Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Моделирование липидных бислоев 8
2.1.1. Необходимость моделирования бислоев 8
2.1.2. Типы моделей мембран 9
2.1.3. Методы моделирования 12
2.1.4. Моделирование молекулярной динамики бислоя 13
2.1.5. Верификация моделей мембран 18
2.2. Моделирование мембранных белков и пептидов 21
2.2.1. Моделирование мембранных пептидов 21
2.2.2. Моделирование белков в липидном бислое 28
2.2.3. МЛО А 30
2.3. Функции и свойства цитохрома Ъ5 32
2.3.1. Функции, структура и свойства цитохрома Ъ5 32
2.3.2. Моделирование мембраносвязанного домена цитохрома Ъ5 38
3. Объекты и методы 40
3.1. Аппаратная и программная база работы 40
3.2. Объекты 40
3.3. Конструирование молекулы ДПФХ 40
3.4. Конструирование липидного бислоя из ДПФХ 40
3.5. Оптимизация бислоя из ДПФХ 41
3.6. Верификация модели мембраны 43
3.7. Подтверждение пригодности модели бислоя из ДПФХ для моделирования
мембранных белков 44
3.8. Конструирование цитохрома Ь5 в петлевой и трансмембранной топологии 44
3.9. Оптимизация модели бислоя для моделирования цитохрома Ь5 в
трансмембранной и петлевой топологиях 44
3.10. Оптимизация цитохрома Ь5 45
4. Результаты 46
4.1. Построение и оптимизация модели липидного бислоя из ДПФХ 46
4.1.1. Моделирование МД бислоя из ДПФХ 51
4.1.2. Анализ результатов моделирования МД бислоя из ДПФХ 51 4.2 Моделирование цитохрома Ь5 в мембранном окружении 66
4.2.1. Моделирование МД цитохрома Ь5 в трансмембранной топологии 70
5. Обсуждение 94
6. Выводы 102
7. Список литературы 103
- Моделирование молекулярной динамики бислоя
- Функции, структура и свойства цитохрома Ъ5
- Оптимизация бислоя из ДПФХ
- Построение и оптимизация модели липидного бислоя из ДПФХ
Введение к работе
1.1. Введение. Актуальность темы
Микросомальный цитохром Ь5 (Ь5) является мембранным белком, который находится в эндоплазматическом ритикулуме. Основной его физиологической функцией является латеральный и межмембранный перенос электронов, включая восстановление цитохромов Р450 (Archakov, 1974), реакции десатурации жирных кислот (Strittmatter, 1974), биосинтез холестерола (Clarke, 2004) и реакции гидроксилирования (Vergeres G, 1995).
Цитохром Ь5 представляет собой двухдоменный мембранный белок, "заякоренный" С-концом в мембране. С помощью трипсина он может быть разделен на водорастворимый гемсодержащий глобулярный домен, сохраняющий физико-химические и окислительно-восстановительные свойства Ь5, и мембранный гидрофобный домен (Tajima, 1978). Пространственная структура водорастворимого фрагмента была решена с помощью рентгеноструктурного анализа (Mathews, 1972а; Mathews, 19726) и доступна в белковом банке PDB (Berman, 2000). Пространственная структура мембраносвязанного домена до сих пор остается неизвестной. Различные авторы предполагают 2 возможные мембранные топологии этого домена. Согласно одной из них мембранный участок Ь5 имеет форму петли - С-конец белка выходит из мембраны с той же стороны, где расположен белок (Ozols, 1989; Tajima, 1980). По другой гипотезе - мембранный домен Ь5 является трансмембранным и пересекает мембрану насквозь (Vergeres, 1995).
Анализ пространственной структуры белков базируется на комбинации методов молекулярной биологии, биохимии, ЯМР и кристаллографии (McPherson, 2002; Drenth, 1994). Однако, такие подходы пригодны в основном для водорастворимых белков, поэтому определены пока только единичные структуры мембранных белков. Это обусловлено существующими проблемами их экспрессии и кристаллизации. Дефицит данных о молекулярном строении мембранных белков стимулирует применение методов молекулярного моделирования (Chang, 1996).
Поскольку конформация мембраносвязанных частей белков обусловлена взаимодействием с липидным бислоем, то для корректного моделирования мембранных белков необходимо использовать адекватную среду в виде модели липидного бислоя с двумя водными фазами с обеих сторон. В последние годы моделированию таких белков в мембранном окружении было посвящено много работ (Saiz, 2002; Forrest, 2000; Tieleman, 1997). Однако, до сих пор существует проблема создания адекватной модели липидного бислоя, хорошо отражающей свойства биологической мембраны.
Оценку достоверности построенной модели бислоя и ее пригодности для моделирования мембранных белков необходимо проводить на основе расчетных и экспериментальных данных (Ивков, 1981; Ивков, 1982). Для верификации модели бислоя могут быть использованы такие расчетные
1 j4^T'^ I
* ' II. НІНІ ЯГГ<"
параметры, как объем и площадь поверхности бислоя, приходящиеся на одну молекулу фосфолипида; распределение различных групп атомов вдоль нормали к бислою; ориентация отдельных метиленовых фрагментов алифатической цепи (параметр порядка) (McCabe, 1994).
Для проверки пригодности модели бислоя для моделирования структуры и топологии мембранных белков необходимо также выполнение контрольного моделирования с использованием похожего по структуре мембранной части периферического белка с известной структурой и мембранной топологией. В белковом банке PDB (Berman, 2000) имеется всего 88 структур мембраносвязанных белков ( ne_Proteins_xtal.html), большинство которых является большими интегральными белками (Ulmschneider, 2001). Поэтому в качестве контрольного мембраносвязанного периферического белка нами был выбран фермент моноаминооксидаза А (МАО А). Его структура и мембранная топология недавно были решены методами белковой кристаллографии (Ма, 2004).
Цель работы
Моделирование пространственной структуры цитохрома Ь5 в мембранном окружении и анализ возможных вариантов топологии мембраносвязанного домена этого белка.
Основные задачи:
-
Создать равновесную модель фосфолипидного бислоя из молекул дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) в водном окружении.
-
Проверить пригодность модели фосфолипидного бислоя для моделирования периферических мембранных белков на примере моноаминоксидазы А (МАО А).
-
Выполнить моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома Ь5 в мембранном окружении в виде полноатомной модели липидного бислоя и двух водных фаз.
-
Выполнить анализ возможных вариантов мембранной топологии цитохрома Ь5 и сравнить их с известными экспериментальными данными.
1.2. Научная новизна и практическая значимость работы
Построена модель липидного бислоя, которая хорошо согласуется с известными экспериментальными данными (объем и площадь, занимаемые одной молекулой ДПФХ, толщина бислоя, порядок ацильных цепей, профили плотности атомов). На примере мембранного белка МАО А было показано, что модель бислоя может быть использована для моделирования различных мембранных белков.
Впервые выполнено моделирование молекулярной динамики полноразмерного цитохрома Ь5 в мембранном окружении в трансмембранной и петлевой топологиях. Моделирование показало стабильность обоих
вариантов, что предполагает существование Ь5 в двух топологиях и
объясняет противоречивые экспериментальные данные.
Впервые показано, что конформация участка, соединяющего водорастворимый и мембраносвязанный домены может играть важную функциональную роль в регуляции взаимодействия цитохрома Ь5 с редокс-партнерами.
Полученные модели полноразмерного цитохрома Ь5 могут быть использованы для изучения взаимодействия цитохрома Ь5 с редокс-партнерами.
1.3. Апробация работы
Основные положения диссертации были доложены на следующих конференциях:
-
2th International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow-Pies-Moscow, 2004);
-
XII Российский Национальный Конгресс "Человек и лекарство" (Москва, 2005);
-
4-ая Национальная конференция "Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины" (Москва, 2005);
-
4-ая Всероссийская конференция "Молекулярное моделирование" (Москва, 2005);
-
14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics (Dallas, USA, 2005).
Апробация диссертации состоялась 5 мая 2005 года на межлабораторном семинаре ГУ НИИ биомедицинской химии им В.Н. Ореховича РАМН.
По теме диссертации опубликовано 6 работ.
1.4. Структура и объем диссертации
Моделирование молекулярной динамики бислоя
Моделирование МД липидных систем должно быть более продолжительным и использованы адаптированные для липидов параметры силового поля и протокол МД (Pastor et al., 1996).
Моделируемое время МД. Движения в липидном бислое разнообразны и характеризуются различными временными интервалами, Наиболее быстрыми движениями в молекулах липидов являются изменения длин связей и углов, а также небольшие флуктуации торсионных углов (Tieleman et al., 1997). Характерные времена этих движений составляют порядка нескольких пс. За такое же время происходит диффузия и упорядочивание молекул воды и других малых молекул. Транс/гош изомеризация торсионных углов в ацильных цепях липидов является более медленным процессом и происходит за несколько десятков пс. Чем ближе к "головкам" липидов, тем транс/гош изомеризация становится медленнее, и в ближайшей к "головкам" области липидов протекает за несколько сотен пс. Динамика изменения величин торсионных углов в "головках" заторможена из-за сильных взаимодействий между атомами как внутри молекул липидов, так и между молекулами. Для вращения целой молекулы липида необходимо еще больше времени. Оборот молекулы фосфолипида вокруг своей основной оси происходит за несколько не. Флип-флоп (переход липидов из одного монослоя в другой) занимает десятки не (Seydel et al., 2002). Примерно такое же время требуется для встраивания в мембрану больших молекул (например, белков). Моделирование МД является эффективным методом для изучения динамики ацильных цепей и отдельных липидов. Это является важным достоинством данного метода, так как он дает детализированную на атомарном уровне информацию, которую можно использовать для интерпретации, например, ЯМР данных о разупорядоченном липидном бислое (Douliez et al., 1995).
В большинстве исследований длина траектории моделирования МД составляет 5 не, хотя часто систему считают уравновешенной уже после 100-200 пс МД. Однако было показано, что равновесное положение липиды занимают приблизительно через 1,5 не (Takaoka et al., 2000). В случае моделирования белков в мембранном окружении, белок необходимо помещать в бислой, уже находящийся в состоянии равновесия. Для получения бислоя в состоянии равновесия необходимо выполнить предварительное длительное моделирование МД бислоя.
Периодические граничные условия. Хотя системы моделирования МД бислоя содержат до десятков тысяч атомов, они все равно являются небольшими в макроскопическом масштабе. Если такая система будет окружена вакуумом, то это приведет к так называемым "граничным" эффектам, т.е. существенным отклонениям поведения молекул в приграничной зоне от тех, которые находятся в центре. В наихудшем случае, система просто испарится подобно капле воды в вакууме. Для решения этой проблемы используют 2 подхода: 1) ограничение движения граничных (поверхностных) атомов (стохастические граничные условия) и 2) использование периодических граничных условий. Выполнение стохастических граничных условий достигается окружением системы отталкивающими стенами. Стохастические граничные условия не способны эффективно моделировать бесконечную бислойную систему, кроме того, они могут приводить к ограничению наклона ацильных цепей граничных липидов, которые, в свою очередь, оказывают влияние на угол наклона ацильных цепей остальных фосфолипидов.
Периодические граничные условия являются более естественными для мембраны, т.к. они эффективно имитируют бесконечность моделируемой системы, В этом случае, копии моделируемой системы размещаются во всех направлениях и граничная молекула взаимодействует с окружающими молекулами в том числе и из соседней ячейки. Размер и геометрия моделируемой ячейки могут быть постоянными или переменными в зависимости от набора параметров моделирования. Несмотря на то, что периодические граничные условия занимают больше времени в вычислительном отношении, последние годы почти все исследователи используют данный подход.
Электростатика и "отсечки". При расчете энергии системы предполагается учет взаимодействий между всеми атомами, что очень неэффективно для больших систем. С увеличением расстояний между атомами, их взаимодействия ослабевают и начиная с определенного расстояния взаимодействия почти не вносят вклад в общую энергию системы. Поэтому на расстояниях, превышающих некоторую критическую величину, взаимодействиями между атомами можно пренебречь. Эту критическую величину принято называть "отсечкой" (cutoff).
В моделировании липидных бислоев было предложено несколько подходов для упрощения расчетов (Egberts et al., 1994; Tieleman, 1998; Heller et al., 1993). Один из них -использование цилиндрической срезки (cylindrical cutoff) (Egberts et al., 1994). В этом случае все взаимодействия в пределах цилиндра с некоторым радиусом, перпендикулярным плоскости вода-липид, рассчитываются явно, для остальных взаимодействий рассчитывается уравнение Пуассона. Ограничения этого метода в том, что он требует много машинного времени для больших систем и не работает, когда в моделируемой системе нет цилиндрической симметрии.
Другой популярный подход - использование двойной сферической отсечки (spherical double cutoff) (Tieleman et al., 1996). В этом случае в каждый временной шаг производится расчет всех взаимодействий в пределах небольшой сферы (обычно 1 нм), электростатические взаимодействия в пределах большей сферы (обычно 1,5 - 2,0 нм) рассчитываются через каждые 10 временных шагов (Tieleman, 1998).
В работах (Heller et al., 1993; Zhou et al., 1995) был использован расширенный многополюсный метод в комбинации со стохастическими граничными условиями. Хотя этот метод дает правильную оценку электростатических взаимодействий, с технической точки зрения использование стохастических граничных условий менее удобно, чем использование стандартных периодических граничных условий.
Традиционно используется метод Эвальда (Darden et al., 1993), который предназначен для расчета электростатических взаимодействий в кристаллах, однако когда заряды хорошо распределены по сетке, этот метод также можно применять и для других систем, например, для жидко-кристаллического фосфолипидного бислоя.
Наборы параметров моделирования МД. Важнейшим этапом в подготовке моделирования МД является выбор набора параметров МД. Обычно моделирование МД выполняют при постоянном числе частиц (N). Если объем (V) и энергию (Е) системы устанавливают постоянными, то такой набор называется NVE или микроканоническим. Когда объем и температура (Т) задаются постоянными, набор называется каноническим или NVT. В обоих случаях, размер моделируемой системы выбирается таким образом, чтобы бислой находился в жидко-кристаллическом состоянии.
Для достижения гибкости системы при моделировании МД применяется постоянное давление в одном или нескольких направлениях, что разрешает изменение размеров моделируемой системы. Существуют три схемы использования давления: 1) постоянное нормальное давление вдоль нормали к би слою с фиксированной площадью поверхности фосфолипидов (A) (NPAT), 2) постоянное давление во всех направлениях (NPT) и 3) постоянное давление вдоль нормали к бислою с постоянным поверхностным натяжением (у) вдоль бислоя (NPyT). Первая схема обеспечивает небольшую гибкость (возможность изменения толщины бислоя), в то время как две другие схемы позволяют ячейке изменять размеры во всех трех направлениях.
Функции, структура и свойства цитохрома Ъ5
Аламетицин вызывает интерес, во-первых, как мембраносвязанный пептид, во-вторых, как ионофор, формирующий реальный ионный канал. При наличии электрического напряжения поперек бислоя, происходят конформационные изменения в структуре канала, приводящие к изменению ориентации от поверхностносвязанной к трансмембранной. Канал формируется расположенными параллельно 6-11 молекулами аламетицина (Seydel et al., 2002). Аламетицин часто используют для моделирования электровозбудимости мембран (Duclohier et al., 2001; Tieleman et al„ 2001).
На данный момент существует много исследований о моделировании пептидов в липидном бислое (Goodyear et al., 2005; Mobley et al., 2004). Однако для проверки пригодности построенной модели бислоя для моделирования мембранных белков пептиды не подходят, в связи с их небольшими размерами,
Безусловно, наибольший интерес представляет полноатомное моделирование МД трансмембранных и периферических мембраносвязанных белков в бислое. Такие исследования вносят большой вклад в понимание общих принципов встраивания в мембрану, упаковки, стабилизации и функционирования белков в липидном окружении. Наиболее изученными мембраносвяэанными белками являются бактериородопсин и порин (Tieleman et al., 1998; Kimura et al., 1997).
Бактериородопсин. Структура бактериородопсина из архебактерии Halobacterium salinarium определена с разрешением 3 A (Kimura et al., 1997). Белок содержит 248 аминокислотных остатков, которые образуют семь а-спиралей, пронизывающие мембрану перпендикулярно ее плоскости (рис. 6). Эти а-спирали обычно обозначают буквами А, В, С, D, Е, F, G, начиная с N-конца. Кроме того, бактериородопсин содержит простетическую группу — ретинол, который с помощью шиффова основания ковалентно присоединен к Lys216. В клетке белок олигомеризуется с участием трех мономеров.
Бактериородопсин выполняет функцию фотохимического протонного насоса, создающего на мембране разность электрохимического потенциала протонов, энергия которой используется клеткой для транспорта растворимых веществ и синтеза АТФ. При поглощении ретинолом протона индуцируется несколько реакций, что в конечном счете приводит к электрогенному переносу одного или двух протонов из клетки наружу.
Были выполнены следующие эксперименты моделирования МД с участием бактериородопсипа: мономер в вакууме; тример в вакууме; тример в окружении 30-ти липидных молекул; тример в окружении 30-ти липидных молекул, образующих билипидньш слой с двумя водными фазами с обеих сторон бислоя (Edholm et al., 1995). Пространственное совмещение основных цепей белка до и после моделирования МД в течение 300 пс показало, что RMS (среднеквадратичное отклонение) во всех случаях составило приблизительно 2-3 А, причем наибольшее значение RMS наблюдалось в случае моделирования бактериородопсипа в липидном би слое с двумя водными фазами. Более подробный анализ показал, что внутри спиралей бактериородопсина располагается 12 относительно стабильных молекул воды. Большинство из них обмениваются с внешними в течение моделирования МД. Детальное изучение термодинамической стабильности воды в пределах протонного пути бактериородопсина (Edholm et al., 1995) показало, что 4 из 12 молекул образуют сетку водородных связей и расположены в гидрофобной области. Было предположено, что эта вода играет важную роль в переносе протонов (Edholm et al., 1995).
Это показывает, что методы моделирования МД позволяют выявлять особенности функционирования мембранных белков, которые невозможно установить только из пространственной структуры белка
В белковом банке PDB (Berman et al., 2000) имеется 88 (http://b!anco. biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtai.html) структур мембраносвязанных белков, большинство из которых представляют большие интегральные белки. Так как цитохром Ь5 является периферическим белком, то для проверки пригодности модели бислоя для моделирования его структуры необходимо выполнение контрольных вычислений с использованием периферического белка, структура и топология которого известны.
В качестве контрольного мембраносвязанного периферического белка был выбран белок МАО А. Его структура и мембранная топология недавно были решены методами белковой кристаллографии (Ma et al., 2004) (рис. 7).
МАО А играет центральную роль в метаболизме важнейших нейромедиаторов-моноаминов. Изменение активности МАО А при многих нервно-психических расстройствах и возможность их коррекции ингибиторами МАО сделали его популярным объектом фундаментальных и клинических исследований (Yamada et al., 2004).
Оптимизация бислоя из ДПФХ
Цитохром Ь5 является мембранным белком и принимает участие в работе различных мембранных систем, выполняя роль переносчика электронов (Spatz et al., 1971). Так как он взаимодействует с другими мембранными белками, то предполагается важная роль его мембранного якоря для обеспечения ориентации белка. В тоже время пространственная структура Ь5 известна только для водорастворимого домена. Относительно структуры и топологии его мембранной части существуют противоречивые экспериментальные данные (Ozols, 1989; Tajima et al., 1980; Vergeres et al., 1995). Ряд исследований указывает на то, что мембранный домен Ь5 представляет собой спираль, пронизывающую бислой насквозь (Vergeres et al., 1995; Hanlon et al., 2000) (рис. 306). В других работах были получены данные о том, что этот участок имеет форму петли (Ozols, 1989) (рис. 30а). В последние годы развитие вычислительной техники и усовершенствование алгоритмов расчетов позволяет выполнять моделирование больших биологических молекул и их комплексов. Однако до сих пор остается трудностью моделирование процесса встраивания белковых молекул в липидный бислой. Поэтому в нашей работе для анализа и предсказания наиболее вероятной топологии мембранносвязанного домена Ь5 были построены две модели Ь5 с мембранным доменом в трансмембранной и петлевой топологиях.
Микросомальный цитохром Ь5 состоит из двух доменов: водорастворимого и мембранного. Водорастворимый домен Ь5 может быть получен путем обработки микросомальных мембран трипсином. Мембраносвязанный домен в свою очередь состоит из трех участков: связывающий, мембраносвязанный и С-концевой (рис. 31). Таким образом, мембраносвязанный участок связан с водорастворимым доменом с помощью соединительного участка. Топология соединительного участка относительно водорастворимого домена неизвестна, но было отмечено, что он является очень подвижным участком в белке (Clarke et al., 2004), поэтому для моделирования были выбраны две крайние возможные конформации этого участка. Таким образом, были построены две модели с трансмембранной топологией и две модели с петлевой топологией мембраносвязанного домена (рис. 33), которые были использованы для моделирования МД.
Модели цитохрома Ь5 были встроены в предварительно оптимизированный липидный бислой. Для трансмембранной и петлевой топологии Ъ5 были подготовлены разные модели бислоя. Для трансмембранной топологии Ь5 была сделана модель бислоя со сквозным отверстием для трансмембранного домена Ь5 (рис. 34а), для петлевой топологии модель бислоя была модифицирована путем удаления нескольких молекул липида в одном лепестке бислоя для освобождения места для мембранного домена Ъ5 в петлевой топологии (рис. 44а).
Моделирование МД цитохрома Ь5 в обеих топологиях проводилось в течение 3,0 не (рис. 35, 45). Ранее было показано, что этого времени достаточно системе бислой/белок/вода для завершения переходных процессов и достижения равновесия (Takaoka et al., 2000). Переходные процессы были отмечены при моделировании модели Ъ5 в Т-топологии. Они выражались во временном расхождении листков мембраны. Для всех четырех моделей равновесие было достигнуто в пределах 0,25 не моделирования МД. Однако следует отметить, что это не означало окончания оптимизации структуры белка и липидного окружения. Так, изменения положения водорастворимого домена относительно плоскости мембраны (т.е. изменения угла наклона гема относительно плоскости мембраны) продолжалось для разных моделей в пределах 0,6 - 1,3 не.
Основные характеристики исследованных моделей полноразмерного цитохрома Ь5 в мембранном окружении представлены в таблице 4. Сопоставление параметров моделей Ш и П2 показывает, что модель П2 обладает лучшими характеристиками по сравнению с Ш. Одним из таких параметров является то, что в процессе моделирования МД с моделью П2 происходит сближение водорастворимого и мембраносвязанного доменов, в результате чего практически исчезает пустое пространство между водорастворимым и мембраносвязапным доменами и ряд аминокислотных остатков водорастворимого домена контактирует с полярными головками липидов. Подобные эффекты со сближением водорастворимого и мембраносвязанного доменов наблюдались ранее при моделировании цитохрома Ь5 в П-топологии в системе бензол/вода (Иванов и др., 2000). Кроме этого, исходя из значений потенциальной энергии и RMS, модель П2 является более стабильной, чем модель П1. Положение мембраносвязанного домена в модели П1 (С-концевая область) оказывает влияние на подвижность участков в водорастворимом домене (Leu40 — Gly46, Рле62 - Asp70, Hisl9 - Thr25), важных для формирования комплексов с редокс партнерами цитохрома Ь5 и переноса электронов. Эти данные указывают на то, что модель П2 лучше отражает структуру цитохрома Ь5 в петлевой конформации мембранного домена.
Сопоставление моделей в П- и Т-топологии показывает, что модель в Т-топологии более стабильна и функциональна, чем структура цитохрома Ь5, в которой мембраносвязанный домен находится в петлевой конформации.
Переход топологии мембраносвязанного домена из петлевой в трансмембранную возможен при переходе амидной связи 1Ы14 - Prol 15 из цис- в транс-положение. Если Pro 115 находится в цис-положении, из одной спирали (Serl04 - Туг126) формируются две (Serl04 — Leul 13 и Неї 17 - Туг126) и между ними появляется поворот типа VI. При этом одна из этих спиралей имеет три карбоксильные группы, не образующие водородные связи, вторая спираль - три аминогруппы, также не образующие водородных связей {Richardson, 1981). В гидрофобном слое мембраны, где вероятность образования водородных связей с водой мала, потеря одной водородной связи оценивается примерно в 3-5 ккал/моль. Поэтому в мембранном окружении транс-конформация пролина является более стабильной, тогда как при нахождении белка в воде в петлевой конформации свободные карбоксильные и аминогруппы могут образовывать водородные связи с молекулами воды (Abeles et al., 1992). Кроме того, было отмечено, что расположение рядом с пролином Неї 14 способствует нахождению пролина в тран-положении (Vergeres, Waskell, 1995).
Изучение процесса встраивания цитохромаЬ5 в клеточные мембраны показало, что этот процесс происходит поеттрансляционно (Vergeres et al., 1995), не связан с SRP-частицами (Vergeres, Waskell, 1995), и не является АТФ-зависимым (High, Abell, 2004). Исследования с использованием специфических антител и цитохрома Ь5, связанного с тагом гликозилирования (глик-Ь5) показали, что в мембране этот белок присутствует в основном в трансмембранной конформации (Honsho et al., 1998; Hanlon et al., 2000), В одной из работ было показано, что при введении глик-Ь5 в клетку, обнаруживались две фракции: часть белка находилась в Т-топологии, часть белка - в П-топологии, через некоторое время практически весь белок переходил в Т-топологию, при этом авторы не зарегистрировали перехода цитохрома Ь5 из Т- в П-топологию (Honsho et al., 1998).
Построение и оптимизация модели липидного бислоя из ДПФХ
Основные характеристики исследованных моделей полноразмерного цитохрома Ь5 в мембранном окружении представлены в таблице 4. Сопоставление параметров моделей Ш и П2 показывает, что модель П2 обладает лучшими характеристиками по сравнению с Ш. Одним из таких параметров является то, что в процессе моделирования МД с моделью П2 происходит сближение водорастворимого и мембраносвязанного доменов, в результате чего практически исчезает пустое пространство между водорастворимым и мембраносвязапным доменами и ряд аминокислотных остатков водорастворимого домена контактирует с полярными головками липидов. Подобные эффекты со сближением водорастворимого и мембраносвязанного доменов наблюдались ранее при моделировании цитохрома Ь5 в П-топологии в системе бензол/вода (Иванов и др., 2000). Кроме этого, исходя из значений потенциальной энергии и RMS, модель П2 является более стабильной, чем модель П1. Положение мембраносвязанного домена в модели П1 (С-концевая область) оказывает влияние на подвижность участков в водорастворимом домене (Leu40 — Gly46, Рле62 - Asp70, Hisl9 - Thr25), важных для формирования комплексов с редокс партнерами цитохрома Ь5 и переноса электронов. Эти данные указывают на то, что модель П2 лучше отражает структуру цитохрома Ь5 в петлевой конформации мембранного домена.
Сопоставление моделей в П- и Т-топологии показывает, что модель в Т-топологии более стабильна и функциональна, чем структура цитохрома Ь5, в которой мембраносвязанный домен находится в петлевой конформации.
Переход топологии мембраносвязанного домена из петлевой в трансмембранную возможен при переходе амидной связи 1Ы14 - Prol 15 из цис- в транс-положение. Если Pro 115 находится в цис-положении, из одной спирали (Serl04 - Туг126) формируются две (Serl04 — Leul 13 и Неї 17 - Туг126) и между ними появляется поворот типа VI. При этом одна из этих спиралей имеет три карбоксильные группы, не образующие водородные связи, вторая спираль - три аминогруппы, также не образующие водородных связей {Richardson, 1981). В гидрофобном слое мембраны, где вероятность образования водородных связей с водой мала, потеря одной водородной связи оценивается примерно в 3-5 ккал/моль. Поэтому в мембранном окружении транс-конформация пролина является более стабильной, тогда как при нахождении белка в воде в петлевой конформации свободные карбоксильные и аминогруппы могут образовывать водородные связи с молекулами воды (Abeles et al., 1992). Кроме того, было отмечено, что расположение рядом с пролином Неї 14 способствует нахождению пролина в тран-положении (Vergeres, Waskell, 1995).
Изучение процесса встраивания цитохромаЬ5 в клеточные мембраны показало, что этот процесс происходит поеттрансляционно (Vergeres et al., 1995), не связан с SRP-частицами (Vergeres, Waskell, 1995), и не является АТФ-зависимым (High, Abell, 2004). Исследования с использованием специфических антител и цитохрома Ь5, связанного с тагом гликозилирования (глик-Ь5) показали, что в мембране этот белок присутствует в основном в трансмембранной конформации (Honsho et al., 1998; Hanlon et al., 2000), В одной из работ было показано, что при введении глик-Ь5 в клетку, обнаруживались две фракции: часть белка находилась в Т-топологии, часть белка - в П-топологии, через некоторое время практически весь белок переходил в Т-топологию, при этом авторы не зарегистрировали перехода цитохрома Ь5 из Т- в П-топологию (Honsho et al., 1998). Эти экспериментальные данные указывают на то, что Т-топология мембранного участка цитохрома Ь5, по видимому, является физиологической формой этого белка в клеточных мембранах, а конформация белка в П-топологии может присутствовать только как временная форма в процессе встраивания цитохрома Ъ5 в мембрану. Противоречивые данные о топологии мембраносвязанного домена могут быть обусловлены также разными временами регистрации. В равновесной системе цитохром Ь5 находился в Т-топологии, тогда как в короткие времена после введения белка, регистрировался цитохром Ь5 в П-топологии. В наших контрольных исследованиях при моделировании цитохрома Ь5 в Т-топологии в воде происходил излом мембранного якоря в районе Pro 115, что свидетельствует о том, что цитохром Ь5 может находиться в топологии, близкой к петлевой при встраивании в бислой.
Таким образом, наши данные по моделированию цитохрома Ь5 в разных топологиях согласуются с представлениями, что основной и наиболее устойчивой коиформацией мембранного якоря этого белка является трансмембранная топология, а в петлевой топологии цитохром Ь5 может находиться или в растворе, или ограниченное время после его встраивания в мембрану.
Сопоставление расчетных параметров моделей ТІ и Т2 показывает, что модель ТІ более устойчива. Это выражается в меньших величинах потенциальной энергии системы и RMS белка при моделировании МД, а также в скорейшем достижении стационарного состояния по RMS {рис. 35). Кроме того, в модели ТІ мембраносвязаиный участок остается более структурированным, чем в модели Т2. Эти данные указывают, что модель ТІ, может более точно отражать структуру цитохрома Ъ5 в бислое.
Основное различие этих моделей заключается в разной конформации соединительного участка (Ser89 - Asp 103). В модели Т2 он взаимодействует с петлей Hisl9 - Thr25, тогда как в модели ТІ этот участок расположен свободно (рис. 39). Таким образом, конформация соединительного участка относительно водорастворимого домена может оказывать влияние как на структуру и стабильность мембраносвязанного участка, так и на функцию белка.
Для оценки роли связывающего участка были проанализированы изменения в водорастворимом домене в обеих моделях, а также проанализированы районы потенциального взаимодействия Ь5 с редокс-партнерами. В настоящее время считается, что перенос электронов возможен по двум путям (рис. 52) (Storch, Daggett, 1995; Horn et al., 2000). Согласно первому из них, при переносе электронов гемы цитохрома Ь5 и редокс-партнеров располагаются в одной плоскости, и во взаимодействие вовлекаются аминокислотные остатки спиралей аЗ, а4 и петли между ними (GIu44, Glu48, Asp 60) (Rodgers et al., 1988). (рис. 52a). Согласно второму варианту пути переноса электронов, гемы редокс партнеров и цитохрома Ь5 располагаются перпендикулярно друг другу, при этом функционально важное значение имеет петля ccl-p2 (аминокислотные остатки His 19 - Thr 25), которая, изменяя конформацию, регулирует доступ к гему (Нот et al., 2000; Storch, Daggett, 1995) (рис. 526). В настоящее время существуют экспериментальные данные, подтверждающие возможность существования обоих путей передачи электронов (Storch, Daggett, 1995; Horn et al., 2000). Анализ подвижности аминокислотных остатков в ходе моделирования МД показал, что наблюдается повышенная подвижность участков, связанных с обоими путями переноса электронов (в модели ТІ Leu 40 - Gly 46, Phe 62 -Asp 70, His 19 - Thr 25). Однако анализ доступности гема для передачи электронов с участием петли al-p2 показал (расстояние Ser 22 - Ala 54), что "открывание" функционально важной петли было неполным.
