментной реакции, как это свойственно всем лизосомным болезням накопления. При этом концентрация глюкозилцерамида в плазме, клетках печени, селезенки и мозга увеличивается в 2 - 100 раз и более по сравнению с нормой. Но это повышение не коррелирует с типом болезни Гоше (Kennaway and Woolf, 1968; French et al, 1969; Dawson and Oh, 1977; Nilsson and Svennerholm, 1982b).
Минорным, но патогенетически значимым, производным глюкозилцерамида является глюкозид ефи нгозин - его деацилиро ванный аналог. Это токсическое сфингоидное основание, по-видимому, играет большую роль в патогенезе болезни Гоше, особенно в нейронопатических формах (Nilsson and Svennerholm, 1982а). Повышенные концентрации глюкосфингозина найдены в коже и мозге больных со II и Ш типом БГ, также как в мозге и коже knock-out мышей гомозиготных по нулевому аллелю БГ. 2.3.2.1 .Патологические метаболиты БГ.
Тканевая локализация патологических метаболитов при болезни Гоше различна. При I типе БГ преимущественное накопление глюкозилцерамида у симптоматических больных ограничено макрофагами. Вероятно, это объясняется тем, что лизосомный аппарат макрофагов становится особенно чувствительным к накоплению глюкозилцерамида вследствие эндоцитозного поглощения апоптотических и стареющих клеток крови, которые богаты этим гликосфинголипидом (Beutler and Grabowski, 1995). Так называемые "клетки Гоше" это и есть макрофаги, цитоплазма которых заполнена лизосомами с негидролизованным глюкозилцерамидом. Они накапливаются во всех тканях, но преимущественно в печени, костном мозге и селезенке, что соответствует таким симптомам, как гепатомегалия, спленомегалия, панцитопения и поражения скелета. Содержание глюкозилцерамида в селезенке превышает норму в 10 - 1000 раз и сопровождается фибронекротическими изменениями и образованием фиброваскулярных узлов (Suzuki, 1982; Barranger end Ginns, 1989). Незначительное периваскулярное накопление "клеток Гоше" в пространствах Вирхова-Робина головного мозга, характерное для нейронопатических форм БГ, наблюдается и при типе I заболевания, что, однако, не имеет существенного патогенетического значения. 23.2.2. Патогенные маркеры БГ.
У пациентов с I типом БГ как в тканях, так и в плазме был найден ряд вторичных нарушений в концентрации липидов и белков. Большое количество исследований было посвящено измерению этих параметров у больных до и после спленэктомии с целью определения их клинической значимости и поиска дополнительных патогенных маркеров, определяющих тяжесть заболевания, его клинический полиморфизм и позволяющих контролировать эффективность ФЗТ.
Некоторые из этих веществ могут непосредственно продуцироваться клетками накопления и их предшественниками, отражая степень нагруженности организма "клетками Гоше", т.е. тяжесть заболевания. Другие (цитокины) могут влиять на клиническое проявление болезни путем их биологического действия.
Тканевые аномалии при разных типах болезни Гоше включают 2-10 кратное увеличение уровня активности нескольких лизосомных гидролаз: Р-гексозаминидазы; (ї-глюкуронидазьі; галактоцереброзидазы; тартрат-резистентной кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы (Aerts et al, 1990).
Аномалии концентраций липидов, ферментов и белков плазмы систематически изучены только для типа I БГ. Активность печеночной трансаминазы и щелочной фосфатазы часто повышаются при болезни Гоше, что коррелирует с увеличением печени (Zimran et al, 1992).Также нередко в плазме больных увеличивается активность некоторых лизосомных гидролаз (ангиотензинконвертирующего фермента и лизоцима) (Silverstein and Friedland, 1977; Zimran et al, 1992; Leiberman and Beutler, 1976). Наиболее патогенетически значимым является повышение активности тартрат-резиетентной кислом фосфатазы, которая, как полагают, происходит из "клеток Гоше" и их предшественников различной тканевой локализации (Schindelmeiser et al, 1991). Кроме того, описаны аномалии факторов свертывания крови и фибринолитических факторов. У 30 - 60% больных коагуляционные факторы XI-XII-VII-X-V-II были снижены более чем на 50%, особенно у больных с выраженной спленомегалией. Хотя тенденция кровоточивости обычно связана со степенью тромбоцитопении, сниженные уровни коагуляционных факторов увеличивают склонность к геморрагическому диатезу (Berrebi et al, 1992; Billet et al, 1996; Hollak etal, 1997a).
Болезнь Гоше может ассоциироваться сразу с моноклональными и олигоклональными гаммопатиями (Pratt et al, 1968), что, как полагают, связано с неспецифической стимуляцией В-клеток, возможно, стимулированных цитокинами макрофагов. Поскольку макрофаги играют важную роль при развитии воспаления и иммунного ответа, при БГ исследуется их спектр цитокинов (Gcry et al, 1981). Результаты носят противоречивый характер (van Oers et al, 1993; Michelakakis et al, 1996; Hollak et al, 1997b). С уверенностью можно констатировать только увеличение продукции интерлейкина 8, продуцируемого макрофагами и другими клетками, функция которого при БГ остается неясной (Hollak et al, 1997b).
У многих пациентов снижается концентрация тотального холестерина и липопротеинов низкой и высокой плотностей в плазме, что, видимо, связано (частично) с повышением катаболизма липопротеинов макрофагами (Ginsberg et al, 1984; Le et al, 1988). Достаточно распространенной аномалией является увеличение ферритина в сыворотке больных, которое связывают с высоким уровнем высвобождения ферритина клетками Гоше, или их моноцитарными предшественниками (Bassan et al, 1985). Увеличение уровня кобаламина II в плазме, часто ассоциирующееся с болезнью Гоше, еще не нашло своего патогенетического объяснения (Gilbert and Weinreb, 1976).
Характеристика выборки обследованных больных
С 1982 г, в лаборатории наследственных болезней обмена веществ человека МГНЦ РАМИ осуществляется программа профилактики лизосомных болезней накопления, основанная на взаимодействии с медико-генетическими консультациями страны (Краснопольская и др., 1992). В ходе реализации этой программы постнатальная диагностика БГ была осуществлена у 86 пациентов, и пренатальная - у 4 плодов из трех семей с БГ.
Из 152 пациентов с направляющим диагнозом БГ биохимическими методами, включавшими измерение активности В-глюкоцереброзидазы лейкоцитов и активности хитотриозидазы плазмы, диагноз БГ был подтвержден у 86. ДНК-анализ был проведен у 55 пациентов из 52 семей, имеющих одного или несколько больных с БГ. Пациентами являлись 25 мужчин и 30 женщин в возрасте от 8мес. до 62 лет. У 49 пациентов из 55 диагностированных проявился I тип БГ (неневрологический), у 6 пациентов - II и III типы. Клинический фенотип у пациентов с I типом БГ варьировал. На основании клинического описания у 2 пациентов была определена легкая форма заболевания, у 47 пациентов -промежуточная, а 6 пациентов со II и III типами БГ отнесли к тяжелой форме заболевания. Клинический фенотип у 47 пациента с промежуточной формой заболевания варьировал. Для легкой формы были характерны более поздний возраст манифестациии заболевания (на 3-5 десятилетии), умеренная спленомегалия, нормальная или близкая к норме формула крови. Для тяжелой формы была характерна ранняя манифестация (на 1-2 году жизни), массивная гепатоспленомегалия часто с явлениями гиперспленизма, тяжелая анемия, тромбоцитопения, лейкопения, гипотрофия, тяжелые нарушения скелета, задержка или регрессия психомоторного развития. Для пациентов со средней тяжестью заболевания было характерно появление первых клинических признаков на 1-2 десятилетии жизни, гепатоспленомегалия, гематологические нарушения, анемия различной степени тяжести, частые носовые кровотечения, изменения костной ткани, отставание в физическом развитии.
Пациенты были направлены из г.г. Апшеронска, Владимира, Волгограда, Вологды, Воронежа, Ижевска, Йошкар-Олы, Курска, Москвы, Самарканда, Саратова, Петербурга, Тюмени, Воронежской, Калужской, Кировской, Московской, Нижегородской, Пензенской, Псковской, Саратовской, Свердловской, Тверской, Тюменской, Челябинской, Ярославской областей, Приморского края, Ставропольского края, Башкирии.
Активность P-D-глюкозидазы была измерена в лейкоцитах 152 пациентов с направляющим диагнозом БГ, их родителей и контрольной группы. Только у 86 пациентов ее активность была аномально низкой (0 - 4,2 нМ/мг/ч), что подтвердило диагноз. Средние значения активности p-D-глюкозидазы рассчитанные для этих трех групп приведены в таблице №12, и они не противоречат литературным данным (Galjaard, 1980).
Анализ распределения значений активности фермента в исследуемых группах и проверка согласия эмпирического распределения с теоретическим нормальным законом, проведенный с помощью критерия согласия Колмогорова — Смирнова для сложной гипотезы (Тюрин, Макаров, 1998), показал нормальное распределение значений активности фермента в группе гетерозигот и отличное от нормального распределения в контрольной группе и в группе пациентов с БГ (табл. 13; рис. 9-11).
Поскольку в данной ситуации оценку статистической значимости отличий распределения активности p-D-глюкозидазы между исследуемыми группами нельзя проводить на основании критерия Стьюдента или х2, то использовали непараметрический критерий Уилкоксона для двух независимых выборок, который показал их достоверное отличие друг от друга (табл. 14).
Статистический анализ соответствия остаточной активности p-D-глюкозидазы степени тяжести БГ был невозможен из-за малого числа пациентов с легкой и тяжелой клиническими формами, но наши результаты показывают, что при тяжелой клинической форме возможна высокая статочная активность фермента (пациенты Т5 и Т6), а при легкой форме - низкая (пациент Л2), 3.2.2.2. Активность хитотриозидазы (XT).
Учитывая, что значения активности p-D-глюкозидазы у пациентов с БГ и носителей БГ могут перекрываться, в качестве дополнительного маркера БГ начиная с 1997г. в плазме всех пациентов, направляемых в лабораторию, а также а контроле измеряется активность XT. Повышенные значения активности XT могут являться маркерами не только БГ, но и других ЛБН (табл.15). Однако у пациентов с другими лизосомными патологиями возрастание активности XT наблюдается не во всех случаях и/или не достигает таких высоких значений, как у пациентов с БГ.
Значения активностей XT полученные для контрольной группы, группы облигатных гетерозигот (родителей пациентов) и группы пациентов с БГ приведены в таблице № 16. У пациентов с БГ активность XT была повышена во всех случаях, кроме одного (0,3 нМ/мл/ч).
Гено-фенотипические корреляции
В 1970 г. Beutler и Kuhl разработали метод измерения активности кислой P-D-глюкозидазы с использованием флуоресцентного субстрата (Beutler & Kuhl, 1970). После идентификации в 1994г. маркерного фермента - хитотриозидазы - был также разработан метод измерения этого фермента в плазме человека (Guo et al, 1995). Основываясь на предложенных методах и используя в качестве субстрата для кислой p-D-глюкозидазы 4-МУФ-Р-0-глюкопиранозид (Sigma) и в качестве субстрата для XT 4-МУФ- р-0-Ы,Ы,,К"-триацегилхитотриозид (Sigma), в нашей лаборатории были апробированы и используются методики измерения активностей данных ферментов. Активность обоих ферментов измерялась не только в группе потенциальных пациентов с БГ, но также в контроле и в группе облигатных гетерозигот. Статистический анализ данных установил достоверное снижение активности p-D-глюкозидазы и возрастание активности XT плазмы у пациентов с БГ по сравнению с контролем и облигатными гетерозиготами.
Результаты статистического анализа значений активности XT в группе пациентов с БГ и облигатных гетерозигот показали, что в случае пограничной активности p-D-глюкозидазы диагноз БГ подтверждает повышенное значение активности XT.
Таким образом, используемый метод биохимической диагностики, основанный на параллельном измерении активности кислой p-D-глюкозидазы в клетках крови и XT в плазме крови, безусловно, является значимым для диагностики БГ.
В обследованной выборке пациентов с БГ значения остаточной активности р-D-глюкозидазы часто не соотносились с тяжестью клинической картины, например, Л2, СТ36, СТ35, Т5 (приложение 2). Эти наблюдения противоречат теории Conzelmann и Sandhoff(1991) о существующей взаимосвязи остаточной активности фермента и тяжести клинической формы (Conzelmann, Sandhoff, 1991). Видимо, объяснить это противоречие можно, вспомнив работу Beutler с соавторами 1976г (Beutler et al, 1976). Исследуя активности нескольких гидролаз в различных группах лейкоцитов у пациентов с БГ и здоровых индивидов, авторы показали, что значения активности p-D-глюкозидазы в моноцитах, лимфоцитах и гранулоцитах различаются; активности этого фермента внутри одного морфологического типа лейкоцитов нестабильны; активность p-D-глюкозидазы зависит от физиологического состояния пациента. Поэтому авторы рекомендовали для получения точных значений, измерять активность фермента в объединенной порции крови, собранной в течение 24 ч.
Поскольку в рутинной диагностике исследование проводится в разовых пробах венозной крови, то на показатель активности p-D-глюкозидазы должны влиять несколько факторов: отклонение гемограммы пациента от нормы, стабильность фермента, физиологическое состояние пациента
В 1994 Hollak с соавторами (Hollak et al, 1994) показали, что возрастание активности XT определяется накоплением глюкоцереброзида в «клетках Гоше». Обнаруженную нами взаимосвязь значений активности XT и возраста пациентов можно объяснить процессом накопления негидролизованного субстрата. При сравнении результатов биохимической диагностики прослеживается тенденция к увеличению прироста активности XT при уменьшении значений остаточной активности P-D-глюкозидазы у пациентов с одинаковым генотипом (например, пациенты СТ26, СТ4, СТ36 и СТ32, СТ28, СТ10)(приложение 2). Если значение прироста активности XT рассматривать как скорость накопления субстрата, то можно сказать, что у пациентов с низкой остаточной активностью p-D-глюкозидазы скорость накопления глюкоцереброзида выше, чем у пациентов с высокой остаточной активностью, 3.3.2. Молекулирно-генетическая диагностика.
Молекулярно-генетический анализ гена БДГ был начат в 1987г. К началу данного исследования было идентифицировано более 100 мутаций. За последние семь лет обнаружено еще около 50 мутантних аллелей гена БДГ, обуславливающих возникновение различных клинических форм БГ. Молекулярный анализ гена БДГ значительно затрудняет наличие пБДГ идентичного на 97% функциональному гену, а также возможность образования кроссоверных мутаций между ними.
ДНК-анализ гена БДГ у 55 пациентов с различными формами БГ позволил идентифицировать 16 мутаций, 7 из которых ранее не были описаны. 12 из обнаруженных мутаций представляют собой 9 транзиций и 3 трансверсии в транслируемой области гена БДГ, ведущие к аминокислотным заменам, одна из них является нонсенс-мутацией. Одна мутация представляет собой делецию 55 пн в 9 экзоне гена БДГ, приводящую к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного кодона терминации в середине 9 экзона. Две мутации образованы по типу рекомбинации между геном и псевдогеном в 6 и 10 экзоне.
Среди семи новых мутаций W381X приводит к образованию стоп-кодона и преждевременной терминации, следовательно, является патогенной. Замены Р236Т, L288P, L288Q, P319S и A384D можно считать патогенными, поскольку у этих пациентов не было найдено других мутаций ни внутри кодирующего региона, ни внутри интрон/экзонных границ, ни в 5 - или З1-нетранслируемых регионах. В аллеле rec(g4355-4430) 6 экзона содержатся замены W184R, N188K, V191G, S196P, G202R и F213I, соответствующие нормальной последовательности псевдогена. Это предполагает образование данной мутации путем рекомбинации между геном и псевдогеном. Однако у больного СТ41 этот аллель находится в комплексе с N370S, и W184R. Можно предположить, что он образовался в результате кроссинговера между участками мутантного гена и псевдогена. Однако в настоящее время более точное исследование провести невозможно, поскольку ДНК одного из родителей недоступна, а другой является носителем только частой мутации N370S. Описания нескольких пациентов с комплексом мутаций происходящих не из псевдогена приведены в работах Eal et al, 1991; Grace et al, 1999 и Hodanova et al, 1999.
