Введение к работе
Актуальность проблемы Согласно современным представлениям, микроорганизмы в естественных условиях обитания, в том числе населяющие организм человека, характеризуются пространственной обособленностью; генотипической и фенотипической гетерогенностью, определяющей дифференцирование клеток в процессе развития популяции; а также целостностью микробного сообщества, что объясняется наличием у них интегральных свойств. Именно поэтому при достаточно высокой плотности популяции, контролируемой системой «чувства кворума» (Quorum Sensing), микробные сообщества способны активно реагировать на различные изменения окружающей среды (, 1995; Fuqua W.C., 1996; Miller M.B., 2001; Surette M. G., 1999; Winzer K., 2002; Иерусалимский И.Д., 1952; Вахитов Т.Я., 2006; Рыбальченко О.В., 2006). Как правило, колонизация различных биотопов макроорганизма осуществляется путем образования микробных сообществ, чаще всего в виде биопленок (Шапиро Д.А., 1988; Романова Ю.М., Гинцбург А.Л., 2011). Основными свойствами микробных сообществ являются: изоляция от окружающей среды поверхностной структурой, содержащей мембраноподобные компоненты; образование внеклеточного матрикса; наличие межклеточных контактов, кооперация и дифференциация микроорганизмов (Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М. и соавт., 2008). Такая организация микроорганизмов способствует более совершенной регуляции процессов их жизнедеятельности, по сравнению с независимо существующими бактериальными клетками, и выработке единого ответа на внешние воздействия (Олескин А.В., 2000; Бабусенко Е.С. 1992; Бухарин О.В., Гинцбург А.Л. и соавт., 2005; , С. и соавт., 2003; Николаев Ю.А., 2000). В частности, подобное устройство микробных сообществ обеспечивает повышенную выживаемость микроорганизмов в присутствии факторов иммунной защиты и антимикробных препаратов (Олескин А.В., Ботвинко И.В. и соавт., 2000; , 2005; Кузнецов О.Ю. 2005).
Исследование бактериальных клеток как составных элементов микробных сообществ началось сравнительно недавно. В значительной степени этому способствовали разработка и усовершенствование методов электронно-микроскопического анализа, позволяющих получить информацию не только о структуре микробных сообществ и морфо-функциональных особенностях бактериальных клеток в их составе in situ, но и описать механизмы взаимодействия микроорганизмов как между собой, так и с субстратом, на котором они развиваются (Рыбальченко О.В., 2004). До настоящего времени наиболее пристально исследовали микробиоценозы желудочно-кишечного тракта в норме и при патологии. Разработаны электронно-микроскопические методы, позволяющие исследовать структуру микробных сообществ кишечника непосредственно в естественных условия их обитания. Также разработан комплекс эффективных терапевтических методов для коррекции дисбиотических состояний кишечника с использованием бактериоциногенных штаммов микроорганизмов (Beno Y., Mitsuoka T., 1986; Bernhardt H., Knoke M., 1989; Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., 2008).
Несмотря на то, что кожа человека также обширно населена различными видами микроорганизмов, бактерии, колонизирующие кожу, до настоящего времени исследовали и описывали как дискретные единицы (Noble W.S., 1993; Петровская В.Г., Марко О.П., 1976). Электронно-микроскопического исследования микробных сообществ кожи в совокупности со средой их обитания не проводили.
Одной из наиболее перспективных моделей для изучения микробных взаимодействий в коже можно считать атопический дерматит (АД) – заболевание, которое характеризуется дисрегуляцией клеточного звена иммунитета и гиперчувствительностью к специфическим и неспецифическим стимуляторам. Характерной особенностью АД является колонизация кожного покрова клетками Staphylococcus aureus (S. aureus) в чрезвычайно высокой плотности (Мокроносова М.А., 1999; Brook I., Frazier E.H. и соавт., 1996; Lever R., Hadley K. и соавт., 1988). У 60% больных обнаруживается стабильная ассоциация стафилококков и стрептококков (David T.Y. и соавт., 1986). Среди возбудителей поверхностной грибковой инфекции у пациентов с АД чаще высевают Candida albicans, Trichophyton rubrum и Malassezia furfur (Арзуманян В.Г., 2001; Кочетова Ю.А., Гриненко Е.Е. и соавт., 2003; Мокроносова М.А., 1999). Считают, что причина изменения микробного пейзажа кожи при АД с преобладанием условно-патогенной микрофлоры заключается в комплексном нарушении функции эпидермиса, прежде всего, физического и иммунного компонента кожного барьера (Chamlin S.L., Kao J. и соавт., 2002).
Данные ультраструктурного анализа микробных сообществ в коже, определение видового состава ее микробиоты в совокупности с определением функциональных свойств кожи при АД позволят установить закономерности взаимодействия бактерий как внутри сообществ, так и с клетками макроорганизма.
Цель исследования:
Комплексный сравнительный анализ морфофизиологических особенностей микробиоты и функционального состояния эпидермального барьера кожи при атопическом дерматите.
Задачи исследования:
-
Исследовать функциональное состояние эпидермального барьера кожи у здоровых лиц и при атопическом дерматите, анализируя показатели трансэпидермальной потери воды (ТЭПВ), гидратации рогового слоя (ГРС) и продукции антимикробных пептидов (кателецидинов и дефенсинов).
-
Провести сравнительную оценку качественного и количественного состава микробиоты кожи здоровых лиц и пациентов с АД.
-
Провести сравнительный анализ чувствительности выделенных штаммов S. aureus к антимикробным препаратам.
-
Провести сравнительное электронно-микроскопическое исследование морфофизиологических свойств и ультраструктурных особенностей микроорганизмов в коже здоровых лиц и при АД.
-
Оценить влияние на барьерную функцию и микробный пейзаж кожи при АД средств наружной терапии, восстанавливающих липидный барьер эпидермиса.
Научная новизна работы
Впервые при исследовании кожи в совокупности с населяющими ее микроорганизмами использован модифицированный электронно-микроскопический метод для характеристики морфофизиологических свойств бактериальных клеток in vivo.
Впервые получены данные об особенностях расположения и о морфофизиологических свойствах микроорганизмов в эпидермисе здоровой кожи и при АД. Установлено, что:
- клетки, колонизирующие роговой слой эпидермиса здоровых людей и пациентов с АД, относятся к различным морфологическим типам;
- в здоровой коже преобладают физиологически неактивные, пребывающие в состоянии покоя и лизированные формы микробных клеток;
- у пациентов с АД кожу колонизируют интактные физиологически активные микробные клетки, образующие скопления в виде сообществ различной величины и численности;
- в ряде случаев бактериальные клетки у пациентов с АД окружены комплексом дополнительных защитных структур в виде биополимерного матрикса и поверхностной пленки, которые могут создавать дополнительный барьер на пути антибактериальных препаратов и факторов иммунной защиты. Впервые в коже пациентов с АД прослежены и проиллюстрированы на электронограммах этапы формирования микробных сообществ.
Получены новые данные о физиологических свойствах эпидермального барьера кожи у здоровых лиц и больных АД, ассоциированные с трансэпидермальной потерей воды, гидратацией рогового слоя и продукцией антимикробных пептидов (кателецидинов и дефенсинов). Продемонстрировано, что на фоне применения средств, восстанавливающих липидный барьер эпидермиса, происходит не только нормализация показателей функционального состояния эпидермиса, но и изменение микробного пейзажа кожи у пациентов с АД, проявляющееся появлением представителей сапрофитной микробиоты.
Практическая значимость
Определены основные показатели состояния барьерной функции эпидермиса у пациентов с АД - гидратация рогового слоя и трансэпидерматльная потеря воды, которые наряду с показателем SKORAD могут быть применены для оценки степени тяжести заболевания с целью повышения объективизации и стандартизации клинического исследования.
Впервые проведено комплексное исследование видового состава микробиоты кожи при АД с использованием высокотехнологичных методов, характеризующихся высокой чувствительностью и специфичностью - бактериологического анализатора. Установлено, что кожа здоровых лиц и пациентов с АД имеет сходный видовой спектр микробиоты. При АД в качественном и количественном отношении преобладает S. aureus, в здоровой коже – сапрофитные виды стафилококков и коринебактерий. Установлено, что клетки штаммов S. aureus, выделенные от пациентов с АД, характеризуются устойчивостью ко многим антибактериальным препаратам, включая макролиды, аминогликозиды и метициллин, при этом их особенностью является полирезистентность. Доля МРСА среди мультирезистентных штаммов стафилококков достоверно выше при АД по сравнению с контролем (33% и 17%, соответственно; p<0,05). Клетки всех выделенных чистых культур стафилококков чувствительны к ванкомицину и фузидиевой кислоте.
Исследована динамика функциональных показателей состояния барьерной функции эпидермиса на фоне наружной терапии, способствующей репарации липидного барьера кожи при АД. Показаны варианты изменения показателей ТЭПВ и ГРС в зависимости от механизма действия средств наружной терапии. Анализ данных показателей в динамике дает объективную оценку процессу восстановления барьерной функции кожи на фоне лечения. Продемонстрировано, что использование средств наружной терапии должно быть комплексным и включать на начальных этапах лечения препараты с окклюзионным механизмом действия, с дальнейшим назначением средств с эффектом «глубокого увлажнения».
Исследована динамика микробного пейзажа на фоне использования средств наружной терапии, включающей препараты для восстановления эпидермального барьера. Показано, что восстановление функции кожного барьера сопровождается снижением обсемененности кожи S. aureus и появлением сапрофитных штаммов стафилококков.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Нарушения кожного барьера при АД проявляются снижением ГРС и увеличением ТЭПВ, что свидетельствует об изменении физического компонента эпидермального барьера, а также снижением продукции антимикробных пептидов, которое обусловливает нарушение антимикробного барьера. С увеличением степени тяжести АД возрастают значения ТЭПВ и снижается ГРС, что указывает на взаимосвязь степени выраженности патологического процесса в коже и функционального состояния эпидермиса.
2. При АД в качественном и количественном соотношении преобладает S. aureus, в здоровой коже – сапрофитные виды стафилококков (78%, lg КОЕ 102,3) и коринебактерий (39%, lg КОЕ 102,9, p<0,05), что свидетельствует о нарушении колонизационной резистентности кожи при АД, проявляющемся в замещении экологической ниши сапрофитных микроорганизмов условно-патогенными видами. Кроме того, стафилококки, выделенные от пациентов с АД, обладают полирезистентностью: большинство штаммов устойчивы к 3 и более препаратам одновременно. Полирезистентные штаммы, устойчивые к метициллину (МРСА), определены в 33% проб при АД. Все выделенные чистые культуры стафилококков чувствительны к ванкомицину и фузидиевой кислоте.
3. В коже здоровых лиц и в коже пациентов с АД обнаружены различные морфологические типы бактериальных клеток. Ультратонкая организация бактериальных клеток свидетельствует о различном уровне их физиологической активности. В здоровой коже преобладают физиологически неактивные, покоящиеся и лизированные формы микробных клеток. В коже пациентов с АД микроорганизмы представлены физиологически активными бактериальными клетками. Образование комплекса дополнительных защитных структур (биополимерный матрикс и поверхностная оболочка) свидетельствует о достапточно высоком уровне организации бактериальных биопленок микробных сообществ.
4. Для стойкого и эффективного восстановления эпидермального барьера необходимо последовательное использование средств с разным механизмом действия: окклюзионным в первые дни и глубокого увлажнения в последующем. При данной терапии происходило снижение обсемененности кожи S. aureus и появление в составе микробного пейзажа представителей сапрофитной микробиоты (S. chromogenes и S. epidermidis).
Реализация работы
Результаты исследования используются в практической работе дерматологических отделений ГУЗ «Городской КВД» (СПб., Набережная реки Волковки, д. 3) и медицинского центра «Прайм Роуз» (СПб., ул. Савушкина, д. 115, корп. 4), а также в учебном процессе курса общей и медицинской микробиологии и курса дерматовенерологии медицинского факультета ФГОУ ВПО «СПбГУ» Правительства Российской Федерации.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были представлены на II Всероссийском Конгрессе дерматовенерологов (СПб., 2007); II международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения - 2007" (СПб., 2007); XI и XII Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей "Человек и его здоровье" (СПб., 2008, 2009); III Санкт-Петербургских дерматологических чтениях (СПб., 2009); III Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Казань, 2009); II Форуме Медицины и Красоты (Москва, 2009); I и II Санкт-Петербургском Конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Невские Берега» (СПб., 2010, 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 3 в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций; иллюстрирована 17 таблицами, 22 электронограммами и 29 рисунками. Библиографический указатель включает в себя 201 источник (54 - отечественных авторов и 147 - зарубежных).
