Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Общие сведения об иннервации сердца человека и экспериментальных животных 11
1.1.1. Архитектоника иннервации сердца 11
1.1.2. Топография и характеристика внутрисердечных холинергических ганглиев 13
1.1.3. Нейрохимические маркеры внутрисердечных нейронов 17
1.2. Краткая характеристика синтаз оксида азота 19
1.3. Современные представления о локализации синтаз оксида азота в нервных клетках. Сайт-специфичность влияния N0 23
1.4. Морфология нейронов, иммунореактивных к NOS, в сердце крысы...27
1.5. Физиологическое значение синтаз оксида азота в вегетативных нейронах, иннервирующих сердце 29
1.5.1. Значение NOS в парасимпатических нервных клетках и терминалях сердца 29
1.5.2. Роль NO для симпатических нервных волокон 33
1.5.3. NO-ергическая модуляция центральных отделов вегетативной нервной системы 34
1.5.4. Потенциальное биомедицинское значение N0S1, экспрессирующейся в интрамуральных ганглиях сердца 34
1.6. Влияние гипертрофии, ишемии и физической нагрузки на экспрессию синтаз оксида азота в сердце 35
Глава 2. Материал и методы 37
2.1. Материал исследования 37
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Реагенты 39
2.2.2. Локализация внутрисердечных ганглиев 40
2.2.3. Окрашивание по Нисслю 41
2.2.4. Определение АХЭ по методу Карновского - Руте 42
2.2.5. Определение активности NADPH-диафоразы 43
2.2.6. Иммуногистохимическое окрашивание 44
2.2.7. Анализ препаратов, морфометрия и статистическая обработка данных 45
Глава 3. Результаты собственных исследований 47
3.1. Характеристика внутрисердечных ганглиев 47
3.2. NADPH-диафораза во внутрисердечных ганглиях 48
3.3. Иммуногистохимическое определение NOS1 во внутрисердечных ганглиях человека 49
3.4. Влияние ИБС на активность NADPH-d в ганглиях сердца человека .50
3.5. Окрашивание смежных срезов внутрисердечных ганглиев на NADPH-d, АХЭ, по Нисслю и гематоксилином-эозином 55
Глава 4. Обсуждение результатов 73
4.1. Организация нервных ганглиев у человека, кошки и крысы 74
4.2. NADPH-d во внутрисердечных ганглиях в норме 74
4.3. Иммуногистохимическое выявление NOS1 у человека 76
4.4. Влияние ИБС на активность NADPH-d/NOS в ганглиях сердца человека 76
4.5. Окрашивание смежных срезов внутрисердечных ганглиев на NADPH-d, АХЭ, по Нисслю и гематоксилином-эозином 78
Выводы 80
Литература 81
- Современные представления о локализации синтаз оксида азота в нервных клетках. Сайт-специфичность влияния N0
- Влияние гипертрофии, ишемии и физической нагрузки на экспрессию синтаз оксида азота в сердце
- Окрашивание смежных срезов внутрисердечных ганглиев на NADPH-d, АХЭ, по Нисслю и гематоксилином-эозином
- Влияние ИБС на активность NADPH-d/NOS в ганглиях сердца человека
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Как известно, в настоящее время заболевания сердечно-сосудистой системы являются наиболее часто встречающейся причиной смерти человека. Поэтому любые подходы к их лечению сейчас весьма актуальны. Современная фармакологическая терапия сердечно-сосудистых заболеваний имеет своей мишенью главным образом либо мышечные клетки сердца (блокаторы кальциевых каналов, сердечные гликозиды, (3-блокаторы, нитраты), либо гуморальные системы регуляции сосудистого тонуса (ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, нитраты).
Перспективным, но недостаточно разработанным направлением в данной области, является воздействие на нервные сплетения сердца - естественную и сложноорганизованную систему активной регуляции его работы и трофики. Одной из предпосылок фармакологического воздействия на нервные клетки является знание их нейрохимической специализации.
Данная работа посвящена изучению фермента, продуцирующего один из важных мессенджеров внутрисердечных нейронов - оксида азота (N0). Благодаря способности проникать через мембрану, оксид азота способен выступать как внутри- (вторичный), так и межклеточный мессенджер, при этом малое время существования свободной молекулы в цитозоле [Ванин, 1998b] ограничивает зону его действия, что обеспечивает высокоспецифичность NO-ергической регуляции, даже в пределах одной клетки [Barouch et al., 2002; Herring et al., 2002; Paton et al., 2002; Mohan et al., 2004]. В качестве вторичного посредника оксид азота нарабатывается практически во всех типах клеток сердца [Champion et al., 2003; Massion et al., 2003], однако в нервных клетках, влияющих на работу органа в целом, роль NOS представляется особенно важной в качестве мишени потенциального терапевтического воздействия. Недавние исследования как на культурах клеток, так и in vivo, подтверждают, что основной вклад NO-ергического влияния на сердце происходит через внутрисердечные нервные структуры. Показано, что культивирование кардиомиоцитов совместно с нервными клетками увеличивает реактивность их сократимости к внесению доноров NO [Horackova et al., 1995, 1996]. На органном уровне изменения ЧСС под действием ингибиторов NOS происходят в основном за счет модуляции выделения нейротрансмиттеров из симпатических и парасимпатических окончаний [Choate et al., 2001; Herring, Paterson, 2001; Herring et al., 2002; Mohan et al., 2000, 2004; Schwarz et al., 1995].
Отметим также, что влияние нитратсодержащих препаратов на деятельность сердца также связано с их воздействием на регуляторные каскады NO в нервных клетках [Мазур, 2003; Чазов, 2004].
Цель и задачи работы:
Целью настоящей работы является выявление синтазы оксида азота в нервных ганглиях сердца человека, изучение ее содержания и распределения в этих структурах в норме и при ишемической болезни сердца.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Выявить наличие NOS гистохимическим методом в ганглиях сердца человека и кошки, описать ее распределение и архитектонику NOS-содержащих нейронов.
2. Оценить размеры популяции NOS-содержащих нейронов в сердце человека в норме.
3. Иммуногистохимическим методом определить наличие NOS1 во внутрисердечных ганглиях человека.
4. Разработать количественный подход оценки активности NOS во внутрисердечных ганглиях.
5. Описать распределение синтазы оксида азота и количественно оценить ее содержание в ганглиях сердца человека в норме и при ИБС.
Научная новизна и теоретическое значение работы:
В работе впервые показано наличие NO-синтазы в нервных клетках сердца человека. Впервые описано распределение фермента в пре- и постганглионарном звене парасимпатического отдела вегетативной нервной системы. Описано также влияние ИБС на экспрессию NOS во внутрисердечных ганглиях. Согласно полученным данным, доля NOS-содержащих нейронов в сердце у человека превышает таковую у исследованных экспериментальных животных. Практическая значимость работы связана с потенциальным использованием нервных сплетений сердца в качестве мишени фармакологического воздействия с целью модуляции деятельности этого органа. Межвидовые различия и отсутствие NO-синтазы в преганглионарном звене у крысы являются важным субстратом для экспериментального тестирования фармакологических препаратов. Кроме того, разработан подход для селективной локализации нервных ганглиев в сердце человека, что позволяет уменьшить расход реактивов для гисто- и иммуногистохимических процедур.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Во внутрисердечных ганглиях человека и кошки экспрессируется синтаза оксида азота.
2. Во внутрисердечных нейронах у человека NOS солокализована с ацетилхолинэстеразой (АХЭ).
3. При ишемической болезни сердца у человека, если не происходит дистрофических процессов, приводящих к поражению нервных клеток, во внутрисердечных ганглиях усиливается экспрессия NOS.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 34 рисунками, содержит 6 таблиц и 7 диаграмм. Диссертация изложена на 103 страницах, список литературы включает 191 источник.
Апробация работы и публикации.
Материалы работы доложены на всероссийской научной конференции «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы» 22-24 октября 2003 года (Москва), V Общероссийском съезде анатомов гистологов и эмбриологов 17-18 сентября 2004 г. (Казань), VII конгрессе международной ассоциации морфологов 16-18 сентября 2004 г. (Казань), IV Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар), конференции «Достижения и трудности современной кардиологии» 18-19 мая 2005 г. (Москва), Всероссийской конференции молодых ученых-кардиологов «Достижения отечественной кардиологии» 1-2 июня 2005 г. (Москва), 1-ом Международном междисциплинарном конгрессе «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии» 10-21 июня 2005 года (Судак, Крым, Украина).
Публикации:
По тематике диссертации опубликовано две статьи в центральных Ф рецензируемых журналах, одна статья в сборнике и 9 тезисов докладов.
Современные представления о локализации синтаз оксида азота в нервных клетках. Сайт-специфичность влияния N0
Электронно-микроскопические исследования показали, что в нервных клетках NOS1 локализуется в различных клеточных мембранах, включая дендритные шипики и окончания, аксонные терминали и эндоплазматический ретикулум [Rothe et al., 1998; Aoki et al., 1993].
Нейроны, содержащие NOS, найдены в различных областях центральной и переферической нервной системы [напр. в мозжечке и в энтеральной нервной системе; см. Vincent, Норе, 1992]. В нейронах NOS экспрессируется конститутивно, преимущественно в цитозоле и ее активность полностью определяется наличием кальция/кальмодулина и нуждается в присутствии NADPH в качестве кофактора [Moncada et al., 1991; Schmidt et al., 1993; Vincent, 1994]. Это стало очевидно, когда был разработан гистохимический метод определения активности NADPH-диафоразы, выявляющий наличие NOS в нейронах. В настоящее время во многих исследованиях распределения NO-ергических нейронов использована NADPH-диафоразная реакция с нитротетразолиевым синим, который окрашивает нейроны, генерирующие NO в качестве сигнальной молекулы [Aimi et al., 1991; Belai et al., 1992; Grozdanovic et al., 1992; Hassall et al., 1993; Saffreyetal., 1994].
Ряд исследований, посвященных NADPH-d/NOS-содержащим нейронам внутрисердечных ганглиев млекопитающих, показывает, что N0 возможно играет важную роль в сердце в качестве нейронального мессенджера [Hassall et al., 1992; Klimaschewski et al., 1992; Tanaka et al., 1993a, b]. Только 4% внутрисердечных нейронов крысы, но большее количество у морской свинки, иммунореактивно к NOS, а их окрашенные нервные волоконца найдены во внутрисердечных ганглиях, ткани пейсмейкеров, в коронарной сосудистой системе и миокарде [Hassall et al., 1992; Klimaschewski et al., 1992; Tanaka et al., 1993a; Sosunov et al., 1995]. На электронно-микроскопическом уровне можно наблюдать, как синапсы NOS-содержащих нервных волокон охватывают нейроны, позволяя видеть контуры и неокрашенных клеток [Tanaka et al. 1993b]; ультраструктура тел NADPH-d/NOS-содержащих внутрисердечных нейронов морской свинки описана А.А. Сосуновым [Sosunov et al., 1996].
Активность NOS 1 является наиболее высокой в зернистых клетках коры мозжечка и в астроглии [Охотин, Куприянов, 1996]. При выполнении нейротрансмиттерных функций, N0S1 находится на плазматической мембране, куда транслоцируется из цитозоля. Такая ультраструктурная локализация облегчает выделение N0 в межклеточное пространство. В нервных терминалях, N0S1 ассоциирована с постсинаптическим уплотнением-95 (PSD95), связанным с NMDA-подтипом глутаматных рецепторов, обеспечивающих прямой путь ионам кальция через NMDA-каналы к NOS1. В цитозоле присутствует растворимый белок CAPON, который как и PSD95 связывается с PZD-доменом NOSl [Jaffrey et al., 1998]. Комплекс NOSl - CAPON не взаимодействует с PSD95, что говорит об участии CAPON в дислокации NOS1 от мембранных источников кальция и, следовательно, уменьшении ее нейротрансмиттерной активности.
Наличие данного механизма свидетельствует о том, что несмотря на газообразную природу N0 и способность молекулы проникать через билипидный слой мембраны, NO-ергическая регуляция в клетке четко разграничена. Стимулом для развития представлений о сайт-специфичности внутриклеточного влияния N0 послужило открытие в кардиомиоцитах нейрональной конститутивной изоформы NOS [Xu et al., 1999], в дополнение к эндотелиальной N0S3. Таким образом, в нормальных условиях в клетке могут сосуществовать несколько изоформ NOS, однако их локализация приурочена к различным субклеточным компартментам. Так, например, в кардиомиоцитах N0S3 локализована в кавеолах внешней плазмалеммы [Feron et al., 1997], где N0, нарабатываемый этой изоформой, ингибирует приток Са в составе токов L-типа [Callo et al., 2001; Han et al., 1996; Massion et al., 2003]. NOSl ассоциирована с мембранами саркоплазматического ретикулума и влияет на внутриклеточный цикл Са [Ashley et al., 2002; Sears et al., 2003]. Эти исследования, выполненные на кардиомиоцитах, легли в основу концепции о внутриклеточной компартментализации NO-синтаз [Barouch et al., 2002] и сайт-специфичности влияния NO [Herring et al., 2002]. Эти представления согласуются с физико-химическими данными полученными в лаборатории А.Ф. Ванина, согласно которым в такой химически активной и гетерогенной среде как цитозоль дистанция диффузии свободного NO ограничена [Ванин, 1998b]. Одной из молекул, связывающей (скавенджеров N0) является растворимая гуанилатциклаза, посредством которой запускаются регуляторные каскады системы NO-цГМФ. В нейронах сердца как показано ниже, механизмы сайт-специфичного влияния обеспечивают NO-ергическую модуляцию пресинаптического выделение нейротрансмиттеров.
В нервных клетках возможна также экспрессия индуцибельной изоформы NOS. Существует много данных, указывающих на участие N0, наработанного этой изоформой, в ранней дифференцировке нейронов [Poluha et al., 1997; Peunova, Enikolopov, 1995; Obregon et al., 1997; Phung et al., 1999; Nakagawa et al., 2000]. Хорошо известна также роль NOS2 в различных аспектах роста и развития [Bloch et al., 1999; Arany et al., 1996; Kim et al., 1998]. В раннем онтогенезе в обонятельных нейронах мыши из всех изоформ NOS обнаружена только NOS2 [Arnhold et al., 1997]. Наличие NOS2 на ранних стадиях развития не ассоциировано с присутствием гуанилатциклазной системы вторичного мессенждера, что говорит о независимоти функций N0 от цГМФ в данный период. Хотя в нормальных условиях NOS2 отсутствует в мозге, с возрастом возможно ее появление в некоторых отделах органа. У стареющих (24 месячных) крыс, в неокортексе обнаружены NOS2-HMMyHopeaKTHBHbie нейроны [Uttenthal et al., 1998]. У животных этого возраста наблюдается увеличение активности тотальной NOS и количества протеина NOS2, но не NOS1, по сравнению с молодыми (1 месячными) и взрослыми (3-х месячными) особями. Увеличение уровня NOS2 происходило на фоне уменьшения связываемости лигандов с NMDA-рецепторами, ровно как и снижения количества самих рецепторов. Этот факт свидетельствует о возможной нейротоксичности NOS2, которая вызывает понижение обучаемости у старых животных. Однако такие исследования не позволяют установить точную клеточную локализацию NOS2, которая может также находится в глиальных клетках [Vemet et al., 1998]. Кроме того, NOS2 обнаружена в лицевых моторных нейронах взрослых (6-10 месячных) крыс [Jacob et al., 1999]. В этих клетках экспрессия NOS2, наоборот, уменьшена у старых (22-26 месячных) животных. Однако появление значительных количеств NOS2 в центральной нервной системе наблюдается только при повреждении нервных клеток, например перерезке нервов [Heneka, Feinstein, 2001].
Влияние гипертрофии, ишемии и физической нагрузки на экспрессию синтаз оксида азота в сердце
Известно влияние NO на симпатическую нейротрансмиссию в различных сосудистых препаратах; однако объяснение этих пре- и постсинаптических эффектов остается спорным. В хвостовой артерии крысы [Bucher et al., 1992], в каудальной артерии крысы [Vo et al., 1992], в легочной артерии кролика [Shinozuka et al., 1992] и в височной артерии собаки [Toda et al., 1991] ингибиторы NOS усиливают вазоконстрикцию в результате электрической стимуляции, но не способны увеличить выделение норадреналина. С другой стороны, для легочных артерий и вен собаки [Greenberg et al., 1989] и брыжеечной артерии собаки [Greenberg et al., 1990], было показано, что N0 ослабляет выделение норадреналина на пресинаптическом уровне. Другими исследователями было показано пре- и постсинаптическое действие N0 в почечной симпатической нейротрансмиссии [Egi et al., 1994].
В сердце крысы N0, нарабатываемый агранулярными поддерживающими клетками, описан как дополнительный медиатор, способный выделяться совместно с гистамином и усиливать влияние норадреналина через пресинаптическое облегчение Нг-гистаминовых рецепторов на симпатических нервных терминалях [Fuder et al., 1994].
Известно также, что ингибиторы NOS усиливают увеличение ЧСС под влиянием симпатических нервов [Mohan et al., 2000; Mohan, Paterson, 2000]. Причиной этого является снижение выделения норадреналина симпатическими нервными волокнами [Mohan et al., 2004; Paton et al., 2002; Schwarz et al., 1995]. Предполагается, что в основе молекулярного механизма этого явления лежит РОЕ2-зависимое усиление гидролиза цАМФ, что приводит к ослаблению активации Са -каналов N-типа, ослаблению поступления Са в цитозоль окончания при наступлении потенциала действия и ослаблению экзоцитоза везикул с норадреналином (рис. 1.5).
В дополнение к модуляции периферического вегетативного контроля ЧСС, все больше становится данных в пользу того, что NO играет роль в интеграции стволовыми структурами мозга как афферентного вклада, так и базального рефлекторного вегетативного влияния. NO усиливает активность стимуляторных нейронов ядра одиночного пути (NTS) и С-волокон нервных клеток дорсального моторного ядра блуждающего нерва, которые, как считается, оказывают тоническое замедляющее действие на ЧСС и участвуют в образовании вагусного тона. Соответственно, введение в эту зону ингибиторов NOS1 приводит к гипертензии и тахикардии. Однако, N0 ослабляет и барорефлексы, повышающие ЧСС, хотя механизмы этого неизвестны. Paton et al. [2001] недавно сообщили, что стимуляция N0S3 в нейронах NTS усиливает тормозное ГАМК-ергическое влияние, подавляющее вагусные сердечные барорефлексы. Хотя как N0 влияет на центральный контроль парасимпатического влияния на сердце неизвестно, все больше данных говорит в пользу того, что N0 с одной стороны усиливает тонус вагуса, а с другой - ослабляет барорефлекторное влияние блуждающего нерва, направленное на повышение артериального давления через дифференциальные изоформ- и сайтспецифичные механизмы противопоставлена проаритмогенным эффектам сильных симпатических стимулов, она является естественным природным кальциевым антагонистом. Хорошо известно, что высокий тонус блуждающего нерва является хорошим прогностическим фактором против внезапной сердечной смерти. Изменения в экспрессии NOS1 или гуанилатциклазы могут приводить к нарушению симпатовагусного баланса и вероятно имеют большое патофизиологическое значение. С ослаблением NO-цГМФ-ергической сигнализации и генерацией супероксид-анионов и пероксинитрита ассоциирована гипертензия. Эти же причины могут вызывать ослабление выделения ацетилхолина и таким образом привести к снижению вагусного тонуса, проявляющемся в виде гипертензии. Физические тренировки ассоциированы с усилением реактивности ЧСС к вагусной стимуляции и существенным усилением экспрессии NOS1 в предсердиях. При этом важно отметить, что вагусная брадикардия, вызванная тренировками, может быть доведена до значений нетренированных животных с помощью ингибиторов NOSl [Danson et al., 2001].
В нервных клетках сердца влияние экспериментальной гипертрофии миокарда на экспрессию синтазы оксида азота изучено у крыс [Тищенко и др., 2002]. Разрушение коркового вещества почек при помощи инъекции формалина через 8 недель приводило к достоверному увеличению доли NADPH-d-позитивных внутрисердечных нейронов крысы.
В миокарде сердца ишемические поражения приводят прежде всего к резкому усилению экспрессии NOS2, которая в этих условиях присутствует не только в клетках иммунной системы, но также в мышечных и нервных волокнах [Heneka, Feinstein, 2001; Schulz et al., 1992; Fukuchi et al., 1998].
Физические упражнения приводят к усилению экспрессии эндотелиальной NOS в коронарных сосудах [Sessa et al., 1994], и нейрональной NOS в симпатических ганглиях сердца [Mohan et al., 2000]. На функциональном уровне N0 приводит к усилению воздействия стимуляции блуждающего нерва на частоту сердечных сокращений, как in vitro [Sears et al. 1998; Herring et al., 2000], так и in vivo [Elvan et al., 1997; Conlon, Kidd, 1999]; действуя изоформ- и сайтспецифично NO через посредство цГМФ облегчает холинергическую нейротрасмиссию в сердце [Herring, Paterson, 2001]. Во внутрисердечных парасимпатических ганглиях NOS1 солокализована с холинацетилтрасферазой [Calupca et al., 2000; Choate et al., 2001] и у мышей без NOSl ослаблено влияние стимуляции блуждающего нерва на ЧСС, но эта гипореактивность исчезает при аппликации АХ [Choate et al., 2001]. Напротив, NOS3 кардиомиоцитов играет незначительную роль в автономной регулиции возбудимости сердца на периферическом уровне [Vandecasteele et al., 1999; Brunner et al., 2001], что подтверждает ведущую роль NOSl, локализованной пресинаптически в нейронах блуждающего нерва, в холинергической модуляции ЧСС. В работе [Danson, Paterson, 2003] было показано, что функциональные изменения вагусной нейротрансмиссии в сердце мыши, вызываемые физической нагрузкой, обусловлены усилением экспрессии NOS1. Таким образом, NOS1 может определять нейрональный статус «тренированного» сердца.
Окрашивание смежных срезов внутрисердечных ганглиев на NADPH-d, АХЭ, по Нисслю и гематоксилином-эозином
При ИБС у человека наблюдалось повышение активности NADPH-d в ткани ганглия. Однако при наличии гипертрофии миокарда увеличения активности NOS не происходило, вследствие нарушения трофики нервных элементов. Среди нейронов, выявленных реакцией на NADPH-d, при гипертрофии была увеличена доля слабоокрашенных перикарионов, что может свидетельствовать либо о появлении NOS в перикарионах, не продуцирующих NO в норме, либо об ослаблении экспрессии конститутивной NOS, вследствие дегенеративных процессов.
Анализ распределения активности NOS по ганглию показал, что увеличение происходит главным образом за счет стромы ганглия. Появление NOS в этих структурах можно связать с индукцией NOS2 под действием цитокинов [Torre-Amione et al., 1996] в телах нейронов и в олигодендроцитах или клетках-сателлитах, находящихся в строме ганглия. Эта изоформа NOS, присутствуя в норме только в иммунных клетках, является кальций-независимой и продуцирует большие концентрации NO. Есть данные, что при развитии организма NOS2 участвует в формировании нервной системы [Heneka, Feinstein, 2001], однако во взрослом организме высокие концентрации N0 являются одним из индукторов апоптоза [Champion et al., 2003; Massion et al., 2003].
Ослабление реактивности к NADPH-d являлось, по-видимому, следствием общих дегенеративных процессов, происходящих в сердцах с большой массой (сердечный индекс которых превышал 0.007). Об этом свидетельствует также морфология нейронов, которые обладают размытой границей клетки, пикнотичны, или наоборот отечны [Hopkins et al., 2000]. Отметим, что масса всех сердец в группе с сердечным индексом большим 0.007 превышала 500 г. В 1950 Дж. Линзбачем (J. Linzbach) было установлено, что при гипертрофии сердечной мышцы этот вес является критическим и при дальнейшем его увеличении гипертрофические процессы в миокарде сменяются гиперплазическими [Francis, 1999; Linzbanch, 1960]. При этом исчерпываются водможности микроциркуляторного русла по обеспечению адекватной перфузии мышечной ткани, что приводит к нарушению трофики. Таким образом, при ИБС имеется тенденция к повышению экспрессии NOS во внутрисердечных ганглиях, если не происходят нарушения трофики нервных клеток.
Окрашивание смежных срезов на выявление NADPH-d и по Нисслю, а также на выявление АХЭ и по Нисслю показало, что как крезиловый фиолетовый, так и толуидиновый синий у человека не позволяют выявить все перикарионы нейронов на срезе. Причиной этого может быть дезинтеграция гранулярного эндоплазматического ретикулума [Жаботинский, 1953; Goncharuk, 1994]. Известно что красители, используемые в методе Ниссля, базофильны по своей природе и связываются прежде всего с рибосомами и нуклеиновыми кислотами в ядрах клеток. В нейронах они выявляют так называемую субстанцию Ниссля, которая представляет собой участки шероховатого ретикулума. В некоторых функциональных состояниях, в том числе при воздействии различных стрессогенных факторов, происходит отделение рибосом от внутренних мембран и такой нейрон либо не выявляется, либо представляет собой бледноокрашенную структуру. Следует отметить, что у белой крысы на препаратах окрашенных по Нисслю видны очертания практически всех нейронов, о чем можно судить по плотной и равномерной заполненности ганглия на срезе телами нервных клеток, однако наблюдается значительная вариабельность интенсивности окрашивания. Можно предположить, что причиной того, что в сердце человека прокрашиваются не все тела нейронов, является худшая сохранность секционного материала. Однако четкой взаимосвязи между количеством выявляемых нейронов и временем, прошедшим между смертью и фиксацией ткани, не наблюдалось. Значительная часть нейронов не выявлялась уже при взятии материала через 4 часа после смерти. В то же время на материале, полученном даже спустя 24 часа после смерти, выявлялись и тела нейронов, и ядра клеток-сателлитов, и тучные клетки. Кроме того, структура окрашенных по Нисслю нейронов соответствовала данным литературы [Жаботинский, 1953]. Прокрашиваемость других структур, особенно ядер клеток-сателлитов и тучных клеток также мало изменялась при взятии материала в течение двух суток после смерти. Таким образом, для секционного материала метод Ниссля остается простым и информативным способом выявления и изучения нервных структур, однако для определения общего числа нервных клеток на срезе его использование затруднительно.
В ганглиях сердца человека по нашим данным NOS солокализована с АХЭ; таким образом NOS-содержащие нейроны обладают холинергическим фенотипом и относятся к парасимпатическому отделу вегетативной нервной системы. Эти данные позволяют предположить, что у человека, как и у мыши [Choate et al., 2001], NO служит внутриклеточным модулятором выделения АХ парасимпатическими нервными терминалями (рис. 1.5). В пользу участия N0 во внутрисердечной парасимпатической нейротрансмиссии свидетельствует также наличие активности NOS в перицеллюлярных аппаратах, окружающих нейроны в ганглиях.
Таким образом, у человека в норме NO-ергическая модуляция внутрисердечного нервного аппарата, учитывая высокое содержание NOS в ганглиях, имеет большое значение. При патологии, по-видимому, преобладают цитотоксические влияния N0, которые на поздних стадиях гипетрофических процессов в миокарде, вероятно вносят свой вклад в поражение нервных клеток.
Влияние ИБС на активность NADPH-d/NOS в ганглиях сердца человека
Как показывают данные литературы и собственные результаты ганглиозный аппарат сердца разных видов обладает значительными морфологическими, топографическими и нейрогистохимическими различиями. При наличии патологии органа у человека, нервные узлы чутко реагируют на нее, при этом быстро и в значительной степени изменяются их гистохимические и морфологические параметры. Эти данные косвенно свидетельствуют о важной роли нервного аппарата в регуляции деятельности сердечной мышцы и полностью укладываются в концепцию нервизма.
Как известно, нервизм - идея о преимущественном значении нервной системы в регулировании функции и процессов в организме животных и человека. Понятие было введено в 1883 г. И.П.Павловым и «своими корнями уходят в исследования И.М. Сеченова» (БСЭ т. 17, с. 504, Москва, из-во Советская энциклопедия, 1974) Эту идею развил в клинике профессор СП. Боткин. Создав учение о высшей нервной деятельности, Иван Петрович Павлов писал: «...чем совершенней нервная система животного организма, тем она централизованней, тем высший ее отдел является все в большей степени распорядителем и распределителем всей деятельности организма... этот высший отдел держит в своем ведении все явления, происходящие в теле» (Поли. собр. трудов, т. 1, 1940, с. 410). Сегодня следует признать целесообразными представления не только о нейрогуморальной регуляции органов и тканей, но следует также учитывать, что на клеточном уровне регуляторные процессы идут с участием вторичных мессенджеров, одним из которых, как было показано в последние годы, является монооксид азота.
При препаровке ткани сердца и поиске ганглиев мы опирались на данные литературы [Armour et al., 1997; Johnson et al., 2004; Richardson et al., 2003], и полученные результаты полностью им соответствуют. Самые крупные ганглии и по линейным размерам и по количеству нейронов наблюдались у человека. Наименее развит ганглиозный аппарат был у кошки и между ними по размерам ганглиев находится крыса. Таким образом, нет прямой взаимосвязи между размером организма и количеством и/или размерами внутрисердечных интрамуральных ганглиев.
В литературе также кописаны найденные нами двуядерные нервные клетки, про которые имеются данные, что они очень редко, но встречаются в ганглиях сердца человека [Жаботинский, 1953]
По нашим подсчетам в норме у человека около 40% нейронов обладают реактивностью к NADPH-d. Этот показатель превышает таковой у крысы (4%) [Klimaschewski et al., 1992], морской свинки (20-36%) [Klimaschewski et al., 1992; Tanaka et al., 1993a], собаки (30-40%) [Armour et al., 1995].
У кошки по нашим данным на NADPH-d в различной степени окрашиваются практически все нервные клетки. Однако в целом интенсивность их окрашивания меньше чем у человека, но больше чем у внутрисердечных ганглиев крысы.
Нами показано также, что NADPH-d содержится в перицеллюлярных аппаратах, окружающих нейроны сердца у человека. Эти структуры принадлежат аксонам преганглионарных нейронов [Calupca et al., 2000, 2002; Richardson et al., 2003]. На рис. 4.1 показано место перицеллюлярных
Окрашивание ганглиев сердца человека с помощью антител против NOS1, показало наличие этой изоформы во внутрисердечных нейронах. Однако доля нейронов в ганглии, выявляемых этим методом, была меньше чем при определении активности NADPH-d. Таким образом, в нервных клетках присутствуют также другие изоформы NOS. В литературе есть данные о возможности экспрессии в нервных клетках как индуцибельной, так и эндотелиальной изоформ NOS [Heneka, Feinstein, 2001]. NOS2 способна индуцироваться практически во все типах клеток, в том числе и нейронах, под действием таких цитокинов, как интерферон-у, интерлейкин-ір и фактор некроза опухолей а. Повышение уровня этих веществ обычно сопровождает сердечную недостаточность [Torre-Amione et al., 1996]. Поэтому наиболее вероятной представляется присутствие NOS2 в нервных клетках и строме ганглия при ИБС, хотя нельзя полностью исключить экспрессию NOS3.
При ИБС у человека наблюдалось повышение активности NADPH-d в ткани ганглия. Однако при наличии гипертрофии миокарда увеличения активности NOS не происходило, вследствие нарушения трофики нервных элементов. Среди нейронов, выявленных реакцией на NADPH-d, при гипертрофии была увеличена доля слабоокрашенных перикарионов, что может свидетельствовать либо о появлении NOS в перикарионах, не продуцирующих NO в норме, либо об ослаблении экспрессии конститутивной NOS, вследствие дегенеративных процессов.
Анализ распределения активности NOS по ганглию показал, что увеличение происходит главным образом за счет стромы ганглия. Появление NOS в этих структурах можно связать с индукцией NOS2 под действием цитокинов [Torre-Amione et al., 1996] в телах нейронов и в олигодендроцитах или клетках-сателлитах, находящихся в строме ганглия. Эта изоформа NOS, присутствуя в норме только в иммунных клетках, является кальций-независимой и продуцирует большие концентрации NO. Есть данные, что при развитии организма NOS2 участвует в формировании нервной системы [Heneka, Feinstein, 2001], однако во взрослом организме высокие концентрации N0 являются одним из индукторов апоптоза [Champion et al., 2003; Massion et al., 2003].
