Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
1.1. Актуальность проблемы 7
1.2. Научная новизна и практическая значимость 10
1.3. Апробация работы 10
1.4. Основные положения, выносимые на защиту 12
2. Обзор литературы 13
2.1. Моноаминоксидаза 13
2.1.1. Физиология МАО 15
2.1.1.1. Распределение в клетках и тканях 15
2.1.1.2. Функции МАО 15
2.1.1.3. Регуляция 18
2.1.2. Биохимия МАО 21
2.1.2.1. Субстраты 21
2.1.2.2. Механизмы и кинетика реакций, катализируемые МАО 22
2.1.3. Молекулярная биология МАО 28
2.1.3.1. Генная структура и локализация 28
2.1.3.2. Функциональные участки 31
2.1.3.2.1. Динуклеотид-связывающая область 33
2.1.3.2.2. Первый дополнительный участок связывания ФАД 36
2.1.3.2.3. Второй дополнительный ФАД-связывающий участок 39
2.1.3.2.4. Активные центры МАО А и Б 42
2.1.3.2.5. Другие функционально важные аминокислотные остатки 46
2.1.3.2.6. Мембранный якорь 46
2.1.3.3. Пространственная структура МАО Б 51
2.1.3.4. Пространственная структура МАО А 62
2.1.4. Медицинская химия МАО (ингибиторы) 65
2.2. Методы компьютерного конструирования лекарств. Общие положения 75
2.2.1. Прямые методы компьютерного конструирования лекарств . 79
2.2.1.1. Скрининг баз данных низкомолекулярных соединений 80
2.2.1.2. Конструирование новых лигандов молекулярно-графическими методами 82
2.2.2. Непрямые методы конструирования лекарств 83
2.2.3. Взаимосвязь разных подходов и их связь с экспериментом . 89
2.2.4. Компьютерное моделирование МАО и ее ингибиторов 92
2.3. Заключение 94
3. Объекты и методы 96
3.1. Объекты 96
3.2. Методы 98
4. CLASS Результаты CLASS 103
4.1. Построение 3D-QSAR и CoMFA моделей активных центров МАО А и Б 105
4.1.1. 3D-QSAR и CoMFA модели производных индола и изатина . 106
4.1.2. 3D-QSAR и CoMFA анализ производных пиразинокарбазола 116
4.1.3. 3D-QSAR и CoMFA модели производных карбобензоксиэтиламина (КЭА), анилида Р-аланина (АА) и карбобензоксиэтилдиамина (КЭДА) 133
4.2. Моделирование полости активного центра фермента 142
4.2.1. Разработка подхода по моделированию полости активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой . 142
4.2.2. Построение слепков МАО 148
4.2.2.1. Построение слепка активного центра МАО А 148
4.2.2.2. Построение слепка активного центра МАО Б 155
4.2.2.3. Сопоставление слепка активного центра МАО Б с пространственной структурой фермента 160
4.2.2.4. Сопоставление слепка активного центра МАО А с пространственной структурой фермента 168
4.2.2.5. Оценка эффективности совместного использования моделей слепка активного центра и 3D-QSAR с CoMFA моделей 171
4.2.2.6. Апробация подхода по поиску ингибиторов в молекулярных базах данных методом докинга в слепок 173
4.3. Компьютерное моделирование и поиск новых ингибиторов МАО 179
4.3.1. Поиск потенциальных ингибиторов МАО А методом молекулярного докинга в базе данных низкомолекулярных веществ 179
4.3.2. Поиск ингибиторов МАО Б в молекулярной базе данных 186
4.3.3. Поиск неселективных ингибиторов МАО 189
5. Обсуждение 201
6. Выводы 224
7. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации . 226
8. Список литературы 232
- Механизмы и кинетика реакций, катализируемые МАО
- Взаимосвязь разных подходов и их связь с экспериментом
- Разработка подхода по моделированию полости активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой .
- Поиск потенциальных ингибиторов МАО А методом молекулярного докинга в базе данных низкомолекулярных веществ
Введение к работе
Развитие биомедицинской химии, связанной с теоретической и клинической медициной, требует изучения и анализа структуры и функций ключевых ферментов клеточного метаболизма. Одно из основных направлений в этих исследованиях связано с использованием компьютерных технологий для анализа данных, планирования экспериментов и обработки их результатов. Заметное место в этих подходах занимает компьютерное моделирование структуры биологических молекул, их взаимодействия друг с другом, поиск новых биологически активных соединений. Данная область исследований получила название «компьютерное конструирование лекарств» [Marrone et al, 1997; Zeng, 2000]. Использование компьютерных технологий для визуализации пространственных структур макромолекул, моделирования взаимодействия макромолекул с низкомолекулярными лигандами, оценки энергии взаимодействия, моделирования новых соединений и предсказания их свойств позволяет значительно ускорить создание новых лекарственных препаратов [Marrone et al, 1997; Zeng, 2000].
Одним из ключевых ферментов, участвующий в катаболизме медиаторных аминов в центральной нервной системе и периферических тканях, является моноаминоксидаза (МАО; К.Ф. 1.4.3.4). Несмотря на то, что этот фермент был открыт более 75 лет назад, он по-прежнему остается важным объектом фундаментальных и клинических исследований [Горкин, Медведев, 1995;Типтон, 1997].
Моноаминоксидаза является флавин-содержащим ферментом, локализованным во внешней мембране митохондрий. В организме млекопитающих МАО присутствует в двух формах - МАО А и МАО Б, которые кодируются разными, хотя и высоко гомологичными генами [Shin, et al., 1999; Abell, Kwan, 2001]. Эти формы различаются по чувствительности к ингибиторам и по преимущественному окислению субстратов [Горкин, Медведев, 1995; Wouters, 1998]. В организме МАО А и МАО Б, по-видимому, выполняют разные функции, на что указывают различная локализация ферментов в тканях и преимущественное окисление определенных субстратов [Abell, Kwan, 2001].
Изменение активности этого фермента обнаружено при многих нервно-психических расстройствах (болезни Паркинсона и Альцгеймера, депрессии и др.) [Wouters, 1998; Горкин, Медведев, 1995; Jegham, George, 1998 Yamada, Yasuhara, 2004]. Применение ингибиторов МАО в клинической практике дает выраженный терапевтический эффект и нормализацию состояния больных. Ингибиторы МАО А (такие как моклобемид, брофаромин, пиразидол, тетриндол и др.) нашли свое применение в качестве антидепрессантов, а некоторые ингибиторы МАО Б (например, депренил) применяются для лечения болезни Паркинсона [Cesura, Pletscher, 1992; Blanco et al., 2002; Chiap et al., 2002]. Возможно применение ингибиторов МАО в лечении алкогольной и никотиновой зависимостей [Domino, 1996; Farren et al., 1998]. Поэтому разработка новых ингибиторов этих ферментов остается актуальной задачей [Tipton, 1989; Типтон, 1997; Tipton, 2000].
Долгое время разработку новых эффективных ингибиторов МАО сдерживало отсутствие информации о пространственных структурах этих ферментов. Поэтому исследователи с помощью различных экспериментальных методов пытались выявить структурные особенности этих белков: были определены аминокислотные последовательности различных моноаминоксидаз, процентное содержание вторичных структур в белковой глобуле, место ковалентного связывания кофактора - флавинаденилдинуклеотид (ФАД) - с белком [Wouters, 1998]. В результате анализа последовательностей, конструирования химерных молекул и точечного мутагенеза были предсказаны участки белка, ответственные за нековалентное связывание флавинового кофактора [Zhou et al., 1995; Tsugeno et al., 1995; Chen et al., 1996; Grimsby et al., 1996]. Было установлено несколько ключевых аминокислот, ответственных за связывание субстрата и участие в катализе [Tsugeno, Ito, 1997; Geha et al., 2001; Cesura et al., 1998]. Однако использование косвенных экспериментальных данных не позволяло оценить структуру и свойства активных центров МАО А и МАО Б. Даже появившиеся в 2002 и 2004 годах пространственные структуры МАО Б [Binda et al., 2002] и МАО A [Ma et al., 2004] оставляют нерешенными многие вопросы об особенностях их взаимодействия с различными ингибиторами.
Отсутствие данных о пространственных структурах этих ферментов и наличие большого числа обратимых и механизм-активируемых ингибиторов этих ферментов стимулировало активное применение методов компьютерного моделирования для анализа особенностей строения этих ферментов.
Таким образом, к началу данного исследования, существовавшие данные о строении МАО А и МАО Б, не позволяли охарактеризовать пространственные структуры их активных центров, что значительно препятствовало поиску новых эффективных ингибиторов этих ферментов.
Поэтому целью данной работы был компьютерный анализ структур активных центров моноаминоксидаз и разработка подходов для создания ингибиторов этих ферментов с заданной селективностью.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Проанализировать репрезентативные ряды низкомолекулярных лигандов МАО А и Б и определить общие черты и особенности структур лигандов для каждого типа ферментов.
2. Провести анализ структуры активных центров МАО А и Б методом 3D-QSAR с использованием ингибиторов, отличающихся механизмом действия и относящихся к разным химическим классам.
3. Разработать метод моделирования полости активного центра фермента с неизвестной трехмерной структурой и проверить корректность подхода на примере ферментов с известной пространственной структурой.
4. Построить модели активных центров МАО А и Б.
5. Провести поиск новых базовых структур ингибиторов МАО А и Б с заданной селективностью.
1.2. Научная новизна и практическая значимость.
Впервые методами 3D-QSAR и CoMFA проанализировано несколько репрезентативных рядов ингибиторов МАО А и МАО Б (производных пиразинокарбазола, индола и изатина и карбобензоксиэтилами, анилида Р-аланина и карбобензоксиэтилдиамина) и построены модели активных центров этих ферментов. Предложена методика моделирования полости активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой для поиска новых ингибиторов в базах данных низкомолекулярных соединений. Показано, что докирование соединений в модель полости активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой с последующей оценкой их активности по 3D-QSAR и CoMFA моделям является эффективным методом для поиска новых ингибиторов. Показана возможность создания нового поколения ингибиторов МАО, способных с одинаковой эффективностью тормозить оба типа этих ферментов в фармакологически значимом диапазоне концентраций. Найден ряд новых базовых структур селективных и неселективных ингибиторов МАО А и МАО Б, которые могут быть использованы для разработки новых антидепрессантов.
1.3. Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях:
- IV Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997);
- The 2nd Electronic Molecular Graphics and Modelling Conference (MGM EC-2) on the Internet and World Wide Web (http://www.vei.co.uk/mgmec2/), (1997);
- 12 International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations (Montpellier, France, 1998);
- 8th International Amine Oxidase Workshop. (Hungary, 1998);
- V Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999);
- The Electronic Conference "Molecular Simulation 99" on the Internet and World Wide Web (http://molsim.vei.co.uk) (1999);
- VI Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2000);
- 9th International Amine Oxidase Workshop. Amine oxidases: enzymes with novel functions? (Barselone, 2000);
- 7th international summer school on biophysics "Supramolecular structure and function" (Rovinj, 2000);
- 4 INTAS Interdisciplinary Symposium on Physical and Chemical methods in Biology, Medicine, and Environment (Moscow, 2001);
- IX Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2002);
- I Национальная конференция «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины», (Москва, 2002);
- International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine". (StPetersburg-Moscow, 2002);
- II Национальная конференция «Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины» (Москва, 2003);
- 5th International Conference on Molecular Structural Biology (Vienna, 2003);
- 2th International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine". (Moscow-Pies-Moscow, 2004).
а также на конкурсах научных работ ГУ НИИ БМХ РАМН (1999, 2001).
1.4. Основные положения, выносимые на защиту
1. Предложен подход для компьютерного анализа структур активных центров ферментов с неизвестной пространственной структурой и поиска новых базовых структур ингибиторов, включающий: а) анализ структур конкурентных обратимых ингибиторов с ограниченной конформационной подвижностью; б) преимущественную оценку стерического фактора, определяющего возможность размещения лиганда в активном центре; в) построение компьютерных моделей полости активного центра фермента, отражающих его форму и размеры; г) проверку достоверности моделей с использованием близких аналогов с разными размерами и отличающихся ингибиторной активностью; д) поиск лигандов в молекулярных базах данных с использованием таких моделей; е) экспериментальную проверку новых ингибиторов. Эффективность использования данного подхода была показана в прямых экспериментах на фармакологически важном объекте — моноаминоксидазах типа А и Б.
2. Построены модели активных центров МАО А и МАО Б (фармакофорные модели, 3D-QSAR и CoMFA модели и модели слепков активных центров ферментов), позволяющие охарактеризовать структурные особенности строения активных центров этих ферментов.
3. Обоснован и экспериментально проверен на примере моноаминоксидаз типа А и Б подход по компьютерному поиску новых базовых структур лигандов в базах данных низкомолекулярных соединений для ферментов с неизвестной пространственной структурой. С использованием предложенного подхода обнаружены новые селективные и неселективные ингибиторы МАО, которые могут быть использованы в качестве оригинальных базовых структур для разработки новых эффективных ингибиторов МАО.
4. Доказана принципиальная возможность создания нового поколения обратимых ингибиторов МАО, неселективно ингибирующих оба типа ферментов в фармакологически значимом диапазоне концентраций.
Механизмы и кинетика реакций, катализируемые МАО
Реакция, катализируемая МАО, состоит из двух этапов: восстановительного этапа, в котором окисляется субстрат и восстанавливается ФАД, и окислительного, включающего в себя окисление ФАД молекулярным кислородом с образованием перекиси водорода. Конечным продуктом каталитического цикла является имин. Последний неферментативным путем гидролизуется водой до аммиака и альдегида.
Термодинамической особенностью окислительного дезаминирования, катализируемого МАО, является то, что амины с редокс-потенциалом около +1 В окисляются молекулярным кислородом с образованием перекиси водорода, у которой потенциал равен +0,3 В, через окислительно-восстановительную реакцию ФАД/ФАДН2. У последней пары редокс-потенциал обычно равен -0,2 В. Каким образом происходит данная реакция в настоящее время не совсем понятно [Рамсей, 1997].
Остается не до конца выясненным химический механизм окисления аминов МАО. Были высказаны три возможных механизма окислительного дезаминирования: - радикальный механизм; - через перенос гидридиона; - через окисление промежуточного карбаниона [Рамсей, 1997]. Наиболее экспериментально обоснованной гипотезой является радикальный механизм, схема которого представлена на рисунке 1. Перенос одного электрона с аминогруппы на флавин сопровождается разрывом а-С-Н связи, что приводит к образованию амин-радикала (радикал-катиона), который, теряя протон, может превращаться в карборадикал [Рамсей, 1997]. Далее реакция может протекать по трем направлениям. Для субстратов с низким потенциалом окисления осуществляется передача второго электрона на образованный флавин-радикал (путь а). Субстраты с высоким потенциалом окисления, возможно, взаимодействуют с аминокислотным радикалом (вероятнее всего с цистеин-радикалом) активного центра фермента (путь Ь). Возможна также прямая передача атома водорода от амин-радикала (путь с). В результате получается имин [Silverman, 1991]. Последний неферментативным путем гидролизуется водой до аммиака и альдегида.
Рисунок 1. Схема радикального механизма окисления моноаминов [Silverman, 1991]. Fl - окисленная форма флавина; FL - флавин-радикал; F1H - восстановленная форма флавина; X - аминокислотный остаток в активном центре фермента. В последнее время было выдвинуто предположение о наличие редокс-активной дисульфидной группы в активном центре как МАО А, так и МАО Б. Вероятно, при окислении амина, электроны сначала передаются на дисульфиды, а затем уже на флавин. Образование в МАО карбоксил-имидазол-дисульфидной триады, подобно таковым в дисульфидоксидоредуктазах, приводит к увеличению положительного заряда на дисульфидной группировке, что облегчает передачу электронов с амина субстрата на ФАД [Sablin, Ramsay, 1998; Ramsay, Sablin 1999].
Исследование кинетики ферментативной реакции с участием МАО в равновесном состоянии с использованием различных субстратов показало, что реакция может протекать по двум механизмам [Ramsay, Singer, 1991]. В первом случае продукт последовательно освобождается из восстановленного фермента перед его реокислением (верхняя часть схемы на рисунке 2), то есть образуется двойной комплекс с субстратом и продуктом (пинг-понговый механизм). В другом случае происходит образование тройного комплекса с ферментом и кислородом (нижняя часть схемы рисунка 2) [Singer, 1985].
Выбор пути, по которому будет протекать реакция, определяется соотношением констант диссоциаций (к и к5 ) и зависит от концентраций субстратов (амина и кислорода) и продукта реакции. Если kt для ЕгР комплекса больше, чем к5 для свободного фермента, реоксидация идет по пинг-понговому механизму. Это характерно для МАО А и МАО Б с бензиламином, триптамином и тирамином в качестве субстрата. Если субстратом для МАО Б является фенилэтиламин (ФЭА) (к5 больше kt), то комплекс ЕгР быстро диссоциирует и кислород взаимодействует с восстановленным свободным ферментом.
Взаимосвязь разных подходов и их связь с экспериментом
Компьютерная часть поиска и оптимизации структуры заканчивается на предоставлении экспериментаторам списка потенциальных лигандов с оценкой их эффективности (рис. 22). Экспериментальная проверка должна ответить на вопросы: 1) проявляют ли выбранные соединения требуемую активность?; 2) и если проявляют, достаточно ли они активны для последующего фармакологического тестирования? Если соединения неактивны, проводят второй цикл компьютерного моделирования, с учетом полученных отрицательных результатов (модифицирование фармакофорной и/или QSAR модели, использование другой молекулярной базы данных, дополнительный анализ активного центра фермента: определение возможности изменения конформации лигандов и/или активного центра при их взаимодействии, учет участия молекул растворителя во взаимодействии и др.). Если сконструированные соединения обладают высокой искомой активностью in vitro, их передают для дальнейших фармакологических испытаний. Однако, когда соединения обладают искомой активностью, но она низкая, то проводят цикл оптимизации структуры для повышения их активности. Для этого используют программы конструирования de novo, когда структура мишени известна, в противном случае для оптимизации применяют QSAR модели. При этом необходим синтез группы родственных соединений с выбранной базовой структурой и экспериментальное определение активности. Такой цикл оптимизации может проходить несколько раз. В дальнейшем возможен также цикл компьютерного моделирования, связанный с оптимизацией фармокинетических свойств (адсорбция, проникновение через клеточные барьеры, метаболизм - ADME) выбранных соединений [Clark, Pickett, 2000].
В последние годы наметились тенденции совместного использования прямых и непрямых методов конструирования новых биологически активных лигандов. Выше уже упоминалось построение моделей активных центров ферментов для использования их при поиске новых соединений в молекулярных базах данных методом докинга.
Другим примером является построение 3D-QSAR модели для последующего предсказания активности соединений, найденных в базах или сконструированных de novo когда известна пространственная структура мишени. Это обусловлено значительными трудностями перевода виртуальных энергий, рассчитываемых компьютерными программами, в реальные величины констант ингибирования (Kd, КІ5 ІС5о). Для этого 3D-QSAR модели строят по наборам молекул, выровненных по выбранным исследователями правилам [Hilgeroth, 1999; Sippl, 2000], или первоначально проводят докинг этих лигандов в полость активного центра фермента, и на основании полученного выравнивания лигандов строят 3D-QSAR модели [Sippl, 2000; Sippl et al., 2001].
Исходно компьютерные методы поиска новых лигандов направлены на обнаружение лигандов, обратимо связывающихся с мишенью. В последние годы наметились подходы к компьютерному конструированию необратимых ингибиторов. Для этого предлагают использовать соединения, которые условно состоят из двух частей: одна должна обратимо связываться с мишенью, вторая часть представляет собой средней силы реакционную группировку, способную ковалентно связываться с определенным аминокислотным остатком. Взаимодействие такой молекулы с мишенью проходит в два этапа. Сначала первая часть молекулы обратимо связывается с мишенью и ориентирует вторую часть молекулы так, чтобы реакционная группировка второй части молекулы расположилась рядом со своей аминокислотой. В результате должен образоваться ковалентный комплекс, что приведет к значительному увеличению эффективности ингибитора [Way, 2000]. Такие соединения могут быть наиболее полезны в качестве антимикробных и антивирусных препаратов и к настоящему времени уже известен ряд примеров успешного применения этой стратегии [Violette et al., 2000; Zutshi, Chmielewski, 2000].
Таким образом, компьютерное конструирование лекарств представляет собой комплексную дисциплину, использующую достижения в разных областях науки и различные методы и подходы. Она направлена на ускорение и оптимизацию поиска новых биологически активных соединений. В то же время, эти подходы не могут заменить экспериментальные методы тестирования. CADD направлен на генерацию гипотез о вероятных новых лигандах и проверку их достоверности. Считается, что методы CADD могут уменьшить количество синтезированных и проверенных на биологическую активность соединений примерно на два порядка. Т.е. они могут существенно снизить временные и финансовые затраты на разработку новых лекарственных соединений. Однако необходимо отметить, что CADD является дополнительным звеном на первом этапе разработки новых лекарств. Это направление можно уподобить ферментам в биохимических реакциях, которые могут ускорять реакцию, снижать активационный барьер, но не способны изменить направление реакции.
В последние годы была продемонстрирована высокая эффективность компьютерных методов поиска новых соединений. Появился ряд работ, в которых были сопоставлены методы компьютерного поиска новых соединений в молекулярных базах данных и экспериментального высокоэффективного скрининга [Doman et al., 2002; Bissantz et al., 2000, 2003]. Показано, что компьютерные методы позволяют более эффективно находить новые активные соединения, даже при использовании не кристаллических структур, а их компьютерных моделей белков-мишеней [Bissantz et al., 2003].
Компьютерные технологии могут быть использованы и на других этапах разработки лекарственных средств. Появились подходы по поиску новых перспективных мишеней для лекарственных препаратов путем анализа геномной информации [Дубанов и др., 2001; Freiberg, 2001; Spaltmann et al., 1999]. Существуют различные компьютерные модели, направленные на предсказание различных фармокинетических свойств соединений (ADME) по их структурным формулам [Clark, Pickett, 2000]. Разработаны экспертные системы, которые способны на основании структурной формулы низкомолекулярного вещества предсказывать вероятный спектр их биологической активности. Такие системы могут быть использованы для отбора соединений для экспериментального тестирования на требуемую активность, а также для предсказания возможных побочных эффектов (токсичность, мутагенность, канцерогенность и т.д.). Примером такой программы может быть PASS (www.ibmh.msk.su/PASS) [Poroikov et al., 2000, 2002].
Разработка подхода по моделированию полости активного центра фермента с неизвестной пространственной структурой .
Задача построения слепка с субстрат-связывающей области активного центра МАО в некотором смысле «облегчалась» тем, что известно несколько групп ингибиторов этих ферментов, обладающих достаточно жесткой структурой (производные индола, изатина, пиразинокарбазола). Последнее обстоятельство значительно сокращает количество возможных конформеров. Соединения такого типа были выбраны в качестве остова при построении слепка.
Построение слепка активного центра МАО А.
Структуры использованных ингибиторов МАО А представлены в таблице 17. Поскольку фармакофорная модель МАО А состоит из фенольного кольца и расположенного рядом с ним атома кислорода или азота, несущего отрицательный парциальный заряд, то все молекулы ингибиторов этого фермента были выровнены по вышеуказанным фармакофорным элементам. В основу построения слепков легли молекулы, имеющие в своей структуре жесткое ядро (молекулы 14, 17, 26, табл. 17).
Предсказание положения боковых группировок было основано на двух подходах. Первый заключался в использовании данных о структуре активного центра МАО, полученных с помощью 3D-QSAR + CoMFA моделей, построенных по структурам ингибиторов МАО из классов индола и изатина и пиразинокарбазолов, которые позволили предсказать благоприятные и неблагоприятные области для нахождения заместителей.
Второй подход включал конформационный анализ боковых радикалов ингибиторов и нахождение таких конформеров, у которых группировки, потенциально участвующие в связывании с белком, пространственно сближены. Были совмещены фенольные кольца радикалов у молекул 1, 13, 22 с одной стороны базовых молекул и фенольные кольца радикалов у молекул 6, 24 с другой стороны базовых молекул; атомы кислорода карбоксильной группы у молекул 6, 19; азота цианогруппы - у молекул 1 и 3; азота - у 8, 20, 21 и другие группировки. Полученный таким методом слепок активного центра МАО А представлен на рисунке 43.
Совмещение стерических полей, выбранных на первом этапе работы 3D-QSAR моделей МАО А, и полученного слепка активного центра этого фермента показывает их хорошее соответствие (рис. 44). Так области, неблагоприятные для заместителей, находились за пределами слепка, в то время как области, которые предсказываются по моделям как благоприятные для наличия заместителей, располагались внутри него.
Первоначальную проверку достоверности отражения формы и размера активного центра МАО А полученным слепком проводили с использованием соединений, обладающих жесткой структурой и проявляющих относительно низкую или высокую ингибиторную активность в отношении этого фермента. Для этого были использованы субстраты - аналоги МФТП и полусинтетический антибиотик из ряда фторхинолонов - норфлоксацин. Последний удовлетворяет фармакофорной модели для ингибиторов моноаминоксидазы А и для отмечены побочные эффекты на ЦНС.
Сопоставление аналогов МФТП со слепком показало, что МФТП хорошо помещается в полость слепка (рис. 45), тогда как его аналоги, являющиеся плохими субстратами МАО А (см. таблицу на рис. 45), не могут поместиться в нем (рис. 45Б и рис. 45В). На рисунке видно, что некоторые участки этих соединений выступают за границы слепка. На рисунке 46 видно, что схожий результат сопоставления слепка МАО А и потенциального ингибитора был получен для норфлоксацина. Экспериментальная проверка показала, что норфлоксацин являя слабым ингибитором МАО А (в концентрации 1 мМ он ингибирует фермент всего на 26%). Это указывало, что построенный слепок с активного центра МАО А, как минимум в двух областях, правильно определяет размеры полости активного центра.
Поиск потенциальных ингибиторов МАО А методом молекулярного докинга в базе данных низкомолекулярных веществ
Для поиска потенциальных ингибиторов МАО А была использована одна из баз данных низкомолекулярных веществ фирмы ASINEX, содержащая на момент выполнения работы 7725 коммерчески доступных соединений. Алгоритм поиска представлен на рисунке 60.
На первом этапе был осуществлен препроцессинг базы. Поскольку фармакофорная модель МАО А состоит из двух фармакофорных элементов -ароматического кольца и гетероатома (рис. 25А), а все известные лиганды этого фермента относительно невелики по размеру, то в результате препроцессинга из молекулярной базы были удалены молекулы: - без ароматических колец или содержащие их более пяти штук; - содержащие более 25 углеродных атомов, - не имеющие в своей структуре ни одного атома азота или кислорода, - содержащие металлы, - содержащие в своей структуре 3 и более атомов серы, - заряженные молекулы.
После удаления этих молекул в базе осталось 6130 соединений. Поскольку в базе данных структура молекул представлена в 2D форме, после конвертации их в 3D форму их конформации могут отличаться от биологически активной, для оставшихся соединений были рассчитаны возможные конформеры, что увеличило количество соединений для локирования примерно до 50000.
Следующим этапом было поочередное локирование всех структур из полученной выборки в полость слепка активного центра МАО А. Было найдено, что в полость может поместиться 27600 структур, а количество гипотез о возможном расположении этих молекул в полости активного центра превысило один миллион.
Для первоначальной оценки положения потенциальных ингибиторов в полости активного центра МАО А использовали критерий перекрывания поверхностей отдокированных молекул с «ядром» слепка. В качестве "ядра" была выбрана молекула пиразидола, положение которой соответствовало расположению пиразидола при построении слепка. Такой фильтр позволяет исключить из рассмотрения гипотетические комплексы, где лиганд располагается на периферии и не взаимодействует с основными группами в активном центре. Уровень отбора гипотетических комплексов по величине пересечения с поверхностью «ядра» места связывания был выбран в 90 % от максимально полученного значения. В результате было отобрано 15650 гипотез для 7048 молекул.
Следующим этапом было предсказание величин ингибиторной активности для МАО А по трем 3D-QSAR и CoMFA моделям (модели 1а, 2в и За). По предсказанным значениям было отобрано 383 конформера 137 молекул, для которых величины ингибиторной активности (1С5о) были выше 10"6 М по модели 2в и не менее 10"4 М по модели 1а и За. Это обусловлено разными механизмами действия этих групп ингибиторов.
Однако пространственное положение после докинга этих молекул не совпадало с правилами выравнивания для 3D-QSAR моделей, по которым проводилось предсказание активности. Поэтому отобранные молекулы были точно выровнены по ароматическому кольцу молекулы пиразидола с учетом того, чтобы рядом с атомом азота находился отрицательно заряженный атом азота или кислорода. Для выровненных молекул было повторно предсказана их ингибиторная активность и отобрано 20 соединений с лучшими предсказанными активностями (табл. 23).
Для экспериментальной проверки были выбраны 4 соединения (что составляет приблизительно 0,05% от всей молекулярной базы), относящиеся к разным классам, имеющие жесткую базовую структуру и фармакофорные элементы, характерные для МАО А. Результаты проверки представлены в таблице 24. Как видно, все соединения в той или иной степени, тормозили МАО
А, причем лучшее из них (соединение 4) имеет значение 1С5о порядка 10"5 М. Экспериментальная проверка показала, что ни одно из соединений не ингибирует МАО Б. Т.е. были найдены новые селективные ингибиторы МАО А.
Сопоставление этих соединений и слепка активного центра МАО Б показало, что ни одна из проверяемых молекул не помещается в полость активного центра МАО Б, хотя по 3D-QSAR моделям и предсказывается их достаточно высокая ингибиторная активность для этого фермента. Сравнение структур найденных новых селективных ингибиторов с кристаллической структурой активного центра МАО Б [Binda et al., 2002] выявило, что эти соединения не помещаются в полость активного центра (рис. 61). Выравнивание в активном центре МАО Б было проведено по фенольным кольцам ингибиторов и необратимого ингибитора паргилина, с которым был кристаллизован белок.
Следует отметить, что найденные селективные ингибиторы МАО А не предсказываются в качестве ингибиторов этого фермента экспертной системой PASS [Poroikov et al., 2000], основная функция которой является предсказание спектра биологической активности соединений по ее структуре на основании анализа обучающих выборок. Это указывает на то, что найденные структуры относятся к новым химическим классам ингибиторов МАО, либо обучающая выборка PASS по ингибиторам МАО неполная. Но нам не удалось обнаружить данных по ингибированию МАО соединениями из данных химических классов.
Недостаточно высокие величины ингибиторной активности соединений из таблицы 24 возможно обусловлены наличием некоторых боковых радикалов, препятствующих эффективному связыванию субстрата с ферментом. Дальнейший анализ этих структур и подбор более удачных заместителей может привести к увеличению желаемой активности, и, соответственно, разработке эффективного селективного ингибитора МАО А.
