Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
Раздел I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Окислительный стресс 8
1.1 Активные формы кислорода: пути образования, основные
компоненты антиоксидантной системы 8
1.2. Этапы перекисного окисления фосфолипидов: NADPH зависимая электрон-
транспортная цепь эндоплазматического ретикулума 13
Глава 2. NADH-зависимая электрон-транспортная цепь 17
Переносчики NADH-зависимой редокс-цепи 17
Реакции, катализируемые МАРН-цитохром-Ьб-редуктазой (десатурация и элонгация жирных кислот, синтез холестерина, плазмалогенов и церамида)-19
Глава 3. Природные альдегиды и их биологические функции.
Метаболизм альдегидов в клетках млекопитающих 26
Малоновый диальдегид. Текущие представления о малоновом диальдегиде как о токсичной молекуле 26
Метилглиоксаль. Источники образования. Пути метаболизма 31
Метаболизм D-лактата в клетках млекопитающих 40
ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ 44
Раздел II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
Используемые препараты и реактивы 45
Получение супернатанта (10 000 д) из печени крыс 45
Выделение микросомальной фракции из печени крыс 46
Встраивание токоферола в микросомальную мембрану 47
Выделение митохондриальной фракции из печени крыс 47
Определение белка в субклеточных фракциях 49
Определение дыхательного контроля в митохондриях печени крыс --49
Инициирование окислительных процессов в микросомах и супернатанте
(10 000 д) 49
9. Измерение интенсивности перекисного окисления липидов 50
Регистрация накопления метилглиоксаля в супернатанте (10 000 д) 52
Определение редокс состояния цитохрома Ь5 52
Определение супероксида 54
Определение уровня D-лактата 54
14. Расчет концентрации регистрируемого продукта методом добавок 55
Определение активности глиоксалазы I 55
Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 57
Определение активности фосфоглюкоизомеразы 57
Статистический анализ данных 58
Раздел III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Влияние NADH-зависимой электрон-транспортной цепи
на образование МДА в микросомальных мембранах 59
1.1. Образование МДА при различных способах инициирования окислительных
процессов; эффект токоферола 59
1.2. Образование МДА в микросомальных мембранах; эффекты
МАО(Р)Н-цитохром-Ь5-редуктазы 65
Влияние мерсалила на индукционный период при инициировании окислительных процессов 67
Исследование редокс состояние цитохрома bs в микросомах и
оценка уровня супероксида при различных условиях инкубации 72
Глава 2. Возможность изомеризации альдегидов 77
Влияние глюкозо-6-фосфата и глутатиона на процесс накопления МДА 77
Исследование динамики накопления метилглиоксаля и D-лактата при
инициировании окислительных процессов 82
Глава 3. Метаболизм D-лактата в митохондриях печени крыс 88
Раздел IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91
Раздел V. ВЫВОДЫ 94
Раздел VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95
4 Список сокращений
АДФ - аденозиндифосфорная кислота
АТФ - аденозинтрифосфорная кислота
АФК - активные формы кислорода
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
МДА - малоновый диальдегид
ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты
ПОЛ - перекисное окисление липидов
ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
СшпООН - гидроперекись кумола
FAD - фавинадениндинуклеотид
FMN - флавинаденинмононуклеотид
GSH - глутатион восстановленный
GSSG - глутатион окисленный
L" - липидный (аллильный) радикал
LH - жирная кислота в составе фосфолипидов мембран
ЬОг" - перекисный радикал
LOOH - перекись липида
NADH - никотинамидадениндинуклеотид
NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
SOD - супероксиддисмутаза
ТО' - радикал токоферола
ТОН - токоферол
TQ - токоферилхинон
КоА - кофермент А
Введение к работе
Актуальность проблемы. На протяжении уже более полувека внимание исследователей привлекают окислительные процессы, в частности процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводящие к образованию липидных гидроперекисей [Sies, 1.991; Halliwell & Gutteridge, 1990]. Долгое время этот процесс представлял интерес лишь для узкого круга специалистов (радиобиологов), однако интерес к радикальным процессам заметно вырос после открытия ферментативного NADPH-зависимого ПОЛ в микросомах [Hochstein & Ernster, 1963], а в последние годы этот интерес значительно возрос в связи с изучением апоптоза [Fukasawa et ah, 1996].
Последовательность событий при апоптозе начинается с митохондрий, где происходит изменение функции цитохромоксидазы - переход на одноэлектронное восстановление кислорода (образование супероксида). Следствием этого является индукция ПОЛ, разрушение внешней мембраны, выход цитохрома с из межмембранного пространства и активация семейства каспаз [Ushmorov et al., 1999]. Учитывая это обстоятельство, актуальным становится вопрос о способе отключения защитной системы, и ответ на него предполагает изучение механизма антиоксидантного действия токоферола в сложно организованных структурах, таких как биологические мембраны.
Ясно, что он должен отличаться от механизма, реализуемого в гомогенных системах и липопротеидах. Согласно одной из гипотез [Dmitriev, 1995, Дмитриев, 1998], он может быть основан на кооперативном взаимодействии а-токоферола с одной из редокс цепей мембраны - NAD(P)H-цитохром-Ьб-редуктазой. Особенность предполагаемого взаимодействия а-токоферола с редокс-цепью, включающей в себя цитохром bs, в том что антиоксидантный эффект приобретает триггерный характер. Заметим, что в этом случае в ответ на активацию окислительного стресса в организме возможна реализация двух противоположных вариантов развития событий: в одном случае должны включаться системы, предотвращающие повреждение клеток, а в другом случае (апоптоз) - такие системы должны быть отключены. Недавно показано, что в условиях гипоксии уменьшается экспрессия и синтез
цитохрома D5 [Мок et ah, 2006]; в период реоксигенации это может привести не только к усилению образования первичных радикалов, но и к потере контроля над перекисным окислением липидов.
Продуктом перекисного окисления липидов являются липидные гидроперекиси, которые превращаются в оксикислоты либо распадаются с образованием ряда альдегидов, в частности малонового диальдегида (МДА). МДА - токсичное соединение, которое легко взаимодействует с сульфгидрильными и аминогруппами белков, что приводит к образованию межмолекулярных сшивок и полимеризации белков (формирование липофусциновых гранул) [Del Rio et ah, 2005]. Поэтому в клетке (цитоплазме и митохондриях) должна существовать система, ответственная за утилизацию альдегида. В митохондриях присутствует альдегиддегидрогеназа, метаболизирующая МДА в малоновую кислоту, которая затем превращается в ацетат [Sui et al, 1982]. Что касается метаболизма МДА в цитоплазме, то этот вопрос остается открытым.
При изучении клеточного метаболизма наряду с малоновым диальдегидом представляет интерес и кетоальдегид - метилглиоксаль. Обычно повышение в организме уровня метилглиоксаля связывают с усилением гликирования белков, индукцией семикарбазид-чувствительной аминооксидазы, либо с потенцированием бактериальной транслокации (транспорт бактериальной микрофлоры из кишечника во внутреннюю среду организма) [Kalapos, 1999; Wiest & Rath, 2003]. В настоящее время образование МДА в процессе перекисного окисления липидов (( -зависимый процесс) и увеличение уровня метилглиоксаля в результате гликирования белков (Ог - независимый процесс) рассматриваются как два независимых явления.
В последнее время появилась серия статьей, в которых показано накопление малонового диальдегида при инициировании гликирования белков или индукции аминооксидазы [Al-Shabanah et al, 2000; Deng et al, 1998]. Неясно, является ли образование МДА в этих случаях результатом перекисного окисления или какого-то другого процесса. Если учесть, что
7 МДА является трехуглеродным диальдегидом, а метилглиоксаль трехуглеродным кетоальдегидом (это два изомера), то можно предположить наличие в цитозоле клеток фермента, осуществляющего изомеризацию альдегидов [Дмитриев, 1992]. Практически это может решить вопрос об утилизации МДА, поскольку становится возможным его превращение в метилглиоксаль и далее в нейтральный продукт D-лактат с помощью мощной глиоксилазной системы, содержащей два фермента глиоксалазу I, глиоксалазу II [Thornalley, 1990].
Что касается D-лактата, то после открытия в митохондриях печени D-лактатдегидрогеназы его метаболизм представляет самостоятельный интерес [Bari, 2002]. В контексте данной работы это означает, что альдегиды могут быть предшественниками пирувата и, более того, - первичными субстратами глюконеогенеза.
