Введение к работе
Актуальность проблемы Цептромерный район является одним из наиболее важных структурно-функциональных доменов эукариотическои хромосомы По современным представлениям, центромеры необходимы для образования веретена деления, когезии сестринских хроматид и контроля над безошибочным расхождением хромосом (Choo, 2001, Sumner, 2003) Они также участвуют в пространственной организации генома в интерфазном ядре, формировании хромоцептров и регуляции экспрессии генов Для центромерных районов характерно присутствие гегерохроматина, образованного центромерными и прицентромерными сателлитными ДНК, и формирование так называемой первичной перетяжки в метафазных хромосомах Несмотря на огромную функциональную значимость центромерных районов, многие вопросы, касающиеся особенностей их структурной организации и функционирования в мейоцитах высших эукариот, в частности на протяжении длительной профазы женского мейоза, остаются открытыми Исследование роли центромер в регуляции поэтапного расхождения сестринских хроматид в ходе мейотических делений, их участия в образовании специализированных внутриядерных телец во время роста ооцита и в пространственной организации хромосом в период его созревания представляется актуальным
В растущих ооцитах многих животных хромосомы имеют специфическую организацию активная транскрипция приводит к их декомпактизации и преобразованию в так называемые ламповые щетки (Callan, 1986) Благодаря гигантским размерам и характерному хромомерно-петлевому строению хромосомы в форме ламповых щеток представляют собой удобную систему для изучения структуры мейотических бивалентов, организации эу- и гетерохроматина, механизмов регуляции транскрипции и ко-трапскрипционного процессиига РНК и др (Morgan, 2002) Ламповые щегки являются перспективной модельной системой, позволяющей с высоким уровнем разрешения исследовать структурно-функциональную организацию центромерных районов хромосом в мейоцитах (Macgregor et al, 1997)
Центромерные районы хромосом на стадии ламповых щеток имеют ряд характерных морфологических особенностей Так, с центромерными районами ламповых щеток у большинства исследованных видов птиц ассоциированы специфические структуры - так называемые белковые тела (Гагинская, Грузова, 1969, Гагинская, 1972, Solovei et al, 1996, Saifitdinova et al, 2003) Происхождение и состав этих структур остаются неизвестными, так же как и их роль в организации центромер во время мейоза (Morgan, 2002, Sumner, 2003)
Описаны случаи, когда па поздних этапах оогенеза центромерные белковые тела участвуют в образовании кариосферы, объединяющей конденсированные хромосомы в небольшом пространстве в ядре ооцита (Гагинская, 1972) Актуальность исследования молекулярных компонентов кариосферы в оонигах разных животных диктуется появлением в литературе новых данных о значении ее формирования для правильного расхождения гомологичных хромосом в мейозе I и для инактивации генома (De La Fuente et al , 2004, Ivanovska et al , 2005)
В центромерных районах ламповых щеток также обнаружена массивная транскрипция тандемно повторяющихся последовательностей ДНК (Baldwin, Macgregor, 1985, Barsacchi-Pilone et al, 1986, Solovei et al, 1996), значение которой не вполне понятно Исследование этого явления заслуживает особого внимания в связи с обнаружением роли некодирующих транскриптов центромерных районов в эпигенетических модификациях генома (Almedia, Allshire, 2005) и регуляции динамики факторов процессиига РНК (Prasanth, Spector, 2007)
Динамика факторов, обеспечивающих транскрипцию и процессинг вновь синтезированных РНК, связана с функционированием специализированных внутриядерных телец, таких как тельца Кахала (ТК), БС35-домены (кластеры интерхроматиновых гранул, КИГ), тельца гистоновых локусов и др, которые в растущих ооцитах особенно многочисленны и имеют относительно большие размеры (Gall et al, 2004) Неоднократно высказывалось мнение о том, что ассоциированные с ламповыми щетками белковые тела выполняют функции ТК и/или КИГ в ооцитах птиц (Грузова и др, 1995, Morgan, 2002), однако, возможная гомология этих структур требует специального исследования
До недавнего времени цитологические и молекулярно-биологические исследования хромосом типа ламповых щеток проводили преимущественно на нескольких видах амфибий, а внутриядерные домены ооцитов изучали в основном на примере амфибий и насекомых Сравнительные исследования в этой области с привлечением более широкого круга обьектов представляются перспективными Среди теплокровных только представители кл Птицы обладают крупными ооцитами с ярко выраженными ламповыми щетками Следует отметить, что белковый состав центромериых районов хромосом типа ламповых щеток в ооцитах разных животных, в том числе амфибий и птиц, практически не исследован (Gall, 1992, Macgregor et al, 1997), каких-либо универсальных молекулярных маркеров для центромериых районов хромосом этого типа не найдено (Edwards, Murray, 2005) Вместе с тем, выявление таких маркеров может быть чрезвычайно полезным для составления щпогенетических карт и для определения положений центромер с высокой степенью разрешения
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы было исследование морфофункционалыюй организации центромериых районов хромосом на стадии ламповых щеток и при формировании кариосферы в ооцитах птиц В конкретные задачи работы входило
Провести анализ молекулярного состава центромериых белковых тел на ламповых щетках птиц в сравнении с молекулярным составом известных внутриядерных доменов - телец Кахала и кластеров интерхроматиновых гранул
Исследовать распределение белков структурного поддержания митотических и мейотических хромосом (ДНК топоизомеразы II, белков когезии сестринских хроматид и белков синаптонемного комплекса) на ламповых щетках и в ассоциированных с их центромерными районами белковых телах
Изучить состав центромериых белковых тел на разных стадиях формирования кариосферы в ооцитах зяблика Frmgilla coelebs
Выявить маркеры центромериых районов хромосом типа ламповых щеток у птиц отряда Galliformes, лишенных морфологически выраженных белковых тел
Картировать с высокой степенью разрешения центромеры на хромосомах домашней курицы (Gallns gal/as doinesticus) и японского перепела (Coturnix cotutnix japonicd), используя ламповые щетки
Исследовать белковый состав хроматина и уровень метилирования ДНК в центромериых районах хромосом на стадии ламповых щеток
Научная новизна работы. Впервые определены белки, входящие в состав центромериых белковых тел на хромосомах в растущих ооцитах птиц Показано, что центромерные белковые тела, как на стадии ламповых щеток, так и в составе остова кариосферы, обогащены ДНК топоизомеразой II, белками комплекса когезин и белком латерального элемента синаптонемного комплекса, но не содержат компонентов аппарата транскрипции, сплайсинга и З'-процессинга РНК Полученные данные свидетельствуют о принадлежности центромериых белковых тел к новому, не
описанному ранее, типу внутриядерных доменов Впервые показано, что белковые тела являются универсальными структурами, маркирующими центромерные районы хромосом-ламповых щеток у всех исследованных видов птиц Получены доказательства гомологии центромерных белковых тел на ламповых щетках птиц и осевых гранул на ламповых щетках амфибий С помощью выявленных маркеров центромерных районов ламповых щеток впервые определены положения центромер во всех макро- и микрохромосомах на стадии ламповых щеток у курицы и перепела, показано, что большинство микрохромосом в кариотипе японского перепела - двуплечие Впервые получены прямые экспериментальные доказательства того, что транскрипцию прицентромерных сателлитных последовательностей ДНК на стадии ламповых щеток осуществляет РНК-полимераза II Впервые показано участие белков комплекса когезин, белка латерального элемента синаптонемного комплекса и белка гетерохроматина HPip в поддержании хромомерно-петлевой структуры хромосом на стадии ламповых щеток
Теоретическое и практическое значение работы. Работа имеет фундаментальное значение полученные данные вносят существенный вклад в представления о структурно-функциональной организации центромерных районов хромосом и о разнообразии внутриядерных доменов в мейоцитах
В работе получены новые результаты по физическому картированию с высокой степенью разрешения центромерных районов хромосом для двух сельскохозяйственно-важных видов птиц (домашней курицы и японского перепела), которые могут быть использованы в проектах по секвенированию их геномов В настоящей работе уточнено положение центромерного района в сборке секвенированных последовательностей хромосомы 3, соответствующие изменения предложено внести в международные базы данных по секвенированному геному курицы
Материалы диссертации используются в курсах лекций и в программе практических занятий для студентов бакалавриата и магистратуры кафедры цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета СПбГУ
Апробация работы. Результаты работы были представлены на XIV и XV Всероссийских симпозиумах «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2002, 2005), IV Европейской конференции по цитогенетике (Болонья, Италия, 2003), III съезде ВОГИС (Москва, 2004), XV международной конференции по организации хромосом (Лондон, Англия, 2004), XIX международной конференции имени Вильгельма Бернарда по биологии клеточного ядра (Вюрцбург, Германия, 2005), международной EMBO/FEBS конференции по строению и динамике клеточного ядра (Монпелье, Франция, 2005), XVII Европейском коллоквиуме по цитогенетике животных и картированию генов (Лиссабон, Португалия, 2006), и на научных семинарах Лаборатории структуры и функции хромосом Биологического НИИ СПбГУ
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 5 статей и 11 тезисов
Финансовая поддержка работы Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 02-04-49116, 05-04-48252), Министерства образования и науки РФ (проект # 37483) и при технической поддержке ЦКП «Хромас» при Биологическом НИИ СПбГУ
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их
обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 3>2. источников
Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит Ц таблиц и
![Активность ядрышкообразующих районов хромосом в популяции жителей Курской обл. [Электронный ресурс]](/i/i/4366/192794.png "Активность ядрышкообразующих районов хромосом в популяции жителей Курской обл. [Электронный ресурс] Амелина Ирина Валерьевна")
