Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Холинэстеразы различных организмов 9
1.1.1. Нетипичные ацетилхолинэстеразы 10
1.1.2. Нетипичные бутирилхолинэстеразы 11
1.2 Механизм взаимодействия ХЭ с лигандами 12
1.2.1. Взаимодействие с субстратами 12
1.2.1.1. Первая стадия - образование продуктивного фермент- субстратного комплекса 12
1.2.1.2. Вторая стадия — ацилирование фермента 14
1.2.1.3. Третья стадия - деацилирование фермента 15
1.2.2 Взаимодействие ХЭ с обратимыми ингибиторами 15
1.2.3. Взаимодействие ХЭ с необратимыми ингибиторами 16
1.2.3.1. Первая стадия - образование фермент-ингибиторного комплекса 17
1.2.3.2 Вторая стадия - фосфорилирование фермента 17
1.2.3.3. Дефосфорилирование фермента 18
1.3. Структура холинэстераз 18
1.3.1. Эстеразный пункт 18
1.3.2. Анионный сайт 19
1.3.3. Оксианионная полость 19
1.3.4. Ацильная петля 20
1.3.5. Периферический анионный сайт. Омега-петля 20
1.4. Молекулярное моделирование биологических молекул 20
1.4.1. Молекулярный докинг 21
1.4.2. Молекулярная динамика 22
ГЛАВА 2. Методы исследования 24
2.1. Силовые поля и минимизация энергии 24
2.2. Расчет аффинностей 28
2.3. Реализация методов и программное обеспечение 28
ГЛАВА 3. Результаты 31
3.1. Особенности сорбции АХ и его аналогов в активные центры ХЭ по данным молекулярного моделирования 31
3.2. Теоретический конформационный анализ аналогов АХ с различной структурой ацильной части ихолинового фрагмента 39
3.3. Роль электростатических взаимодействий в процессе сорбции лигандов в активные центры холинэстераз по данным молекулярного моделирования..46
3.4. Изучение механизма действия необратимого катионсодержащего ингибитора холинэстераз 50
ГЛАВА 4. Обсуждение 61
Выводы 66
Список литературы 67
- Первая стадия - образование продуктивного фермент- субстратного комплекса
- Силовые поля и минимизация энергии
- Особенности сорбции АХ и его аналогов в активные центры ХЭ по данным молекулярного моделирования
- Изучение механизма действия необратимого катионсодержащего ингибитора холинэстераз
Введение к работе
Актуальность темы.
Сериновые гидролазы холинэстеразы (ХЭ) присутствуют во многих организмах, от
беспозвоночных до млекопитающих. По субстратно-ингибиторной специфичности ХЭ делятся на ацетилхолинэстеразы (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы (БуХЭ). АХЭ участвует в проведении нервного импульса и является мишенью для многих нейролептических препаратов, фосфорорганических ингибиторов и нервнопаралитических отравляющих веществ, а БуХЭ способна гидролизовать широкий спектр токсичных эфиров (зарин, зоман, кокаин). Поэтому исследование механизма связывания различных типов лигандов в активном центре этих ферментов представляет огромный интерес с теоретической и практической точки зрения: для изучения механизма действия ферментов в целом, для создания новых эффективных лекарственных средств, инсектицидов и пестицидов избирательного действия.
С момента открытия ХЭ было синтезировано и апробировано множество веществ, являющихся субстратами и ингибиторами этих ферментов, измерены значения кинетических констант взаимодействия ХЭ с сотнями эффекторов различной природы. Методом рентгеноструктурного анализа определены трехмерные структуры кристаллов АХЭ и БуХЭ. Однако полученные экспериментальные данных не дают возможности «проследить» поэтапно весь процесс связывания лигандов в активном центре ферментов.
Компьютерное моделирование позволяет получить структуру продуктивного лиганд-ферментного комплекса, рассчитать его динамические и энергетические параметры, выявить факторы, обуславливающие субстратно-ингибиторную специфичность ферментов. Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные о кинетических характеристиках взаимодействия ХЭ с различными типами лигандов и известные трехмерные структуры этих ферментов дают возможность использовать данный подход и для изучения ХЭ. Полученные данные могут быть использованы для изучения механизма действия ферментов в целом.
Цель работы.
Целью данной работы являлось моделирование механизма продуктивного связывания молекул субстратов и ингибиторов в активных центрах ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы методами теоретического конформационного анализа, молекулярного докинга и молекулярной динамики.
Задачи исследования.
Построить и исследовать модели продуктивных комплексов холинэстераз с субстратами, обратимыми и необратимыми ингибиторами.
Оценить роль электростатических взаимодействий в процессе связывания молекул лигандов в активном центре холинэстераз.
Определить конформацию нейромедиатора ацетилхолина, продуктивную для гидролиза под действием бутирилхолинэстеразы.
Создать критерий отбора конформаций структурных аналогов ацетилхолина, продуктивных для гидролиза под действием бутирилхолинэстеразы.
Оценить конформационные и структурные изменения активного центра холинэстераз в процессе сорбции лигандов.
В рамках построенных моделей провести анализ структурно-функциональных отношений лигандов холинэстераз.
Положения, выносимые на защиту.
Для образования продуктивного комплекса холинэстераз с субстратом и необратимым ингибитором необходима активация аминокислот каталитической триады фермента, а именно перенос протона с серина на гистидин, что сопровождается конформационными изменениями активного центра.
Энергетически устойчивая полусвернутая транс-антигош-конформации АХ является продуктивной для гидролиза под действием БуХЭ. БуХЭ гидролизует только те аналоги АХ, у которых имеются энергетически устойчивые конформеры, совместимые с продуктивной конформацией АХ по взаимному расположению функциональных атомов: карбонильного углерода, карбоксильного кислорода и азота. Отклонение значений расстояний между этими атомами не превышает 0.02 нм.
Роль электростатических взаимодействий на стадии сорбции положительно заряженных молекул лиганда выражается в заякоривании его катионной группировки в районе бензольного кольца триптофана анионного участка активного центра холинэстераз за счет образования пи-катионньгх взаимодействий. Эффективность ингибирующей способности обратимого положительно заряженного ингибитора зависит прочности этой связи.
Научная новизна результатов.
Впервые для построения модели комплексов АХЭ и БуХЭ с лигандами была использована активированная форма аминокислот каталитической триады ХЭ, что позволило прийти к новым, неочевидным результатам:
Образование продуктивного комплекса ХЭ с молекулой субстрата или необратимого ингибитора возможно только при условии, что каталитический серии депротонирован, а каталитический гистидин -дважды протон ирован.
Различие в периоде стабильности продуктивных комплексов АХ с АХЭ и БуХЭ коррелирует с различием в скоростях гидролиза АХ под действием АХЭ и БуХЭ.
Впервые методами молекулярного моделирования проведен сравнительный анализ чувствительности АХЭ и БуХЭ к заряду лиганда, что позволило выявить роль электростатических взаимодействий на стадии сорбции лигандов в активный центр ХЭ и определить их влияние на эффективность обратимого ингибирования.
Впервые показано, что продуктивной для гидролиза под действием БуХЭ является полусвернутая транс-антигош-конформация АХ. Показано, что в ряду аналогов АХ продуктивны для бутирилхолинэстеразного гидролиза только те конформации, конформация холинового фрагмента которых по взаимному расположению функционально значимых атомов совпадает с продуктивной конформацией АХ.
Теоретическое и практическое значение работы.
Разработанная в данной работе методика моделирования продуктивных фермент-лигандных комплексов с использованием неактивированных и активированных форм аминокислот активного центра имеют теоретическое значения для развития методов исследования механизма действия ферментов. На практике данный подход может быть применен для прескринига лекарственных препаратов против болезни Альцгеймера, являющихся обратимыми ингибиторами холинэстераз.
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на конференции «XXXII неделя науки в СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2003), итоговом семинаре по физике и астрономии по результатам конкурса грантов 2002 года для молодых ученых Санкт-Петербурга (Санкт-Петербург, 2003), 8-й международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века»
(Пущино, 2004), конференции «XXXIII неделя науки в СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2004), 9-й международной Пущинской школе-конференции «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2005), международной конференции «3. German Conference on Chemoinformatics» (Гослар, 2007), 12-й международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), международной конференции «33 d FEBS Congress» (Афины, 2008).
Публикации.
По результатам диссертации опубликовано 11 печатных работ, 2 из них в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа (80 страниц) состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (101 ссылка), содержит 12 иллюстраций и 12 таблиц.
Первая стадия - образование продуктивного фермент- субстратного комплекса
Из многих организмов были выделены ХЭ, гидролизующие с наибольшей скоростью не АХ или БуХ, а другие субстраты. По принятой классификации их следовало бы отнести к классу БуХЭ. Но поскольку эти ХЭ были выделены из нервных тканей и предположительно принимают участие в проведении нервного импульса, их относят к классу 3.1.1.7. Традиционно нетипичные АХЭ по их субстратной специфичности подразделяют на несколько больших групп [5, 33, 62]. а) Представители данной группы близки по своей специфичности к «типичным» АХЭ, при низких концентрациях субстратов они также с наибольшей скоростью гидролизуют АХ. Однако при оптимальных концентрациях гидролиз АХ и метилхолина (МеХ) проходит с одинаковыми скоростями, а при высоких - МеХ гидролизуется быстрее АХ, поскольку при таких концентрациях проявляется субстратное торможение для АХ, но еще не для МеХ. К этой группе относятся АХЭ мозга голубя [4], бабочек [18, 62] и клопов [62, 95]. б) Целый ряд ХЭ гидролизует с максимальной скоростью МеХ. К этой группе относятся АХЭ перепончатокрылых (таких как некоторые медоносные пчелы [45, 55], муравьи [62], наездники [18]), жесткокрылых (нарывники [62] и долгоносики [46], прямокрылых (например, саранчи [6, 20] и сверчки [62]), а также некоторых представителей тараканообразных [7, 35]. в) ХЭ, выделенные из голов некоторых представителей комнатных мух и круглошовых двукрылых, с наибольшей скоростью гидролизуют БуХ [38, 76, 77]. Хотя у этих ХЭ, так же как и у «типичных» АХЭ млекопитающих при взаимодействии с АХ имеет место эффект субстратного ингибирования при высоких концентрациях субстрата, но при взаимодействии с БуХ при концентрации субстрата 0.1 М скорость гидролиза БуХ в 1.5 выше, чем АХ при оптимальных условиях. По чувствительности к различным типам ингибиторов АХЭ мух также ближе к БуХЭ, чем к «типичным» АХЭ. К этой группе ХЭ также можно отнести и АХЭ головоногих кальмаров. г) В отдельную категорию можно вынести АХЭ тли, которая непохожа ни на один из ХЭ других типов. От типичных АХЭ этот фермент отличается тем, что при взаимодействии с АХ и АТХ не наблюдается эффекта субстратного ингибирования [9,17]. К другим отличиям АХЭ тли от остальных ХЭ можно отнести ее необратимое ингибирование SH-реагентами [60, 69], а также несколько иная зависимость ингибирующей эффективности фосфорорганических ингибиторов (ФОИ) от структуры фермента [34, 69]. Среди нетипичных ХЭ позвоночных наиболее необычными свойствами обладает БуХЭ сыворотки крови голубя. Эта БуХЭ единственная гидролизует МеХ и бензоилхолин (БзХ) с одинаковой скоростью, которая лишь в 2 раза меньше скорости гидролиза АХ.
Нетипичная БуХЭ также была выделена из некоторых видов насекомых, в частности, у злаковой тли [64, 66] и гусениц хлопковой совки [10, 21]. К особенностям этого фермента можно отнести отсутствие субстратного ингибирования при взаимодействии с тиохолинами, большие константы Михаэлиса по сравнению с «типичными» БуХЭ, а также низкую чувствительность к положительно заряженным необратимым ингибиторам.
Большую группу нетипичных БуХЭ составляют так называемые пропионилхолинэстеразы (ПрХЭ), ХЭ, с наибольшей скоростью гидролизующие пропионилхолин (ПрХ). ПрХЭ были выделены из плазмы и сыворотки крови черепах, некоторых птиц (утка, курица ) и млекопитающих (крыса, мышь, хомяк, корова) [27, 57, 64, 70]. Наиболее «типичной» является ПрХЭ, выделенная из плазмы крови черепах. Эта ПрХЭ гидролизует ПрХ в 7 раз быстрее, чем АХ. Многие ПрХЭ также способные гидролизовать БуХ, причем некоторые ПрХЭ гидролизуют БуХ эффективнее по сравнению с гидролизом АХ, а у некоторых наоборот - скорость гидролиза АХ превышает скорость гидролиза БуХ. ПрХЭ характеризуются также тем, что способны гидролизовать МеХ - специфический субстрат АХЭ. Причем, также как и в случае с БуХ, ПрХЭ делятся на те, которые гидролизуют МеХ быстрее АХ, и на те, которые эффективнее гидролизуют АХ. Таким образом, ХЭ очень вариабельны по своей субстратно-ингибиторной специфичности. Выявленные различия позволяют провести анализ эволюции ХЭ. Был проведен статистический анализ свойств ХЭ различного происхождения [12, 13], авторы пришли к выводу о том, что эволюция активного центра ХЭ шла путем нейтральных мутаций, не имеет закономерного характера и не коррелирует с эволюцией белка в целом.
Помимо этого, данные анализа субстратно-ингибиторной специфичности различных ХЭ также могут служить для более подробной морфологической классификации организмов. В частности, сравнительный анализ взаимодействия АХЭ кальмаров из различных участков Берингова моря с ингибиторами различной природы помог выявить внутривидовые различия у этих беспозвоночных [14, 16]. Также исследование взаимодействия ХЭ из различных источников с ФОИ помог классифицировать ХЭ лягушки [14].
Несмотря на то, что ХЭ различных организмов различаются по своей субстратно-ингибиторной специфичности, эксперименты по замене аминокислот и квантово-химические расчет показали, что механизм действия этого класса ферментов одинаков для всех ХЭ. В данной главе мы рассмотрим-все этапы взаимодействия ХЭ с субстратами, необратимыми и обратимыми ингибиторами.
Взаимодействие ХЭ с субстратами,проходит в несколько этапов. Первая стадия — образование комплекса Михаэлиса-Ментен, следующая стадия - реакция ацилирования каталитического серина с образованием свободного холинового фрагмента, и наконец -деацилирование фермента и высвобождение ацетата. Реакция холинэстеразного гидролиза проходит по следующей общепринятой схеме: где Е HS - свободные фермент и субстрат соответственно, ES - продуктивный комплекс Михаэлиса-Ментен, ES - ацилированный фермент, Р1 - продукт реакции ацилирования, Р2 — продукт реакции деацилирования. Активность каталитического центра фермента характеризуется константой kcat = к2 к3/(к2+кз), сродство же активного центра к молекуле Первая стадия — образование продуктивного фермент-субстратного комплекса.
Полагают, что стадия сорбции лигандов в активный центр ХЭ является лимитирующей и эффективность образования продуктивного лиганд-ферментного комплекса определяет скорость всей реакции холинэстеразного гидролиза [68, 85]. Поэтому субстратно-ингибиторная специфичность АХЭ и БуХЭ определяется именно на первой стадии взаимодействия.
Силовые поля и минимизация энергии
Метод молекулярного докинга представляет собой так называемую «стыковку» молекулы лиганда в центре связывания белка (или иначе мишени) с целью поиска локального минимума энергии взаимодействия между лигандом и белком. Метод позволяет определить функциональные особенности поверхности мишени и особенности взаимодействия молекул в комплексе, найти лиганды к конкретной мишени среди большого числа молекул, создать новые лиганды к конкретной мишени. Именно поэтому молекулярный докинг получил огромное распространение в фармакологических исследованиях для поиска новых лекарственных препаратов.
В качестве трехмерной структуры лиганда используются в основном данные рентгеноструктурного анализа, ЯМР, и иногда структуры, полученные методом гомологичного моделирования. Модель лиганда чаще всего строится в химических редакторах, встроенных в программные пакеты, осуществляющие процедуру докинга. Локальный минимум комплекса белок-лиганд ищется путем перебора возможных конформаций и положения молекулы эффектора в центре связывания. На заре развития молекулярного моделирования варьировалось лишь положение молекулы лиганда внутри молекулы белка, поэтому исследователям приходилось «вручную» задавать все возможные конформации лиганда [91, 94], в настоящее же время возможно варьирование конформации лиганда, а также боковых радикалов аминокислот центра связывания. Большинство работ направлено либо на поиск новых лигандов, способных наилучшим образом связываться с данным белком [42, 49, 92], либо на поиск продуктивной конформации комплекса Михаэлиса-Ментен известных субстратов с ферментом [65, 96].
Метод молекулярной динамики позволяет проследить конформационные изменения макромолекул во времени. Впервые метод был применен для изучения белковой структуры в 1977 году [61]. Объектом исследования был небольшой белок БПТИ, состоящий из 58 аминокислот, в качестве стартовой конформации использовалась трехмерная структура белка, полученная двумя годами ранее методом рентгеноструктурного анализа. Длина симуляции составила примерно 9.2 пс (1 пс = 10 12 с). В работе не учитывалось влияние растворителя, температура не поддерживалась постоянной, но, тем не менее, данное исследование являлось прорывом в области компьютерного моделирования макромолекул и положило начало развитию теоретических представлений о структуре и механизме работы белковых структур.
В последующие годы методом молекулярного моделирования удалось рассчитать многие динамические свойства различных макромолекулярных структур. Большинство исследований фокусировалось на физических свойствах внутренних конформационных изменений белков, а также на интерпретации экспериментальных данных. Был проведен анализ флуоресцентной деполяризации остатков триптофана [54], изучены динамические свойства полученных экспериментально параметров ядерно-магнитного резонанса [39], исследовано влияние растворителя и температуры на структуру и динамические свойства белков [83]. Полученные данные сейчас широко используются в расчетах для увеличения точности результатов.
Метод молекулярной динамики зачастую с меньшими затратами по сравнению с экспериментальными процедурами позволяет выявить некоторые конкретные детали механизма действия макромолекулярных структур, например, какими путями лиганд проникает в активный центр фермента и затем покидает его, а также определить роль различных доменов и аминокислотных остатков в различных этапах работы белков и нуклеиновых кислот.
В настоящее время с увеличением компьютерной мощности возможности метода молекулярной динами существенно возросли. Если, как было сказано выше, первый расчет был применен к белку размером 58 аминокислот (то есть примерно 500 атомов), и время симуляции составило около 9 пс, то на данный момент рассчитываются системы, состоящие из 104 - 106 атомов, а период расчета составляет в среднем 10 не (1 не = 10 9 с). Количество публикаций, в которых используется данный метод, составляет несколько тысяч в год, и их число неуклонно растет. Среди них наибольший вклад составляют работы таких пионеров молекулярной динамики как Берендсена [29], а также таких авторов как Элбера, разработавшего множество приемов для возможности увеличения периода симуляции [97], Иоргенсона, внесшего большой вклад в развитие процедур расчет свободных энергий взаимодействия макромолекул [56], ван Гастерена, принимавшего участие в стандартизации метода [90], Маккэммона, использующему широкий спектр процедур молекулярной динамики для изучения свойств многих белков, в том числе холинэстераз [48]. Из недавних работ, посвященных расчету биомолекул методом молекулярной динамики можно отметить исследование, посвященное ответу на вопрос, как высокие температуры влияют на структуру L1-липазы. Был проведен расчет динамических свойств данного фермента при высоких температурах, который выявил, какие именно домены отвечают за конформационные изменения молекулы при нагреве [25]. Из методологических работ представляет интерес исследование свойств фермента катехол-О-метилтрансферазы. Симуляция длиной 70 не показала, что поведение белка остается стабильным уже после двух десятков наносекунд. Авторы сделали вывод, что такое время в приближении классической механики является достаточным для полного расчета динамических свойств белковой молекулы, поэтому не представляется имеющей смысл «гонка» за увеличением длины симуляции [36].
Итак, многолетний опыт применения методов молекулярного моделирования показывает, что теоретические расчеты способны дать важные, интересные и достоверные результаты.
Таким образом, на данный момент различными методами получено множество данных об эволюции, структуре и механизме действия ХЭ. Для исследования этих ферментов были разработаны методы выделения и очистки, синтезированы и апробированы сотни веществ, являющихся их субстратами и ингибиторами, найдены значения кинетических констант взаимодействия эффекторов с ферментами. Таким образом, обе эстеразы могут быть использованы в качестве моделей для изучения принципов механизма действия ферментов. Однако остается множество открытых вопросов о работе этих ферментов, ответу на некоторые из них и посвящено данное исследование.
Особенности сорбции АХ и его аналогов в активные центры ХЭ по данным молекулярного моделирования
Экспериментальные методы, такие как метод рентгеноструктурного анализа, широко применяются для изучения трехмерной структуры биомолекул. В частности, в базе данных PDB имеется более 200 комплексов АХЭ со многими лигандами и продуктами холинэстеразного гидролиза. Для БуХЭ на данный момент определены структуры комплексов фермента с ингибиторами 3-бромпропионатом, зоманом и другие.
Однако вопрос о продуктивной сорбции молекулы субстратов в активном центре ХЭ остается открытым, поскольку нет возможности получить кристалл фермента с сорбированной в активном центре молекулой субстрата. Такую возможность предоставляет метод анализа структурно-функциональных отношений. Метод основан на сопоставлении структуры молекул лигандов с их эффективностью по отношению к ферменту, что позволяет делать выводы о роли функциональных групп субстрата, а значит и выводы о расположении и функциональной роли специфических участков в активном центре фермента. Поскольку в таком подходе используются значения кинетических характеристик ферментов, все результаты расчетов относятся к «реальному» белку.
Ранее уже был проведен теоретический конформационный анализ субстратов АХЭ, который выявил, что из семи устойчивых конформаций АХ только полностью вытянутая tt-конформация является продуктивной для гидролиза под действием АХЭ. Было показано, что в ряду аналогов АХ с общей формулой R-C(0)0-A-N+(CH3)3 гидролизуются под действием АХЭ только те из них, которые имеют устойчивые конформеры, совместимые с продуктивной конформацией АХ по взаимному расположению функционально значимых атомов (азота, карбонильного углерода и карбонильного кислорода) [101]. Отклонения значений расстояний между функциональными атомами не превышают 0.2А. Это означает, что положение ацильной и триметиламмониевой группировок АХ при продуктивной сорбции в активном центре АХЭ строго детерминировано, следовательно, можно проводить отбор продуктивных конформаций субстрата по значению расстояний между его функционально значимыми атомами.
Помимо этого была определена ориентация АХ при продуктивной сорбции в активном центре АХЭ, было показано, что со стороны R-энантиотопных атомов водорода продуктивно сорбированного конформера АХ имеется область существенного объема фермента, а со стороны S-энантиотопных атомов — область исключенного объема [22]. Все выявленные особенности строения активного центра АХЭ позже были подтверждены результатами рентгеноструктурного анализа кристалла АХЭ Torpedo californica [85] и процедурами manual docking. Это доказывает применимость метода теоретического конформационного анализа для исследования механизма действия ферментов.
В данном исследовании для определения продуктивной конформаций АХ для гидролиза под действием БуХЭ и выявления особенностей механизма действия АХЭ и БуХЭ был проведен теоретический конформационный анализ 34 аналогов АХ с общей формулой R-C(0)0-A-N+(CH3)3- Список соединений и литературные данные об относительных скоростях их гидролиза приведены в таблице 3.2.1.
На первом этапе был проведен корреляционный анализ по поиску зависимости между объемами молекул и скоростью их гидролиза под действием ХЭ. В случае АХЭ была найдена достоверная корреляция, рассчитанный коэффициент составил -0.62. Данный результат подтверждает выявленную ранее обратную зависимость между объемами молекул и скоростью их гидролиза под действием АХЭ [23]. В случае БуХЭ найденный коэффициент корреляции не является достоверным, что говорит об отсутствии какой-либо зависимости между объемом молекулы и скоростью ее гидролиза под действием БуХЭ. Ранее методами гомологичного моделирования, а позже и рентгеноструктурным анализом было показано, что стерические размеры ущелья и активного центра БуХЭ существенно больше, чем у АХЭ. В частности, было показано, что аминокислотным остаткам Phe288 и Phe290 активного центра АХЭ соответствуют менее массивные Leu286 и Val288 активного центра БуХЭ [37]. Выявленное нами отсутствие зависимости для БуХЭ хорошо согласуются с этими результатами, что подтверждает достоверность применяемого в нашей работе подхода.
На следующем шаге был проведен полный конформационный анализ соединений (I)-(XXXII): были найдены все устойчивые конформаций молекул, рассчитаны их геометрические и энергетические характеристики. Расчет показал, что в ряду аналогов ацетилхолина с различной структурой ацильной части (соединения (І)-(ХХП)) для всех данных молекул из 9 возможных существует ровно семь устойчивых конформаций холинового фрагмента: gg, gt, tg, tt, tg , g t, g g". Конформации gg- и g-g, как и в случае АХ, оказались неустойчивыми и в процессе минимизации переходили в tg- и tg соответственно.
Далее для каждой конформации холинового фрагмента была рассчитана суммарная заселенность и затем были рассчитаны коэффициенты корреляции между значениями найденных заселенностей и скоростями холинэстеразного гидролиза данных соединений (таблица 3.2.2). В случае АХЭ достоверная корреляция была выявлена только для полностью вытянутой tt-конформации. Это означает, что данная конформация холинового фрагмента аналогов АХ является продуктивной для гидролиза под действием АХЭ, или другими словами, в продуктивном фермент-субстратном комплексе холиновый фрагмент молекулы субстрата-аналога АХ находится в tt-конформации. Этот согласуется с полученными ранее данными теоретического конформационного анализа и молекулярного докинга о том, что полностью вытянутая АХ является продуктивной для ацетилхолинэстеразного гидролиза [23, 101].
Тот факт, что только одна конформация холинового фрагмента является продуктивной, говорит о том, что в продуктивном комплексе ацильная часть и триметиламмониевая группа жестко закреплены в активном центре АХЭ. Продуктивными являются только те конформации, у которых расстояние между функционально значимыми атомами соответствует полностью вытянутой конформации холинового фрагмента АХ. В случае БуХЭ аналогичная корреляция была выявлена только для полусвернутой "-конформации холинового фрагмента, что позволяет выделить ее как продуктивную для гидролиза под действием БуХЭ. Поскольку корреляция была найдена только для одной конформации, можно утверждать, что образование продуктивного комплекса субстрата с БуХЭ происходит по аналогичному с АХЭ механизму.
Для того, чтобы подтвердить продуктивность / "-конформации АХ для гидролиза под действием БуХЭ, был проведен полный конформационный анализ соединений (XXIII)-(XXXIV) — аналогов АХ с различной структурой холинового фрагмента. Для этих молекул были рассчитаны параметры всех возможных устойчивых конформации, затем были отобраны те конформации, которые по расстоянию между карбонильным углеродом и азотом (CICN) и карбонильным кислородом и азотом ((ION) соответствуют / -конформации АХ (величина отклонения значений расстояний между функциональными атомами не превышала 0.2 А). Список конформации приведен в таблице 3.2.3.
Затем был рассчитан коэффициент корреляции между суммарной заселенностью фрагмента -А- отобранных конформации и скоростью гидролиза данного ряда субстратов под действием БуХЭ. Анализ показал, что рассчитанная корреляция является достоверной. Полученный результат согласуется с результатом молекулярного докинга молекулы АХ в активные центры АХЭ и БуХЭ. Таким образом, можно утверждать, что для гидролиза под действием БуХЭ продуктивны только те конформации субстратов, у которых расстояние между функционально значимыми атомами соответствует полусвернутой / -конформации АХ.
Изучение механизма действия необратимого катионсодержащего ингибитора холинэстераз
В данной работе были получены структуры продуктивных комплексов АХЭ и БуХЭ с природным субстратом АХ и необратимым ингибитором МФФХ, схожим по химическому строению с АХ. Полученные параметры расположения молекул этих лигандов в активном центре ХЭ согласуются с данными РСА и квантово-химических расчетов.
Анализ продуктивных комплексов ХЭ с субстратами выявил, что ориентация молекулы субстрата в активном центре АХЭ и БуХЭ совпадает. Еще одним сходством между этими ферментами является тот факт, что молекула АХ жестко закреплена в активном центре ферментов, катионная группа - возле триптофана анионного сайта ХЭ, а ацильная часть — возле остатка каталитического серина. Отклонение расстояний между функционально значимыми атомами не превышает 0.2 А. Оба эти результата подтверждают, что АХЭ и БуХЭ имеют одинаковый механизм действия.
Расчеты методом теоретического конформационного анализа и молекулярного докинга показали, что полностью вытянутая tt-конформация АХ является продуктивной для гидролиза под действием АХЭ, а полусвернутая tg"-KomJ)opMau - для гидролиза под действием БуХЭ. Тот факт, что разные конформации АХ продуктивны для ацетилхолинэстеразного и бутирилхолинэстеразного гидролиза, и объясняет различия в субстратной специфичности АХЭ и БуХЭ. Tt- и /g -конформации АХ различаются расстоянием между функционально значимыми атомами: в //-конформации dcN=4.9 А и d0N=5.1 А, а в /g -конформации - 4.5 А и 5.0 А соответственно. Таким образом, расстояние между функционально значимыми атомами является критерием отбора продуктивных конформеров для гидролиза под действием этих ферментов.
В продуктивных комплексах ХЭ с необратимым ингибитором МФФХ фосфорильная часть и триметиламмониевая группа молекулы лиганда также жестко закреплены в активном центре ферментов. Разброс расстояний между атомом фосфора МФФХ и гидроксилом серина и между азотом и центром кольца триптофана в полученных потенциально продуктивных комплексах не превышает 0.2 А.
Однако, поскольку ориентация фосфорильной группы МФФХ в активном центре несколько отличается от ориентации ацильной части АХ и его аналогов, расстояния между функционально значимыми атомами сорбированного ингибитора не совпадают с соответствующими расстояниями у субстрата. Но из таблиц 4.3 и 4.4 видно, что, как и в случае субстратов, в среднем значение dist(N-P) в комплексах МФФХ с АХЭ больше, чем в комплексах с БуХЭ. В данной работе поиск возможных корреляций проводился при сопоставлении геометрических параметров энергетически устойчивых конформеров изолированных молекул субстратов с их кинетическими характеристиками взаимодействия с ферментами. В принципе, такой подход моделирует только стадию сорбции, т.е. комплементарное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента. Наличие связи между параметрами изолированных молекул субстратов и обобщенных кинетических характеристик указывает на то, что стадия сорбции субстратов в активном центре холинэстераз является лимитирующей. Обычно предполагается, что при ферментативном гидролизе происходит изменение конформации субстрата. Однако известно, что SS-энантиомер жесткого циклопропильного аналога АХ (XXVIII) и S-энантиомер хинуклидинового аналога АХ (XXXIV) гидролизуются как АХЭ, так и БуХЭ с высокими скоростями (табл.1), хотя даже незначительное изменение значений торсионных углов холинового фрагмента потребовало бы разрыва ковалентных связей в молекуле лиганда и, значит, больших затрат энергии, и следовательно, уменьшение скорости гидролиза этих соединений. Однако, процессе работы фермента конформация как самого фермента, так и продуктов реакции, может изменяться. Анализ полученных в данном исследовании методом молекулярного докинга комплексов АХЭ и БуХЭ с АХ показал, что расстояние между гидроксильным атомом каталитического серина и триптофана анионного сайта в АХЭ на 0.5 А больше, чем в БуХЭ. Однако, анализ молекул кристаллов свободных АХЭ и БуХЭ, полученных ранее методом РСА (код 2АСЕ и 2РМ8 в базе данных белковых структур), выявил, что указанное расстояние примерно одинаково для обоих ферментов. Это подтвреждает выдвнутую гипотезу, что молекула фермента в процессе сорбции лиганда претерпевает существенные конформационные изменения. Известно, что в целом БуХЭ менее эффективный фермент, чем АХЭ. Можно предположить, что это с связано с тем, что для образования продуктивного фермент-субтератного комплекса молекула БуХЭ должна измениться сильнее по сравнению с конформацией АХЭ, а для этого требуются большие энергетические затраты.
Дальнейшие конформационные изменения продуктивных комплексов АХЭ и БуХЭ с АХ, полученных с помощью молекулярного докинга, были рассчитаны методом молекулярной динамики, длина симуляции составила 5 не. Расчет показал, что комплекс АХ-АХЭ во много раз стабильнее комплекса АХ-БуХЭ. Такое различие согласуется с кинетическими данными о том, что константа Михаэлиса для пары АХ-АХЭ в несколько раз ниже, чем для пары АХ-БуХЭ, или, другими словами, сродство АХ к активному центру АХЭ в несколько раз лучше, чем к активному центру БуХЭ. Сама же скорость гидролиза АХ под действием АХЭ в несколько раз выше, чем скорость гидролиза под действием БуХЭ, а значит, скорость холинэстеразного гидролиза определяется стабильностью продуктивного комплекса. Этот вывод в очередной раз указывает на то, что стадия сорбции молекулы лиганда в активный центр ХЭ является лимитирующей для всего процесса ферментативной реакции.
Молекулярный докинг молекулы АХ в активные центры АХЭ и БуХЭ с неактивированными и активированными аминокислотами каталитической триады показал, что в обоих случаях триметиламмониевая группа субстрата сорбируется возле в анионном сайте фермента возле остатка триптофана, образую пи-катионную связь с его бензольным кольцом. Таким образом, можно утверждать, что сначала происходит заякоривание азота лиганда возле Тгр84(82), и лишь затем ацильная часть АХ «подстраивается» возле каталитической триады.
Результаты молекулярного докинга демонстрируют, что образование продуктивного комплекса ХЭ с молекулой субстрата или необратимого ингибитора (то есть лиганда, непосредственно связывающегося с молекулой фермента через ковалентную связь) невозможно без активации аминокислот каталитической триады, а именно переноса протона с гидроксила серина на имидазольное кольцо гистидина. Ранее предполагалось, что перенос протона происходит одновременно с реакцией ацилирования фермента, уже после образования комплекса Михаэлиса-Ментен. К сожалению, в литературе ни для одного из родственных ХЭ фермента не было найдено данных, согласующихся с выдвинутой нами гипотезой.
