Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Введени CLASS е 5
2 Обзор литературы 10
2.1. Структура вируса иммунодефицита человека 10
2.1.1. Морфология 10
2.1.2. Репликационный цикл 11
2.2. Интеграза ВИЧ-1 15
2.3. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1 18
2.3.1. Низкомолекулярные ингибиторы из природных источников 18
2.3.2. Синтетические гидроксилированные ароматические соединения 22
2.3.3. Природные пептиды 24
2.3.4. Сульфаты, сульфонаты и нуклеотиды -ингибиторы интегразы ВИЧ-1 26
2.3.5. Конкурентные необратимые ингибиторы интегразы 28
2.3.6. Дикетокарбоновые кислоты и их производные ..31
2.3.7. Компьютерное конструирование ингибиторов интегразы 34
3. Объекты и методы 39
3.1. Объекты 39
3.2. Методы 4 0
3.2.1. Валидация точности прогноза 42
3.2.2. Тестирование PASS на гетерогенной выборке химических соединений 4 5
3.2.3. Применение PASS для поиска новых биологически активных соединений 4 8
3.2.4. Методы экспериментального тестирования ингибиторов интегразы ВИЧ-1 in vitro 4 9
4 Результаты и обсуждение 51
4.1. Создание обучающей выборки 51
4.2. Обучение и валидация программы 64
4.3. Компьютерный поиск потенциальных ингибиторов 64
4.4. Тестирование отобранных веществ на антиинтегразную активность 66
4.5. Определение роли отдельных структурых участков в проявлении ингибиторной активности 71
5 Заключение 7 6
б. Выводы 77
7 Публикации по теме диссертации 7 8
8 Список литературы 81
- Ингибиторы интегразы ВИЧ-1
- Дикетокарбоновые кислоты и их производные
- Тестирование PASS на гетерогенной выборке химических соединений
- Компьютерный поиск потенциальных ингибиторов
Введение к работе
Актуальность темы. С момента регистрации первых случаев заболевания в 1981 году [Gottlieb et al. 1981; Masur et al. 1981; Siegal et al. 1981], к настоящему времени СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) входит в первую десятку наиболее опасных инфекционных заболеваний. Возбудитель СПИДа был идентифицирован в 1983 году [Gallo et al. 1983; Gelmann et al. 1983; Barre-Sinoussi et al. 1983], им оказался вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), относящийся к семейству ретровирусов [Змушко, Белозеров, 2000] . К 1986 г. начались клинические испытания первого антиретровирусного препарата зидовудина, а кульминацией этого направления стало создание комбинированной химиотерапии [Vella, Palmisano, 2000; Richman, 2001]. Несмотря на все принимаемые профилактические меры, число людей, инфицированных ВИЧ, неуклонно растет во всем мире [Jaffe, 2004]. По данным Объединенной программы ООН по СПИДу (UNAIDS) [], приведенным в ежегодном «Докладе о развитии эпидемии СПИДа», всего в мире к концу 2004 г. было инфицировано 39,4 млн. человек, впервые заражено в 2004 г. - 4,9 млн. человек, умерло от СПИДа за этот же год - 3,1 млн. человек. В России на конец 2004 г. официально зарегистрировано свыше 300 тысяч инфицированных, а согласно оценочным подсчетам количество инфицированных может составлять от 8 60 тысяч до 1 миллиона человек.
Существующие лекарственные препараты для терапии СПИДа обладают значительными недостатками [Cohen, 2002; Sabin et al., 2005] : 1) ко всем известным анти-ВИЧ препаратам возникает резистентность; 2) для них характерно наличие существенных побочных эффектов, обусловленных в том числе наличием в организме человека схожих макромолекул-мишеней; 3) зарегистрированные препараты имеют высокую стоимость.
В связи с этим актуальной проблемой является создание новых высокоэффективных лекарственных препаратов, направленных на подавление вирусной активности в организме. Одним из
наиболее перспективных направлений в настоящее время считается разработка ингибиторов интегразы ВИЧ-1 [De Clercq, 2004; Anthony, 2004; Pommier, et al. 2005]. Так как у интегразы нет родственных белков в организме человека, можно ожидать, что отрицательное влияние ее ингибиторов на пациентов в ходе лечения будет гораздо меньшим.
Процесс создания нового лекарственного препарата включает несколько этапов: 1) выбор макромолекулы-мишени; 2) поиск нового вещества с требуемой фармакологической активностью;
3) испытание его в эксперименте, то есть проведение
фармакологических и токсикологических исследований;
4) оптимизация свойств найденных базовых структур; 5) получение
разрешения уполномоченного органа (Фармакологический комитет
Министерства здравоохранения и социального развития РФ) и
проведение испытаний вещества в клинике; б) получение
разрешения на медицинское применение; 7) организация
производства и маркетинг препарата. Выбор мишени и поиск
базовых структур являются ключевыми этапами. В классическом
варианте поиска проводится синтез многочисленных соединений-
аналогов известного биологически активного вещества, проведение
длительных и дорогостоящих испытаний. При этом исследователь
замкнут в кругу представлений о структуре нового лекарства как
очередного представителя уже известной группы аналогов.
Применение на первом этапе методов компьютерного анализа и
прогноза позволяет преодолеть эти недостатки. Использование
методов компьютерного конструирования лекарств позволяет резко
сократить расходы и ускорить разработку новых препаратов за
счет уменьшения числа "холостых" синтезов и испытаний [Иванов,
Арчаков, 2000].
Учитывая значительный интерес к созданию новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1, представляется разумной попытка компьютерного поиска новых ингибиторов среди химических соединений из баз данных коммерчески доступных веществ. Можно надеяться, что компьютерный поиск потенциально активных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволит существенно повысить эффективность процесса разработки новых лекарственных препаратов за счет отсева
веществ, для которых заведомо прогнозируется низкая вероятность наличия данной биологической активности, либо с высокой вероятностью прогнозируются токсические эффекты.
Целью данной работы является поиск перспективных структур новых лекарств, ингибирующих интегразу ВИЧ-1 на основе компьютерного скрининга веществ из баз данных доступных образцов химических соединений.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
Создание обучающей выборки, включающей известные ингибиторы интегразы ВИЧ-1, для повышения точности компьютерного прогноза антиинтегразной активности. Обучение компьютерной программы PASS и оценка точности прогноза.
Определение элементов структуры в молекулах ингибиторов интегразы ВИЧ-1, положительно или отрицательно влияющих на проявление данной биологической активности.
Поиск и отбор наиболее перспективных потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 в БД коммерчески доступных образцов химических соединений.
Экспериментальное тестирование отобранных соединений на антиинтегразную активность и сопоставление полученных результатов с компьютерным прогнозом.
Положения, выносимые на защиту:
Показана возможность поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе прогноза их спектров биологической активности.
Определены особенности структуры ингибиторов интегразы ВИЧ-1, влияющие на проявление ими данной биологической активности.
Выявлено два новых соединения, ингибирующих интегразу ВИЧ-1 в экспериментах in vitro.
Научная новизна. Впервые создана база данных из 90 представителей ингибиторов интегразы ВИЧ-1, относящихся к классу ароматических производных дикетокарбоновых кислот. На
этой выборке веществ проведено обучение программы PASS, что позволило получить новый «инструмент» для прогнозирования данного вида биологической активности. Впервые показана возможность проведения компьютерного прогноза для химических соединений на определение ингибиторнои активности в отношении интегразы ВИЧ-1. Предложена оригинальная модель псевдо-фармакофора, определяющая структурно-важные участки молекул для данного вида биологической активности. Показано, что среди доступных образцов химических соединений есть вещества, которые с определенной вероятностью могут обладать ингибиторнои активностью в отношении интегразы ВИЧ-1. Выявлено два новых соединения, биологическое тестирование которых подтвердило, что они являются ингибиторами интегразы ВИЧ-1.
Научно-практическая значимость. Предложенный в настоящей работе подход к компьютерному поиску новых потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил отобрать и исследовать восемь новых химических соединений, для двух из которых ингибиторная активность в отношении интегразы ВИЧ-1 подтверждена в биологических экспериментах на рекомбинантном ферменте. Проведенный анализ взаимосвязей «структура-активность» расширяет представления исследователей об ингибиторах интегразы и, дополняя базу знаний, облегчает последующие попытки рационального поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Предложенный нами метод поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволяет существенно снизить временные и финансовые затраты при поиске новых базовых структур ингибиторов интегразы ВИЧ-1.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на следующих конференциях:
VII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2000.
VIII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2001.
II Российская конференция молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2001.
14th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships, Bournemouth, UK, 2002.
III Съезд биофизиков России, Воронеж, 2004.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и зарубежных научных изданиях. Из них 5 - статей и 6 - тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из 8 глав, содержащих введение, литературный обзор, описание объектов и методов исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы, включающего 105 источников. Диссертационная работа изложена на 93 страницах машинописного текста и содержит 7 рисунков и 10 таблиц.
Ингибиторы интегразы ВИЧ-1
Большое количество ингибиторов интегразы [Табл. 1) было получено из различных природных источников, таких как морские, растительные и грибные экстракты. Компанией Merck проведены работы по выделению активных метаболитов из микробных экстрактов. Результатом стало обнаружение нескольких потенциально активных веществ: интегразинов, интеграстатинов и интеграмицинов.
Серия димерных алкильных ароматических соединений, выделенных из Cytonaema sp. - интеграции А (1), интеграции В (2) и интеграции С (3) - ингибировали 3 -процессинг со значениями 1С5о равными 3,2 мкМ, 6,1 мкМ и 3,5 мкМ, соответственно [Singh et al., 2002а]. Эти вещества обладали в 10-30 раз большей селективностью в отношении 3 -процессинга, так как значения IC50 при ингибировании переноса цепи составляли уже 32 мкМ, 17 мкМ и 88 мкМ [Singh et al., 2002а].
Интеграстатины - новые тетрациклические ароматические гетероциклы поликетидной природы, выделенные из грибных экстрактов. Интеграстатины А (4) и В (5) ингибировали 3 -процессинг со значениями 1С5о 0,6 мкМ и 1,04 мкМ, перенос цепи со значениями 1С5о 1 1 мкМ и 2,5 мкМ [Singh et al., 2002b]. Их селективность к интегразе была в 5-10 раз выше, чем к ДНКазе.
Интеграмицины также представляют собой гексациклический природный продукт из Actinoplanes sp. Самый лучший из интеграмицинов (6) ингибировал 3 -процессинг с IC50 = 3 мкМ, а перенос цепи с 1С5о = 4 мкМ [Singh et al., 2002с].
Множество других природных продуктов, выделенных в основном из корней и листьев лекарственных растений, фруктов и специй, также проявляли антиинтегразную активность. Эти вещества относятся к классу таннинов. Сообщалось, что они проявляют ингибиторную активность по отношению к интегразе и многим другим ферментам. Например, сесквитерпены (алкалоиды из корней Lindera chunii) проявляли антивирусную активность [Zhang et al., 2002]. Наиболее активная молекула - лауролистин (7) - имела 1С5о 7,7 мкМ [Zhang et al., 2002]. Флавоны и флавоновые гликозиды, полученные из листьев Thevetia peruviana, также ингибировали интегразу [Tewtrakul et al., 2002]. Среди веществ данного ряда наиболее активными были вещества 8 и 9 (Табл. 1) . Они ингибировали интегразу с IC50 5 мкМ и 7 мкМ, а обратную транскриптазу с IC50 20 мкМ и 33 мкМ. Галлоил-глюкоза из Terminalia chebula и флаванол-гликозид галлаты из Euphorbia pekinesis также ингибировали 3 -процессинг в микромолярных концентрациях [Ahn et al., 2002]. Самое активное вещество - 1,3,6-три-0-гзначения аллоил-D-глюкопираноза (10) - имело ICso 13,7 мкМ.
В работе других авторов сообщалось о значительной антиинтегразной активности экстрактов, полученных из корней растения Salvia railtiorrhiza [Abd-Elazem et al., 2002]. Наиболее активны в отношении ингибирования 3 -процессинга были литоспермиевая кислота (11) и литоспермиевая кислота В (12), для которых значения 1С5о составляли 0,83 мкМ и 0,4 8 мкМ соответственно. Однако, для этих и всех других полигидроксилированных ароматических соединений характерны цитотоксичность и неспецифическое ингибирование многих других ферментов [Dayam, Nearaati, 2003]. Недавно синтезирована и исследована на антиинтегразную активность новая серия производных дикаффеоил-тертариевой кислоты (Табл. 2) [Reinke et al., 2002]. Наиболее активными были соединения 13-18. Так как эти вещества структурно очень сходны с L-цикориевой кислотой (24), то вероятно они обладают схожим механизмом действия. Установлено, что L-цикориевая кислота оказывает антивирусный эффект за счет блокирования вирусного проникновения в клетку [Pluymers et al., 2000].
Другим примером катехол-содержащих гидроксилированных ароматических соединений являются аналоги ламелларина [табл. 2). Наиболее активен был ламелларин Н (19), 1С5о 1 3 мкМ. Однако, несмотря на высокую антиинтегразную активность, он является неселективным ингибитором и, кроме того, обладает значительной цитотоксичностью [Ridley et al., 2002]. Эти данные совпадают и с более ранними результатами исследований гидроксилированных ароматических соединений на цитотоксичность [Stanwell et al., 1996; Mazumder et al., 1995].
В работе Дюпонта и соавторов были представлены 14 производных катехолов и бис-катехолов, синтезированных и исследованных на антиинтегразную активность [Dupont et al., 2001] . Наиболее активны были соединения 20-22, ингибировавшие реакцию 3 -процессинга со значениями 1С5о 1/3 мкМ, 2,1 мкМ и 13 мкМ соответственно [Dupont et al., 2001].
Неамати и соавторы при построении модели дикетокислотного фармакофора синтезировали и исследовали а-кетокислотное производное стирилхинолина (23) . Это соединение проявило определенную антивирусную активность в клеточных исследованиях (ЕС50 10 мкМ) и было почти полностью неактивным в отношении очищенной интегразы (1С5о более 100 мкМ), что позволяет предполагать наличие другой вирусной мишени для этой кетокислоты [Neamati et al., 1997].
Дикетокарбоновые кислоты и их производные
Ингибирование интегразы ВИЧ-1 ароматическими производными дикетокарбоновых кислот было выявлено при высокопроизводительном скрининге библиотек химических соединений [Hazuda et al., 2000]. Одно из производных дикетокарбоновых кислот (5-CITEP) удалось закристаллизовать с интегразой, что послужило в дальнейшем основой для применения метода поиска лекарств, основанного на структуре макромолекулы-мишени [Goldgur et al., 1999]. Недавно была предпринята попытка докинга в активный центр интегразы вещества S-1360, рассматриваемого в настоящее время в качестве наиболее перспективного кандидата нового лекарственного препарата [Long et al., 2004]. Докинг проводили с использованием программы GOLD (Genetic Optimization for Ligand Docking), где применяется генетический алгоритм для докинга гибких лигандов в активный центр фермента. Построение и оптимизацию структур лигандов проводили с использованием модулей Builder и Discover программного пакета Insight II (Accelrys, Inc.). Генерацию возможных конформаций осуществляли при помощи модуля catConf программного пакета Catalist (Accelrys, Inc.) с использованием алгоритма Полинга. Для определения активной конформаций S-13 60 все сгенерированные конформеры локировались в активный центр интегразы, при этом использовалась кристаллическая структура интегразы с 5-CITEP (идентификатор 1SQ4 в PDB). По результатам докинга S-1360 в активный центр расположение ингибитора существенно отличалось от расположения 5-CITEP в кристалле. S-1360 располагался в полости вблизи консервативных аминокислотных остатков D64 и D116, что почти перпендикулярно расположению 5-CITEP. Оказалось, что S-1360 в основном взаимодействует с остатками Asp64, Aspll6 и Asnl20, образуя с ними водородные связи. Хотя 4-фторбензильное кольцо S-1360 располагалось вблизи от Glnl52, никаких связей между ними не наблюдалось. Для всех связанных конформаций наблюдалось не менее двух координационных связей между кето-енольным атомом кислорода S-1360 и ионом Mg . Эти результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными по ингибиторнои активности S-1360. Совершенствуя в дальнейшем эту модель, авторы надеются подойти к созданию ингибиторов интегразы второго и третьего поколения [Long et al., 2004] .
В последние годы в литературе появились сообщения о попытках определения механизма ингибиторнои активности ранее открытых веществ. В частности, для этой цели применялись методы анализа количественных взаимосвязей структура-активность (QSAR), такие как сравнительный анализ молекулярных полей (CoMFA), сравнительный анализ индексов молекулярного сходства (CoMSIA), генетическая функциональная аппроксимация (GFA) [Makhija, Kulkarni, 2002], анализ собственных значений (EVA) [Makhija, Kulkarni, 2001] . Для изучения конформационной стабильности и особенностей строения активного центра интегразы применялись методы молекулярной динамики [Mustata et al., 2004]. Для изучения молекулярных взаимодействий между ингибиторами и интегразой применялись методы молекулярного докинга, в частности программы Autodock [Guenther, Nair, 2002] и FlexX [Buolamwini, Assefa, 2002].
Сообщалось о применении 3D-QSAR и молекулярного докинга для исследования ингибиторов интегразы, являющихся производными циннамоила [Buolamwini, Assefa, 2002] . QSAR исследования осуществляли с использованием методов CoMFA и CoMSIA. Авторам удалось построить статистически достоверную QSAR-модель, способную предсказывать активность новых молекул. Молекулярный докинг проводили с использованием программы FlexX, молекулы локировали в активный центр комплекса интеграза - 5-CITEP (lSQ4.pdb). При докинге соединения располагались в двух отдельных, частично перекрывающихся участках, однако, даже несмотря на это, наблюдалась хорошая корреляция между экспериментальными ингибиторными активностями и расчетными оценками связывания, т.е. наиболее активные молекулы наилучшим образом располагались в активном центре фермента. Также было обнаружено, что с важными аминокислотными остатками активного центра интегразы (Asp64, Cys65, Thr66, His67, Gln92, Gln96, Glnl52, Lysl56 и Lysl59) взаимодействуют почти все циннамоиловые ингибиторы, для которых был выполнен докинг [Buolamwini, Assefa, 2002].
В работе Макхиджа и Кулкарни использовался подход EVA на выборке, содержащей значительно различающиеся по структуре ингибиторы интегразы [Makhija, Kulkarni, 2001] . Преимуществом такого подхода является то, что для проведения исследования нет необходимости в суперпозиции структуры молекул между собой, что позволяет сравнивать молекулы, относящиеся к разным химическим классам. Исследователям удалось построить статистически достоверную QSAR модель и выявить высокую корреляцию EVA дескрипторов с ингибиторной активностью. В этой работе также было подтверждено большое значение для ингибирования доноров водородной связи, таких как ОН-, СООН- и БОзН-группы [Makhija, Kulkarni, 2001].
В другом исследовании этих же авторов, с использованием метода GFA, проводился QSAR анализ корреляции между расчетными физико-химическими дескрипторами и ингибиторными активностями in vitro ряда ингибиторов интегразы [Makhija, Kulkarni, 2002] . С учетом особенностей химической структуры эти молекулы были разделены на катехолы и не-катехолы. Оказалось, что пространственные, термодинамические и структурные дескрипторы не-катехолов вносят вклад как в ингибирование 3 -процессинга, так и в ингибирование переноса цепи, а катехолы осуществляют ингибирование за счет хелатирования ионов двухвалентных металлов, причем наибольший вклад в их активность вносят электронные и термодинамические дескрипторы [Makhija, Kulkarni, 2002].
Тестирование PASS на гетерогенной выборке химических соединений
Поиск потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 проводился нами в несколько этапов:
1.Создание обучающей выборки, включающей известные ингибиторы интегразы.
2.Обучение программы PASS и ее валидация.
3.Поиск потенциальных ингибиторов в базах данных коммерчески доступных образцов химических соединений.
4.Тестирование ингибиторной активности веществ, обладающих наиболее высокой прогнозируемой вероятностью проявления активности.
5.Анализ взаимосвязей «структура-активность» для известных ингибиторов интегразы, идентификация элементов структуры, вносящих положительный и отрицательный вклад в активность.
Несмотря на наличие в литературе информации о значительном числе ингибиторов интегразы, относящихся к разным классам химических веществ, наиболее перспективными из них в настоящее время считаются лишь ароматические производные дикетокарбоновых кислот, имеющие высокую антиинтегразную активность и обладающие доказанной избирательностью к ферменту [Hazuda et al., 2000; Johnson et al., 2004; Sechi et al., 2004]. Эти доводы послужили причиной выбора нами данного класса ингибиторов для включения в обучающую выборку. Целью нашего исследования был компьютерный поиск новых структур ингибиторов интегразы в базах данных доступных для тестирования химических соединений на основе анализа взаимосвязей структура-активность, с последующей экспериментальной проверкой результатов прогноза.
Мы собрали из различных литературных источников информацию о 90 веществах, взаимодействующих с каталитическим доменом интегразы ВИЧ-1 и относящихся к классу ароматических производных дикетокарбоновых кислот. Структурные формулы этих веществ (Табл. 8) и данные об их биологической активности были введены в базу данных под управлением СУБД ISIS/Base. Полями созданной базы были: ID (идентификационный номер); синонимы; химическое название (по IUPAC); структура (структурная формула вещества); активность (список видов биологической активности веществ); литературные ссылки {Рис.4).
Информация из созданной нами базы данных была использована для обучения компьютерной программы PASS и проведения процедуры скользящего контроля с исключением по одному. В результате обучения средняя ошибка прогноза данного вида активности при скользящем контроле составила 0.8%, таким образом средняя точность прогноза 99.2%. Это заметно выше, чем средняя точность для почти 1000 видов биологической активностей в стандартной программе PASS ( 85%), что объясняется существенно меньшим химическим разнообразием дикетокарбоновых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 по сравнению с 50000 веществ обучающей выборки PASS.
Представленные на рис. 5 результаты прогноза анти-интегразной активности для веществ из коммерчески доступных баз данных образцов химических соединений (около 750 тысяч структур) показывают, что число таких веществ сравнительно невелико. Как видно из рисунка, лишь для трех веществ ингибиторная активность в отношении интегразы ВИЧ-1 прогнозируется с вероятностью более 70%, и лишь для 12 веществ - с вероятностью более 30%. Из отобраных соединений 8 были обнаружены нами в базе данных IBS и 3 в базе данных AsInEx, однако они являлись дублями веществ из первой базы, а также было обнаружено одно соединение, входившее в состав обучающей выборки.
Значение Ра может использоваться в качестве гибкого критерия, позволяющего отбирать большее или меньшее количество перспективных веществ для экспериментального тестирования. Для эффективного использования данные компьютерного прогноза должны рассматриваться специалистами (экспертами) с учетом поставленных целей. Так, например, если целью исследования является поиск базовых структур лекарств (lead compounds), обладающих существенной новизной (New Chemical Entity, NCE), целесообразно отбирать из массива доступных веществ не те структуры, для которых величина Ра близка к единице (они могут оказаться близкими аналогами опубликованных в литературе ингибиторов интегразы), а соединения с Ра 0,7. Риск получения отрицательного результата в эксперименте тем больше, чем меньше величина Ра, однако и новизна такой структуры (при подтверждении прогноза в эксперименте) будет более высокой. Наоборот, если поставлена цель поиска близкого аналога известного препарата (так называемые "meoo-drugs"), то из массива имеющихся образцов следует отобрать вещества с наибольшими значениями Ра.
Компьютерный поиск потенциальных ингибиторов
В табл. 10 представлены структуры двух новых веществ (STOCK1S-05951 и STOCK1S-04849), проявивших активность при биологическом тестировании в отношении интегразы ВИЧ-1, а также контрольного вещества (STOCK1S-05667), для которого ингибиторная активность была ранее известна из литературы. Зеленым цветом обозначены структурные элементы, наличие которых существенно для проявления активности; синим -структурные элементы, которые слабо влияют на активность; красным - структурные элементы, негативно влияющие на активность.
Из табл. 10 видно, что наибольший вклад в проявление ингибиторнои активности в отношении интегразы ВИЧ-1 вносит кето-енольный фрагмент молекул, в то время как фенольному кольцу соответствует нейтральная или слабоположительная роль. Нитро-группа, замещающая водород в мета-положении бензольного кольца молекулы STOCK1S-05951, вносит существенный отрицательный вклад в проявление ингибиторнои активности. Метильные группы в орто-положениях молекулы STOCK1S-0484 9 также снижают ингибиторный эффект вещества в отношении интегразы ВИЧ-1. Коррекция типа или положения данных заместителей возможно привела бы к усилению ингибиторных свойств молекул STOCK1S-05951 и STOCK1S-04849. В молекуле контрольного вещества STOCK1S-05667 структурных элементов, вносящих отрицательный вклад в проявление антиинтегразной активности, нами не спрогнозировано, поэтому закономерно то, что для данного вещества экспериментальное значение ІС50 ниже, чем для STOCK1S-05951 и STOCK1S-04849.
Полученные данные дополняют результаты, изложенные в недавно появившейся работе, в которой была предложена фармакофорная модель интегразы ВИЧ-1, созданная при помощи трехмерного моделирования (Muststa et al., 2004). Таким образом, в ходе проведенного нами исследования впервые показана возможность применения компьютерной программы PASS для идентификации элементов структуры, существенных для проявления активности.
Предложенный в настоящей работе подход по компьютерному поиску новых потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил отобрать среди сотен тысяч коммерчески доступных веществ и исследовать 8 новых химических соединений. Проверка показала, что для двух из них ингибиторная активность в отношении интегразы ВИЧ-1 подтверждена в биологических экспериментах на рекомбинантном ферменте. Сравнительно невысокие величины ингибиторнои активности исследованных веществ возможно обусловлены наличием некоторых неблагоприятных заместителей, что особенно хорошо заметно для вещества STOCK1S-05951. Последующий анализ активных соединений и оптимизация химической структуры за счет подбора благоприятных заместителей могут значительно улучшить ингибирующие свойства данных соединений. Проведенный нами анализ взаимосвязей «структура-активность» расширяет представления исследователей об ингибиторах интегразы и, дополняя базу знаний, может облегчить последующие попытки рационального поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Определение областей молекул, вносящих положительный и отрицательный вклад в проявление ингибиторнои активности в отношении интегразы ВИЧ-1 дополняют данные, полученные на основе трехмерного моделирования, и создают основу для направленного синтеза новых высокоактивных веществ. 6. выводы
1. Создана обучающая выборка, состоящая из 90 дикетокарбоновых ингибиторов интегразы ВИЧ-1, которая позволила получить наиболее полную информацию о взаимосвязи их структуры и активности. После обучения программы PASS точность компьютерного прогноза ингибиторнои активности в отношении интегразы ВИЧ-1 составила более 99%.
2. Анализ взаимосвязи «структура-активность» дикетокарбоновых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил определить структурные элементы, вносящие положительный и отрицательный вклад в проявление данного вида биологической активности.
3. В результате виртуального скрининга более чем 750 тысяч коммерчески доступных образцов химических соединений отобрано 8 новых веществ, для которых проявление антиинтегразной активности наиболее вероятно.
4. В результате экспериментального тестирования отобранных соединений на ингибиторную активность выявлено 2 ранее не описанных в литературе ингибитора интегразы ВИЧ-1, относящихся к классу производных дикетокарбоновых кислот.
