Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор. "Методы получения нуклеозид 5'-монофосфатов и их применение для синтеза [ Р]-меченых нуклеотидов"
2.1 Прямое фосфорилирование действием фосфорной кислоты и её солей стр. 5
2.2 Фосфорилирование через активацию гидроксильной группы
2.2.1 Активация арилсульфохлоридами стр. 12
2.2.2 Активация металлорганическими соединениями стр. 13
2.3 Этерификация моноэфирами фосфорной кислоты стр. 16
2.4 Триалкилфосфитыкакфосфорилирующие агенты стр.20
2.5 Галогениды фосфора стр.22
2.6 Агенты, активирующие фосфорную компоненту:
2.6.1 Карбодиимиды стр.23
2.6.2 Арилсульфохлориды стр.29
2.7 Другие фосфорилирующие реагенты стр.33
2.8 Биосинтетические и ферментативные методы фосфорилирования стр. 35
3. Результаты и обсуждение
3.1 Синтез 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-5'-(холин-[ Р]-фосфата)... стр. 42
3.2 Изучение внутриклеточного метаболизма 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-5'-(холин-[32Р]-фосфата) стр.52
3.3 Оценка ферментативной стабильности стр. 57
4. Экспериментальная часть стр. 61
5. Список литературы стр.67
6. Приложение
- Фосфорилирование через активацию гидроксильной группы
- Этерификация моноэфирами фосфорной кислоты
- Биосинтетические и ферментативные методы фосфорилирования
- Изучение внутриклеточного метаболизма 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-5'-(холин-[32Р]-фосфата)
Введение к работе
В живых организмах содержание фосфора достигает 1%. Большая часть находится в костных, нервных и мышечных тканях. Фосфор активно участвует в энергообмене клетки, входит в состав мембран и многих клеточных ферментов.
В настоящее время химическое фосфорилирование находит широкое применение для решения различных биохимических задач, например, для модификации фосфором природных соединений, синтеза природных соединений, имеющих в своём составе атом фосфора, а также для изучения метаболизма соединений в клетке и организме с помощью радиоактивного изотопа фосфора. Высокая специфическая активность, простота детекции и доступность исходных соединений, содержащих 32Р, делают этот изотоп удобным инструментом в исследовательской работе. Незначительно проигрывая в энергии частицы, изотоп- Р имеет вдвое больший период полураспада, но его высокая стоимость ограничивает его использование в биохимии.
Нами ставилась задача рассмотреть различные методы создания фосфоэфйрной связи, классифицировать их и выбрать наиболее перспективные с точки зрения радиоактивного синтеза.
Фосфорилирование через активацию гидроксильной группы
Одним из методов фосфорилирования нуклеозидов является прямая конденсация соли ортофосфорной кислоты и нуклеозида при высокой температуре, благодаря которой удаляется выделяющаяся при конденсации вода. Первая такая работа, датируется 1966 годом [1], в которой Хоньо с сотрудниками предложили химический метод фосфорилирования нуклеозидов на основе неактивированной -фосфорной кислоты. При этом авторы ссылаются на работу [2], в которой Понамперума с коллегами получил глицеринмонофосфат нагреванием глицерина с дигидрофосфатом натрия в вакууме. Однако при воспроизведении условий синтеза, авторам не удалось получить таким способом нуклеозидмонофосфаты [1]. Первые опыты по фосфорилированию 2 ,3 -ди-0-изопропилиденинозина дигидрофосфатом натрия в отсутствие растворителя не приводили к образованию фосфатов вплоть до температуры 280 С. При повьппении температуры наблюдалась значительная деструкция нуклеозида. Замена дигидрофосфата натрия на моногидрофосфат также оказалась неэффективной для синтеза инозин-5 -монофосфата. И только при нагревании NaH2P04 с 2\3 -ди-0-изопропилиденинозином в среде DMF был получен соответствующий монофосфат с выходом 2%. Проведение реакции в DMSO или о- хлорфеноле, а также замена натриевых солей калиевыми ни к чему не привела. По мнению авторов, это вызвано низкой растворимостью этих солей фосфорной кислоты. Для подтверждения этого тезиса было проведено сравнение фосфорилирующей способности различных солей фосфорной кислоты (Таблица 1). Таблица 1. Влияние солевой формы ортофосфата на конверсию нуклеозида солевая форма конверсия 2 ,3 -ди-О-изопропилиденинозина, % дигидрофосфат три-н-бутиламмония 40 дигидрофосфат ди(три-«- 66 бутиламмония) дигидрофосфат анилиния 31 дигидрофосфат триэтиламмония 45 Дизамещённый фосфат трибутиламмония давал высокие выходы фосфорилированого продукта, однако авторы не изучали соотношение монофосфата (5 -IMP) и дифосфата (5 -ГОР) в продуктах фосфорилирования. Для этого реагента замена растворителя на DMSO или о-хлорфенол также не влияла на конверсию защищенного инозина. Помимо кипячения, авторы использовали серию водоотнимающих агентов. Результаты этих экспериментов сведены в таблицу 2. Из таблицы 2 видно, что в присутствии ряда дегидратирующих агентов наряду с целевым 5ЧМР образуется 5 -ГОР, причём в случае DCC его выход достигает 24%. Интересные данные получены при использовании в качестве фосфорилирующего агента н-бутиламмонийной соли пирофосфорной кислоты и н-бутиламмонийной соли полифосфорной кислоты. Из таблицы 3 видно, что выход 5ЧМР одинаков для этих кислот, а выход 5 -ГОР несколько больше в случае использования полифосфата.
В таблице 4 представлены выходы и состав продуктов реакции для различных нуклеозидов (таблица 4). Из таблицы следует, что нуклеиновое основание вносит вклад в степень конверсии фосфорной кислоты и влияет на состав продуктов реакции. Наиболее удачными данные условия оказались для 2 ,3 -ди-0- изопропилиденинозина (выход 5ЧМР составляет 58%, при этом он является единственным продуктом). В случае тимидина образуется смесь продуктов, в которой преобладает 5 DP. В этих ._ условиях авторам не удалось осуществить фосфорилирование ни одного из дезоксинуклеозидов, так как они разлагались в условиях синтеза, давая соответствующие основания. В работе Цвертицкого с коллегами [3] была сделана попытка варьирования растворителя при сохранении температуры реакции 150С, так как при понижении температуры синтеза резко падала конверсия ортофосфата. Оптимальным оказалась среда этиленгликоля с незначительным количеством воды. Таким способом реакцией дигидрофосфата калия с защищенной D-глюкофуранозой с выходом 37% был получен 5-фосфат D-арабинозы. Следует заметить, что в предложенном методе не используются никакие активирующие агенты. Попытки оптимизации столь простого и вместе с тем эффективного метода предпринимаются и сегодня. Так, много лет спустя после работы Хоньо, Сакакура с коллегами [4] предложили проводить фосфорилирование природных нуклеозидов в более низкокипящей смеси растворителей (DMF/нитроэтан 1:1), а выделяющуюся в реакции воду авторы предложили утилизировать при помощи молекулярных сит с диаметром пор ЗА. Авторы убедительно доказали определяющее влияние температуры на степень конверсии фосфорной кислоты на модельной реакции этерификации фосфорной кислоты 4-фенилбутанолом в присутствии одного эквивалента трибутиламина в качестве основания (Таблица 5).
Этерификация моноэфирами фосфорной кислоты
Эфиры фосфорной кислоты также могут служить фосфорилирующими агентами в синтезе нуклеотидов из нуклеозидов. Реакции с такой фосфорной компонентой можно разделить на две группы, основываясь на функции заместителя при атоме фосфора: 1. К первой группе следует отнести реакции переэтерификации, в которых легко уходящая группа R -О- на фосфоре замещается целевой R -Y- (Схема 3) 2. В синтезах, относящихся ко второй группе, заместитель при фосфоре играет роль защитной группы, а фосфорилирование таким моноэфиром протекает в присутствии конденсирующего агента (Схема 4). Наиболее часто в качестве заместителя при фосфоре в реакциях, соответствующих схеме 3, используют л-нитрофенильные группы. Так, в работе [14] обработкой пиримидиновых (уридин, цитидин) и пуриновых (аденозин) 2 ,3 -изопропилиденнуклеозидов л-нитрофенилфосфатом (12) в присутствии пиридина при 110С были получены соответствующие 5 -монофосфаты с выходами 75-85%. В работе отмечается, что если исходный диэфир взят в значительном избытке, то результатом реакции окажется эквимолярная смесь нуклеозид 5 -моно-, ди- и трифосфатов. При использовании 2 ,3 -изопропилиденцитидина авторы также отмечают образование N-фосфорилированного продукта в количестве 10-14%. Позднее в качестве фосфорилирующего агента был предложен модифицированный и-нитрофенилфосфат, содержащий третичную аминогруппу в ароматическом кольце (13) [15]. Он незначительно превосходил своего предшественника по фосфорилирующей активности, но не затрагивал аминогруппу нуклеозида. Более того, реагент отличался исключительной селективностью к первичной гидроксильной или тиольной группе, что позволяло получать соответствующие 5 - фосфаты без защиты 2 (3 )-гидроксильных групп нуклеозидов [16] . Отдельно следует отметить, что реакция протекает в присутствии кислотного катализатора (уксусной или трифторуксусной кислот) в среде абсолютного пиридина или триэтиламина. Авторы использовали этот конденсирующий агент и для синтеза циклических фосфодиэфиров по следующей схеме: нуклеозид вводили в реакцию с монофосфатом (13), и полученный интермедиат без выделения нагревали до 60С в присутствии уксусной кислоты и пиридина (Схема 5). Выходы цикломонофосфатов варьировались в интервале 50-70% в зависимости от природы нуклеозида [17].
В качестве нуклеозидов использовали уридин, тимидин и аденозин. В той же работе был предложен ещё один фосфорилирующий агент этого ряда. Он представляет собой М-[2-(дигидроксифосфонилокси)-5-нитробензил]пиридиний гидроксид (14). Этот реагент был практически не активен в конденсациях с нуклеозидами, если реакционная смесь не содержала сильного основания, но легко вступал в реакции со спиртами, содержащими в своей цепи третичные аминогруппы (например холин) [17]. В синтезах второй группы в качестве фосфорилирующих агентов используют алкильные эфиры фосфорной кислоты, в которых алкильная группа защищает одну из гидроксильных групп и в некоторых синтезах определяет стерическую селективность реакции. Конденсацию- таких моноэфиров проводят обычно в присутствии "карбодиимидов или арилсульфохлоридов. Исторически первым фосфорилирующим агентом этой группы был цианоэтилфосфат (15), предложенный Г. Тенером в 1961 году [18]. После фосфорилирования цианэтильная группировка легко удаляется в щелочных условиях. Метод оказался удобным и универсальным и, как следствие, широко применялся в нуклеозидной химии.
Так, кроме природных нуклеозидов [18] 2-цианэтилфосфатом были успешно фосфорилированы такие соединения, как К -(3-гидрокси-1-гидроксиметил) тимин (17) (до соответствующего дифосфата) [19] и 5 -ациламинометилтимидин (18) [20]. О Однако в ряде работ отмечаются низкие выходы продуктов (например, для 5-метилсульфонилуридина [21]) и обсуждается образование в значительном количестве Л -ацилмочевины, затрудняющей вьщеление и очистку продуктов [22]. Также отмечается, что в процессе удаления защитной группы в щелочных условиях наблюдается образование 5 -нуклеозид дифосфатов [23]. Кроме того, при проведении реакции в абсолютных растворителях в присутствии сильного основания происходит р-элиминирование цианэтильной группы [23]. Для устранения этих недостатков 2-цианэтилфосфата был синтезирован циклопропилметилфосфат (16)(схема 6) [24].
Биосинтетические и ферментативные методы фосфорилирования
Биосинтетические методы разрабатывались главным образом для синтеза 32Р радиоактивно меченных природных соединений. Большинство работ посвящено получению [а- Р] нуклеозидтрифосфатов и [у- Р] нуклеозидтрифосфатов. Они основаны на выращивании бактерии в среде, содержащей Нз32РС 4. Обогащенные -35- радиоактивным изотопом РНК и ДНК разделяются и подвергаются гидролизу. Так, в работе Роберта с коллегами [61] клетки Е. coli инкубировали в течение 24ч в среде, содержащей 50 mCi 32Р ортофосфата. Далее клетки осаждали центрифугированием и отделяли липидную фракцию после экстракции смесью этанол-эфир. Из полученного раствора фенольным методом экстрагировали РНК, а 2% примесной ДНК гидролизовали обработкой экстракта ДНКазой. Выделенную РНК обрабатывали фосфодиэстеразой змеиного яда (тщательно очищенной от моноэстеразы) Полученную смесь нуклеотид-5 -монофосфатов разделяли хроматографически на колонке с Dowex-І в формиатной форме. ДНК, оставшаяся от фенольной экстракции, подвергалась действию фосфодиэстеразы и полученные дезоксинуклеотид 5 -монофосфаты выделяли хроматографически в тех же условиях. Выходы по радиоактивности в этих экспериментах не превьппали 0,1% в пересчёте на исходную Нз РО4, а молярная радиоактивность составляла 1-Ю мКи/ммоль. Ферментативные методы фосфорилирования поначалу были молоэффективны, так как для фосфорилирования использовались не индивидуальные ферменты, а киназная фракция, выделенная из бактериального гомогената при помощи сульфатаммонийного фракционирования [64].
Поскольку такой ферментативный препарат содержал значительные количества примесного белка (в том числе фосфатазы и иные неспецифические гидролазы), то меченные нуклеотиды подвергались деградации. Чтобы подавить разрушение целевых нуклеотидов и поддержать постоянный уровень АТР, в реакционную массу вводили АТР-регенерирующую систему: креатинфосфат-креатинкиназу или фосфоенолпируват - пируваткиназу [64, 65]. Применение ацетилфосфата не требует добавления экзогенной ацетилкиназы, однако метод, тем не менее, характеризуется низкой воспроизводимостью (видимо из-за нестабильности ацетилфосфата) [66]. В 1979 году Биебричер [67] разработал эффективный способ выделения всех необходимых нуклеозидмонофосфаткиназ из Е. coli. И хотя ферменты очищались не до гомогенного состояния, уровень примесного белка был достаточно низок, что обеспечивало хорошую воспроизводимость синтезов. Эффективную схему получения монофосфатов всех природных нуклеозидов предложили Джонсон и Валсес [68]. Метод основан на фосфорилировании З -NMP [у-32Р]АТР в присутствии полинуклеотидкиназы фага Т4 (PNK Т4) с последующим удалением 3 фосфатной группы с помощью нуклеазы Р1 (схема 21). Схема 21 Замечательная особенность PNKT4 в том, что в силу своей неспецифичности, она фосфорилирует все природные нуклеозид 3 -фосфата. Однако эта особенность делает метод непригодным для синтеза нуклеозидмонофосфатов, содержащих модификацию сахарного остатка. О синтезе нуклеозидмонофосфатов с модифицированным основанием этим методом также нет данных.
Таким образом, анализ известных методов фосфорилирования спиртов позволяет сделать следующие заключения: 1. Метод прямого фосфорилирования вполне может быть применён в синтезе 32Р меченых нуклеотидов, однако аппаратное оформление высокотемпературного радиоактивного синтеза несомненно вызовет ряд трудностей. Использование избытка фосфорной кислоты также нежелательно, так как она является наиболее дорогостоящей компонентой реакции. Кроме того, время протекания реакций составляет 6-8 часов, что в условиях высокотемпературного синтеза приведёт к значительному накоплению побочных продуктов и компонентов пассивного радиолиза. В то же время метод обладает рядом несомненных преимуществ: -высокие выходы и отсутствие побочных продуктов -возможность оставить незащищённой аминогруппу нуклеозида -нет высоких требований к «сухости» компонентов реакции 2. Карбодиимидная активация. Литературные источники сообщают о высоких и даже количественных выходах нуклеотидов в синтезах с использованием DCC. К плюсам метода можно отнести также стехиометрические соотношения спиртовой и фосфорилирующей компоненты. Однако гетерогенность реакционной массы, как и чрезвычайно низкая скорость реакции, несомненно, приведут к понижению выходов целевых нуклеотидов. Возможно, применение водорастворимых карбодиимидов поможет преодолеть некоторые из вышеупомянутых трудностей. 3. Синтезы в присутствии арилсульфохлоридов. На первый взгляд, этот метод представляется нам наиболее перспективным как с точки зрения скорости реакции, так и с точки зрения выходов целевых фосфоэфиров. Однако избытки образующейся арилсульфокислоты могут усложнить выделение целевых нуклеотидов. 4. Ферментативные методы, несмотря на привлекательность (высокие скорости, селективность, количественные выходы, отсутствие побочных продуктов), применимы лишь к природным нуклеозидам. Многообразие существующих методов образования фосфоэфирной связи наглядно показывает, что нет универсального метода фосфорилирования, позволяющего получать целевые соединения с высокими выходами в независимости от природы реагентов. Синтетические аналоги нуклеозидов широко применяются в медицинской практике для терапии вирусных инфекций. Механизм действия основан на их внутриклеточном фосфорилировании до соответствующих трифосфатов, которые после включения в цепь вирусной ДНК терминируют ее биосинтез. Вследствие этого эффективность подавления вируса определяется несколькими факторами, в частности, способностью вещества проникать в клетки, эффективностью внутриклеточного фосфорилирования нуклеозида до трифосфатного производного, и способностью модифицированного нуклеозид 5 -трифосфата распознаваться вирусными ДНК-полимеразами.
Изучение внутриклеточного метаболизма 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-5'-(холин-[32Р]-фосфата)
Чтобы ответить на вопрос, являются ли различия в скорости проникновения (1) и AZT причиной изменения анти-ВИЧ активности, мы провели сравнение динамики совместного проникновения исследуемого диэфира [32Р]-(1) и AZT, меченного 3Н. Для решения этой задачи нами был использован [6-3H]-AZT. Динамика накопления [3H]-AZT и [32Р]-(1) в клетке представлена на рис. 9. Из рисунка видно, что до 8 часов концентрация [3H]-AZT в клетке выше концентрации Р. Поскольку диэфир (1) в клетке количественно метаболизируется до AZT, можно утверждать, что внутриклеточная концентрация AZT, достигнутая за счёт проникновения (1) составляет 94-97% концентрации Р. Следовательно, в первые 8 часов внутриклеточная концентрация [3H]-AZT выше концентрации AZT, высвободившегося из (1). Далее скорость проникновения (3H)-AZT значительно снижается и в клетке начинает преобладать AZT, поставляемый диэфиром (1), достигая в 24 часа разницы почти в 30%. Рис.9. Динамика проникновения [32Р]-(1) и [3H]-AZT в клетку при равных внеклеточных концентрациях. Однако можно отметить, что характер кривой проникновения (1) в присутствии AZT в равной концентрации через 6-7 часов инкубации не претерпевает существенных изменений. Мы также решили выяснить, какие изменения произойдут в динамике проникновения соединения (1) на фоне 10-кратного избытка AZT в культуральной жидкости (рис. 10). Как видно из рис. 10, присутствие AZT несомненно влияет на скорость проникновения препарата, однако, это влияние весьма незначительно и его нельзя объяснить простым конкурентным взаимодействием. Поскольку увеличение внутриклеточной концентрации AZT при инкубации клеток с диэфиром (1) не столь значительно, как увеличение его антивирусной активности (ID50), мы провели эксперимент, в котором изучили динамику проникновения диэфира (1) в концентрации, близкой к той, в которой он проявляет антивирусные свойства (ID9o= 18 нм) (Рис. 11). Кривая, отражающая динамику проникновения, в отличие от Величина химической и ферментативной стабильности - важная характеристика соединения с точки зрения его применимости в клинической практике.
Кроме того, эксперименты по исследованию ферментативной стабильности могут выявить ферменты, ответственные за внутриклеточное расщепление соединения. В табл. 2 приведены денные о химической и ферментативной стабильности фосфата (1). Стабильность оценивали по величине времени полугидролиза (Тш). Ті/2 нуклеотида (1) в фосфатном буфере при 37С в интервале рН 5-8 превышает 24 часа. В 90% нормальной сыворотке крови человека время полугидролиза диэфира (1) составило 6,3 часа, при этом единственным наблюдаемым продуктом гидролиза был AZT. Однако, поскольку скорость гидролиза нуклеотида (2) в условиях этого эксперимента на порядок выше таковой для холинфосфата AZT (1) (данные не приведены), монофосфат (2) в реакционной смеси не был обнаружен. Изучение действия ферментов лизата клеток.HL-60 проводили, как описано в [70]. Мы фракционировали лизат клеток HL-60 путем его центрифугирования при 14000 g в ЮОмМ PBS. Оказалось, что супернатант (осветленный лизат) гидролизует соединение (1) почти в 5 раз медленнее, чем суспендированный в том же объеме осадок лизата после центрифугирования. Качественный состав продуктов гидролиза при этом одинаков. Эти факты указывают на то, что фермент, отвечающий за внутриклеточный гидролиз, возможно локализован на клеточной мембране. Мы попытались определить, какие ферменты способны расщеплять нуклеотид (1) и какие продукты при этом образуются. Так оказалось, что суммарный ферментативный препарат змеиного яда легко гидролизует (1) с образованием холина, AZT и монофосфата AZT (2). Время полугидролиза составило примерно 60 мин. К этому моменту времени продукты гидролиза AZT и монофосфат (2) накапливаются в реакционной смеси в соотношении 1:1. Поскольку (2) постепенно гидролизуется 5 -нуклеотидазой змеиного яда, то после четырёх - часовой инкубации продуктами гидролиза являются AZT, холин и ортофосфорная кислота. В присутствии фосфодиэстеразы змеиного яда гидролиз (1) протекает с образованием холина и нуклеотида (2) с очень высокой скоростью. Время полугидролиза составило 3-5 мин.
