Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Введение
1.2. Классификация биосенсоров
1.3. Методы наноструктурирования электродов
1.4. Наноматериалы, используемые для наноструктурирования электродов
1.4.1. Глины
1.4.2. Фосфолипиды
1.4.3. Многослойные пленки
1.4.4. Наночастицы металлов
1.4.5. Углеродные нанотрубки
1.4.6. Фуллерены
1.4.7. Неорганические наночастицы
1.4.8. Фиброин шелка
1.5. Наноматериалы в качестве меток в электрохимических иммуносенсорах и иммунополях
1.5.1. Золотые и серебряные наночастицы
1.5.2. Полупроводниковые наночастицы
1.5.3. Апоферритиновые нано-носители
1.6. Заключение
2. Материалы и методы
2.1. Экспериментальная часть
2.1.1. Реагенты
2.1.2. Синтез наночастиц золота
2.1.3. Приготовление ферментных электродов
2.1.4. Электрохимические эксперименты
2.1.5. Спектрофотометрические эксперименты 68
2.1.6. Сканирующая электронная микроскопия 69
3. Результаты и их обсуждение 69
3.1. Исследование стехиометрии электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4 69
3.1.1. Электрохимические характеристики ферментных электродов 69
3.1.2. Методы количественной оценки генерации Н2Ог в электрохимических реакциях 79
3.1.3. Определение количества кислорода, участвующего в электрокатализе 87
3.2. Определение термодинамических параметров электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4 92
4. Выводы 105
5. Литература 107
- Методы наноструктурирования электродов
- Наноматериалы в качестве меток в электрохимических иммуносенсорах и иммунополях
- Экспериментальная часть
- Электрохимические характеристики ферментных электродов
Введение к работе
1. Обзор литературы
Введение
Классификация биосенсоров
Методы наноструктурирования электродов
Наноматериалы, используемые для
наноструктурирования электродов
Глины
Фосфолипиды
Многослойные пленки
Наночастицы металлов
Углеродные нанотрубки
Фуллерены
Неорганические наночастицы
Фиброин шелка
1.5. Наноматериалы в качестве меток
в электрохимических иммуносенсорах и иммунополях
Золотые и серебряные наночастицы
Полупроводниковые наночастицы
Апоферритиновые нано-носители
1.6. Заключение
2. Материалы и методы
2.1. Экспериментальная часть
Реагенты
Синтез наночастиц золота
Приготовление ферментных электродов
Электрохимические эксперименты
Спектрофотометрические эксперименты 68
Сканирующая электронная микроскопия 69
3. Результаты и их обсуждение 69
3.1. Исследование стехиометрии электрохимического
восстановления цитохрома Р450 2В4 69
3.1.1. Электрохимические характеристики
ферментных электродов 69
3.1.2. Методы количественной оценки генерации
Н2Ог в электрохимических реакциях 79
3.1.3. Определение количества кислорода,
участвующего в электрокатализе 87
3.2. Определение термодинамических параметров
электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4 92
Выводы 105
Литература 107
2^
Список сокращений
CNT - углеродные нанотрубки
PDDA - полидиаллилдиметиламмоний хлорид
GOx - глюкозоксидаза
HRP - пероксидаза хрена
ChO - холиноксидаза
PSS - поли (натрий-4-стиренсульфонат)
MWCNT - многостеночные углеродные нанотрубки
SWCNT - одностеночные углеродные нанотрубки
BCNT - многостеночные углеродные нанотрубки «бамбукового» типа
AFP - а-фетопротеин
PPF - плазма-полимеризованная пленка нафиона
SMC - монтмориллонит натрия
PG - пиролитический графит
GC - стеклоуглерод
SCE - насыщенный каломельный электрод
ДДАБ - дидодецилдиметиламмоний бромид
ДМСО - диметилсульфоксид
РВ - берлинская лазурь
СВЭ - стандартный водородный электрод
Введение
Цитохромы Р450 - гемопротеины, характерные почти для всех живых существ. В организме человека они содержатся в различных органах и тканях [1]. Цитохромы Р450 обладают свойством гидроксилировать неактивные атомы углерода органических молекул, повышая полярность гидрофобных ксенобиотиков, и способствуют их выведению из организма [2,3]. Цитохромы Р450 катализируют около 60 типов химических реакций и метаболизируют примерно 1 миллион различных соединений, участвуют в синтезе стероидных гормонов [1,2,4]. В последнее время пристальное внимание уделяется персональной медицине и роли цитохромов Р450 в метаболизме отдельного организма [5]. Все это делает цитохромы Р450 перспективными объектами в создании биосенсоров для анализа потенциальных лекарственных препаратов [6] и оценке индивидуальной переносимости пациентами химиотерапии, правильном выборе методов. лечения.
В каталитическом цикле цитохрома Р450 один из атомов кислорода расходуется на окисление органической молекулы, а второй восстанавливается до воды за счет редокс-эквивалентов NADPH или NADH: NAD(P)H + КҐ + 02 + ХН -> NAD(P)+ + ХОН + Н20, (1)
где ХН - субстрат
Однако в ряде случаев реакция не соответствует стехиометрическим соотношениям, приведенным в данном уравнении. Определенная доля электронов расходуется на восстановление кислорода, не сопровождающееся конверсией субстрата. Это явление получило название разобщения (рис. 1).
Известно, что ферменты микросом печени не окисляют ни один из известных субстратов с полным сопряжением. Часть редокс-эквивалентов NADPH расходуется в побочных оксидазных реакциях. При этом происходит
образование активных форм кислорода: пероксида водорода и супероксид анион-радикала, а также воды [7-9].
Рис. 1. Каталитический цикл цитохромов Р450. Синими стрелками показаны пути разобщения цикла.
Ранее была показана возможность замены доноров электронов NAD(P)H и дополнительных белков редокс-партнеров электрохимическим восстановлением цитохромов Р450 [10-15]. Изучение стехиометрии системы, моделирующей природный каталитический цикл, особенно важно для последующего конструирования сенсорных устройств, направленных на анализ новых лекарственных форм.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы было изучение стехиометрических соотношений компонентов электрокаталитического цикла цитохромаР450 2В4 (субстратов - бензфетамина и кислорода, образующегося пероксида водорода и формальдегида как продукта N-деметилирования субстрата) и определение
термодинамических параметров электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Иммобилизовать цитохром Р450 2В4 на печатный электрод, сохранив
каталитическую активность фермента.
2) Разработать метод детекции продуктов электрохимического
восстановления цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатный
электрод, позволяющий регистрировать образование пероксида и
поглощение кислорода в кинетическом режиме.
На основании полученных количественных данных об образовании пероксида водорода, N-деметилировании субстрата и поглощении кислорода, определить стехиометрические параметры электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатный электрод.
Определить зависимость окислительно-восстановительного потенциала цитохрома Р450 2В4 от температуры в анаэробных условиях, рассчитать термодинамические параметры электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4.
Научная новизна работы.
Впервые был предложен биэлектродный метод детекции пероксида
водорода, образующегося в результате электрохимического восстановления
цитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на печатном электроде. В работе
впервые определены стехиометрические параметры электрокаталитического
цикла цитохрома Р450 2В4 в присутствии и отсутствии субстрата
(бензфетамина), что позволяет сравнить модельную систему
иммобилизованного цитохрома Р450 2В4 с природной монооксигеназной
системой. Определены термодинамические параметры
электрокаталитического цикла цитохрома Р450 2В4, сделаны выводы о вкладе термодинамических параметров в электрохимический потенциал.
Практическая значимость исследования.
В результате проведенного исследования разработаны методы получения биосенсоров с полимерным покрытием, стабилизирующим фермент, которые могут быть использованы в качестве системы, моделирующей природный цикл цитохрома Р450 2В4.
Разработана биэлектродная схема, позволяющая при соответствующем
выборе измерительного электрода анализировать продукты
электрохимических реакций в кинетическом режиме. При использовании в качестве измерительного электрода сенсора с наноразмерным покрытием берлинской лазури или сенсора с иммобилизованным цитохромом с были проведены количественные измерения пероксида водорода. Микроэлектрод Кларка использовали для измерения поглощения кислорода в электрокаталитическом цикле цитохрома Р450 2В4.
Показана адектватность замены редокс-партнеров и дорогостоящих восстановительных агентов NADH и NADPH цитохрома Р450 2В4 электрохимическим восстановлением.
Экспериментально определена зависимость окислительно-
восстановительного потенциала от температуры и рассчитаны термодинамические параметры электрохимического восстановления цитохрома Р450 2В4 при иммобилизации на структутрированный наночастицами золота графитовый электрод.
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы были доложены на международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2008» (Уфа, 2008), V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), Итоговой конференции по результатам
выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008), Первом международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 5 публикаций в сборниках докладов научных конференций.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвященного материалам и методам наноструктурирования поверхности электродов, используемых в биоэлектрохимии, глав «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 307 источников. Работа изложена на 141 страницах текста,, содержит 32 рисунка и 4 таблицы.
Исследование выполнено на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН при финансовой поддержке Федерального Агентства по науке и инновациям Министерства образования и науки РФ (государственный контракт ФЦП № 02.512.11.2105) и Межведомственной Программы «Протеомика в медицине и биотехнологии».
1. Обзор литературы. Нанокомпозитные материалы в биоэлектрохимии.
1.1. Введение.
Электрохимическим биосенсором в традиционном понимании считается система распознавания биохимического процесса посредством его перевода в электрический сигнал. Как правило, основой биосенсоров являются различные электроды, содержащие иммобилизованные молекулы-зонды, способные взаимодействовать с молекулами-мишенями, образуя ковалентно-связанные или супрамолекулярные комплексы (элемент биологического распознавания должен находиться в прямом пространственном контакте с преобразователем).
Сигналы, используемые для регистрации процесса узнавания или химической реакции на поверхности биосенсора, имеют электрическую, природу и чаще всего представляют собой пики окисления-восстановления электроактивных веществ, участвующих в процессе.
Основные электрохимические методы, используемые для
биохимических исследований - вольтамперометрия, циклическая
вольтамперометрия, квадратно-волновая вольтамперометрия,
дифференциальная импульсная вольтамперометрия, хроноамперометрия и др. Для исследования иммобилизованных гемопротеинов используется большинство вышеперечисленных методов.
Наноматериалы оказали весьма значительное влияние на конструкцию биосенсоров. Нанотехнологии позволили привязать к неорганической поверхности электрохимического сенсора биомолекулу, усилить сигнал биохимического распознавания, облегчить перенос электрона в электрохимической системе. Использование наноматериалов при разработке и конструкции электрохимических биосенсоров в последние пять лет бурно развивается.
1.2. Классификация биосенсоров.
Биосенсоры можно классифицировать по типу используемых для модификации или конструкции наноматериалов, или по типу действующих биомолекул. Согласно второму типу классификации можно рассматривать ферментативные биосенсоры, геносенсоры, иммуносенсоры.
Ферментативные биосенсоры.
Ферментативные биосенсоры используются для мониторинга широкого спектра веществ, важных клинически, а также в контроле окружающей среды. Одной из важнейших задач в конструкции амперометрического ферментативного биосенсора является обеспечение удовлетворительной электронной коммуникации электродной поверхности и активного сайта фермента.
Преимущества использования углеродных нанотрубок для конструкции ферментативных биосенсоров обусловлены большой поверхностью нанотрубки, ее электронными свойствами и электрокаталитическим эффектом.
Впервые электрод, модифицированный углеродными нанотрубками в качестве биосенсора, был описан в работе [16]. Авторы наносили углеродные нанотрубки (CNT) и фермент распылением на тефлоновый связывающий агент. Как было показано, CNT обладают электрокаталитической активностью по отношению к пероксиду водорода и NADH, позволяя эффективно при низком потенциале регистрировать глюкозу и этанол при использовании трехмерной CNT/тефлоновой матрицы с встроенной глюкозоксидазой. Авторы также обнаружили повышение эффективности электронного переноса. Также было показано, что усиленный электронный перенос сопровождается минимизацией загрязнения поверхности электрода.
Электрокаталитический эффект углеродных нанотрубок был объяснен группой Комптона [17,18], которая показала, что открытые концы углеродных нанотрубок подобны краям плоскости пиролитического графита.
CNT и глюкозоксидаза легко встраиваются в электроды из углеродной пасты с использованием связывающих агентов для детектирования глюкозы [19]. В последствии были созданы различные электроды из углеродной пасты и углеродных нанотрубок на основе лактат оксидазы, полифенолоксидазы и алкогольдегидрогеназы/NAD"1" [20]. Также созданы электроды с нанокристаллами, включенными в матрицу нанотрубки/паста, что повышает чувствительность сенсора и снижает потенциал, прилагаемый к электроду [21]. Сделан биосенсор аналогового типа с включенной в матрицу CNT/хитозан лакказой [22]. Однако одним из недостатков электродов на основе углеродной пасты являются их плохие механические свойства. Более прочные электроды были получены встраиванием нанотрубок и глюкозоксидазы в эпокси-матрицы [23,24]. CNT сенсоры, полученные методом трафаретной печати и основанные на толстопленочном процессе изготовления механически стабильны, резистентны к истиранию, дешевы и могут производиться в промышленных масштабах [25]. CNT-матрицы также позволяют достаточно легко встраивать ферменты в электроды, получаемые методом трафаретной печати. Для электрода на основе HRP, многостеночных углеродных нанотрубок и полисульфонового связывающего агента посчитана кажущаяся константа Михаэлиса-Ментен K^f =0,71 мМ, что говорит о том, что иммобилизованный биокомпозит сохраняет активность с весьма низким диффузионным барьером. Это значение ниже, чем для золь-гель НгОг-биосенсоров [26], биосенсоров на силоксановом гомополимере [27] и других композитах [28]. Сенсор также имеет весьма высокую чувствительность, порядка 0,12 мкА/мМ.
Интересный метод изготовления сенсора - послойное нанесение фермента на нанотрубку [29,30]. Глюкозоксидаза (GOx) иммобилизуется на отрицательно заряженную поверхность нанотрубки альтернативной сборкой
слоев полидиаллилдиметиламмоний хлорида (PDDA) и GOx. Сендвич-
стуктуры PDDA/GOx/PDDA/CNT формируются самоорганизацией, что
позволяет сохранить активность фермента и предотвратить его утечку.
Высокая электрокаталитическая активность такого электрода по отношению
к пероксиду говорит о том, что много слоиность не влияет на
электрокаталитические свойства CNT. Той же группой разработан
биферментный CNT-биосенсор на основе послойной сборки PDDA,
пероксидазы хрена (HRP) и холиноксидазы (СЮ). Биоактивные
нанокомпозитные пленки PDDA/ChO/PDDA/HRP/PDDA/CNT
(ChO/HRP/CNT) и PDDA/ChO/PDDA/CNT (ChO/CNT) были сформированы на стеклоуглеродной поверхности. Принимая во внимание электрокаталитический эффект углеродных нанотрубок, фарадический ответ ферментативных реакций регистрировали при низком потенциале [31,32]. Также с использованием послойного метода нанесения был разработан биосенсор для детекции холина на основе СЮ/полианилин/MWCNT [33]. С использованием подобного подхода разработан глюкозный биосенсор на основе двух слоев полиэлектролита PDDA и поли (натрий-4-стиренсульфоната) (PSS) на золотом электроде, модифицированном 3-меркапто-1-пропансульфоновой кислотой с последовательным нанесением многостеночных нанотрубок, покрытых положительно заряженным PDDA и отрицательно заряженной глюкозоксидазой HaPSS-слое [34]. Одностеночные углеродные нанотрубки используют как связующее звено между активным центром фермента и электродом.
Авторам работ [35,36] удалось ковалентно привязать фермент к концам вертикально ориентированных углеродных нанотрубок. Квазиобратимая вольтамперометрия Fen/Fem наблюдалась для гемов миоглобина и пероксидазы хрена, привязанных к концам углеродных нанотрубок амидными линкерами. Авторы предполагают, что нанотрубки в ансамблях ведут себя аналогично металлам, проводящим ток от внешней сети к активному центру фермента.
Геносенсоры.
Углеродные нанотрубки и наночастицы играют важную роль в конструировании биосенсоров: большая поверхность, быстрый гетерогенный перенос электрона - параметры, востребованные при конструкции современных биосенсоров.
MWCNT-электроды используют для безметочной детекции ДНК-гибридизации [37,38]. Усиленный сигнал от гуанина возникает скорее за счет CNT-индуцированного накопления, чем за счет электрокаталитической реакции. Возрастание окислительных пиков гуанина и аденина (относительно стеклоуглеродного электрода) также наблюдалось другой группой [39] и было применено для безметочного анализа ДНК тимуса теленка. Принимая во внимание, что многостеночные нанотрубки «бамбукового» типа (BCNT) имеют дополнительные крайние графеновые плоскости, группа Гудинга сумела применить углеродные нанотрубки для безиндикаторной детекции ДНК [40].
BCNT превосходят по своим показателям SWCNT:
Методы наноструктурирования электродов
Повысить чувствительность биосенсора и понизить порог детекции электрохимических сенсоров можно используя электроды достаточно малого размера для перехода от планарной диффузии вещества к полусферической. Современная клиническая диагностика делает необходимым анализ непосредственно в исследуемом органе. Очевидно, что для достижения данной задачи также необходимо минимизировать размеры датчиков. Электроды с характерными размерами в нанометровом диапазоне отличаются по свойствам, как от обычных, так и от микроэлектродов. При уменьшении размеров электрода, соотношение сигнал/шум возрастает. Также следует отметить, что при минимизации размеров электрода ток перестает зависеть от времени. То есть установление равновесия происходит очень быстро. Это должно позволить проводить регистрацию вольтамперометрических откликов на малые концентрации определяемого вещества в проточно-инжекционном режиме. Применение нано- и ультрамикроэлектродов вызвало повышенный интерес в последние два десятилетия. Данный интерес связан с их хорошо известными характеристиками: повышенным массопереносом, коротким временем отклика, а также улучшенным соотношением сигнал/фон по сравнению с электродами обычных размеров. Малые размеры электродов расширяют пределы их электрохимического применения при мониторинге электроактивных веществ in vivo, при измерениях в органических средах с высоким сопротивлением, в высокочистых растворах или при проведении исследований в комплексных матрицах без предварительной обработки [50].
Для получения наноэлектродов и систем наноэлектродов используют наноструктурирование различных материалов. Для наноструктурирования электродных материалов применяется ряд методов: сканирующая туннельная микроскопия, самоорганизация, осаждение, травление, ионно-лучевое распыление и другие. Сканирующая туннельная микроскопия.
Принцип использования сканирующей туннельной микроскопии для получения систем наноэлектродов заключается в применении зонда микроскопа в качестве наноэлектрода для осаждения различных материалов. Возможно осаждение золота, палладия, меди, свинца, мышьяка и пр. на различные поверхности. Металл электрохимически осаждают на зонд и путем кратковременного скачкообразного сближения зонда с поверхностью формируются кластеры [51-56].
Электронная литография или электронно-лучевая литография — литографический метод с использованием электронного пучка. Электронный пучок сканирует поверхность электронного резиста, повторяя шаблон, заложенный в управляющий компьютер. Метод позволяет достигать разрешения в 20 нм, благодаря более короткой длине волны электронов по сравнению со светом [57]. Электронная литография используется для создания масок для фотолитографии, где требуется нанометровое разрешение.
Обычно для реализации метода применяют электронный микроскоп, переделанный в систему электронной литографии, используя относительно дешевые аксессуары ( $100 тыс.). Такие переделанные системы создают ширину линии 20 нм (с 1990 гг), в то время как специализированное оборудование позволяет получать разрешение 10 нм и меньше.
Системы электронно-лучевой литографии можно классифицировать по форме луча и согласно методам управления лучом. Старые системы использовали гауссовские пучки и сканирование производилось растровым методом. Более новые системы используют сформированную форму луча, которая может быть отклонена в различные положения в поле записи (это также называется векторным сканированием) [57]. Процесс нанолитографии включает следующие этапы: 1) На толстую подложку (часто используют кремний) наносят тонкий слой материала, из которого нужно сформировать рисунок. На этот слой наносится фоторезист (специальный материал, который изменяет свои физико-химические свойства при облучении светом). 2) Производится экспонирование через фотошаблон (контактным или проекционным методом). 3) Облученные участки фоторезиста изменяют свою растворимость и их можно удалить химическим способом (процесс травления). Освобожденные от фоторезиста участки тоже удаляются. Нанолитография возможна с использованием атомного силового микроскопа. В работе [58] описан метод dip pen nanolithography (DPN) -способ получения наноструктур с помощью зонда атомного силового микроскопа. Авторам удалось получить образцы 1-октодекантиола на золотой поверхности с минимальной шириной линии 25 нм и средней - 30-40 нм.
В работе [59] описано получение рядов наноконтактов, расположенных на расстоянии нескольких нанометров методом литографии рентгеновскими лучами с помощью синхротрона Elettra. Авторы считают, что с помощью этого метода можно в последствии изготавливать наноприборы нового уровня, основанные на наночастицах и/или единичных молекулах включая одноэлектронные транзисторы и высокочувствительные биосенсоры.
Описано применение scanning probe microscopy (SPM) для литографического получения нанонструктуры на поверхности электрода. В качестве резиста для SP-литографии использовали органосилановый монослой, состоящий из октадецилсилиловых групп, нанесенный на кремниевый субстрат. Полученную структуру можно использовать как образец для получения уже золотого наноструктурированного электрода [60]. Самоорганизация.
Самоорганизация - один из наиболее распространенных методов наноструктурирования поверхности электрода. Самоорганизация алкантиолов на золотых электродах и десорбция таких самоорганизованных монослоев с поверхности может контролироваться потенциалом электрода [61]. Новый метод получения систем наноэлектродов, основанный на комбинировании использования матрицы и самоорганизации, был предложен в работе [62]: модификация стеклоуглеродного электрода системой золотых наноэлектродов с использованием микропор анодных пленок алюминия в качестве матрицы. Затем проводилась модификация L-цистеином с использованием самоорганизации.
Для получения систем наноэлектродов на основе меди также использовали самоорганизующиеся слои на основе коллоидных частиц [63]. Существуют простые методы получения золотых наночастиц с небольшим разбросом диаметра — восстановление растворов тетрахлораурата в присутствии тиол-содержащих органических соединений, самоорганизующихся на поверхности золота. Стабильные растворы больших по размеру частиц можно получить в отсутствии тиолов [64].
Наноматериалы в качестве меток в электрохимических иммуносенсорах и иммунополях
Множество различных материалов (золотые и серебряные наночастицы, полупроводниковые наночастицы, углеродные нанотрубки с ферментом, наноносители (кремниевые, полимерные, липосомные частицы)) широко используется в качестве меток в иммуносенсорах и иммунополях.
Применение золотых и серебряных наночастиц в иммунополях возникло в 70 годах, 5-50 нм коллоидные частицы золота использовали в электронной микроскопии в качестве зондов [235]. Впервые наночастицы золота или серебра в качестве электрохимических меток для вольтамперометрического мониторинга белок-белковых взаимодействий были использованы в 2000 году: определялись стрептавидин-биотиновые взаимодействия (до 2,5 нМ концентрации стрептавидина) адсорбционной вольтамперометрией с помощью меток из коллоидного золота на электродах из углеродной пасты [236]. В то же время были представлены чувствительные электрохимические иммунополя на основе коллоидных золотых частиц с непрямой детекцией с помощью анодной инверсионной вольтамперометрии [237]. Золотые метки антител растворяют в кислом растворе и определяют количественно. Метод был оценен на гетерогенных нанополях иммуноглобулина G и показал чувствительность, сравнимую с методом ELISA (310"12 М).
Аналогичный метод электрохимических нанополей на основе золотых наночастиц, покрытых серебром, был предложен в работе [238]. Серебро, растворяемое при низком рН, определяется на стеклоуглеродном электроде методом анодной инверсионной вольтамперометрии (чувствительность определения иммуноглобулина G - 610"12 М).
Для того, чтобы избежать стадию кислотного растворения, был разработан магнитный электрохимический иммуносенсор на основе магнитных частиц и золотых нано-меток [239], позволяющий прямую детекцию инверсионной вольтамперометрией до 0,02 мкг/мл IgG.
Амбрози с коллегами описали метод, использующий магнитный графит-эпокси-композитный электрод, позволяющий усилить адсорбцию и количественное электрохимическое определение специфического захвата золотых нанометок на поверхности парамагнитных частиц. Чувствительность определения составила 52 и 260 пг иммуноглобулина G/мл для спектрофотометрического (с пероксидазой хрена) и электрохимического (на основе золотых наночастиц) определения, соответственно [240]. Для конструкции проводящих иммуносенсоров использовали усиленные серебром золотые нано-метки. Велев и Калер [241] создали биосенсор на основе функционализованных антителами латексных сфер. Антитела с золотыми нанометками связываются с латексными сферами, расположенными в расселинах, при нанесении серебряного слоя образуется «мостик» между двумя электродами. Появление проводящего пути между двумя электродами позволяет измерить человеческий иммуноглобулин G до 0,2 пМ уровня.
Также было предложено [242] использование наночастиц сплава золото-медь (ядро меди, тонкая оболочка золота) в качестве меток олигонуклеотидов для электрохимической детекции гибридизации ДНК. Растворенные ионы меди определяются методом анодной инверсионной вольтамперометрии. Достигнута чувствительность к определяемым нуклеотидам 5 пмоль/л.
Была предложена новая процедура дендритного усиления для иммуносенсора на основе электрохимических кварцевых микровесов с применением функционализованных антителами золотых наночастиц. Контакт сенсорной поверхности с наночастицами, модифицированными антителами, обеспечивает первичное усиление сигнала, дендритный иммунокомплекс белка А и модифицированных антителами золотых наночастиц - вторичное усиление [243]. В системах без усиления детекция взаимодействия антиген-антитело достигается при концентрациях иммуноглобулина G более 10,9 мкг/мл, в то время как усиление позволяет детектировать 3,5 нг/мл.
Квантовые точки (QD) впервые были использованы в качестве флуоресцентных биологических меток [244,245]. Полупроводниковые наночастицы обладают узким, зависящим от размера, симметричным спектром испускания и фотохимически стабильны. Эти свойства, а также биосовместимость с ДНК и белками позволяют использовать их в качестве меток взамен флуорофоров, поэтому они представляют существенный интерес для оптической детекции [246]. Редокс-характеристики полупроводников (CdS, PbS, ZnS) и чувствительность инверсионного электрохимического анализа к их металлическим компонентам приводят к высокой чувствительности электрохимических биосенсоров, использующих квантовые точки. Была показана возможность одновременного определения белковых мишеней с использованием различных полупроводниковых частиц [247]. Карбаматная связка используется для связывания полупроводниковых наночастиц с вторичными антителами. Принцип работы мультианалитических электроиммунополеи сендвичного типа основан на двойном связывании. Антитела, привязанные к нанокристаллическим меткам и магнитным частицам, при связывании дают четкий вольтамперометрический пик, положение и интенсивность которого определяется соответствующим антигеном. Концепция была продемонстрирована для иммунополя на основе 2-микроглобулина, IgG, BSA, и С-реактивного белка, связанных с ZnS, CdS, PbS и CuS коллоидными кристаллами, соответственно.
Экспериментальная часть
Реактивы: цитохром с сердца лошади (Merck), цитохром Р450 2В4 (17-18 нмоль/мг, A4i8/A278 = 1 5), выделенный из печени кроликов, индуцированных фенобарбиталом, и очищенный, как было описано ранее [251], дидодецилдиметиламмоний бромид (ДДАБ) (Sigma-Aldrich), золотохлористоводородная кислота НАиСІ ЗНгО (Sigma-Aldrich), 2,2 -азино-бис(3-этилбензтиазолин-б-сульфоновая кислота), АБТС (Sigma-Aldrich), боргидрид натрия (Acros organics), каталаза (2800 ед/мг, Sigma), ацетилацетон (Aldrich), ацетат аммония (РЕАХИМ), уксусная кислота (РЕАХИМ), 5% раствор нафиона в низкомолекулярных спиртах (Fluka). Все другие использованные в работе вещества были по степени очистки не ниже уровня о. с. ч. Для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду.
В работе использовались трехконтактные печатные электроды, рабочий (диаметр 2 мм) и вспомогательный электроды - графитовые, электрод сравнения - хлорсеребряный (ООО НПП «ЭЛКОМ», Россия, www.elcom-moscow.ru). Золотые наночастицы, стабилизированные ДДАБ получали восстановлением водного раствора золотохлористоводородной кислоты боргидридом натрия по методике, описанной ранее [15, 252]. Наночастицы золота были охарактеризованы спектрофотометрически (ХП1ах=520 нм) и с помощью сканирующей электронной микроскопии (средний размер частиц 40-70 нм). Приготовление ферментных электродов На рабочую поверхность электрода наносили 2 мкл раствора золотых наночастиц, стабилизированных дидодецилдиметиламмоний бромидом (Au/ДДАБ-электрод) в хлороформе и инкубировали в течение 30 минут для испарения хлороформа. Иммобилизация цитохрома Р450 2В4. На модифицированный Au/ДДАБ-электрод наносили 0,2 нмоль (2 мкл 100 мкМ раствора) цитохрома Р450 2В4, через 30 минут наносили 1 мкл 5% нафиона. Перед проведением эксперимента электрод выдерживали при +5С в течение 12 часов.
Иммобилизация цитохрома с. На Au/ДДАБ-электроды наносили 2 нмоль (2 мкл 1мМ раствора) цитохрома с в ОДМ калий-фосфатном буфере (рН 7,4), через 30 минут наносили 1 мкл 5% раствора нафиона. Приготовление биферментных электродов Перед иммобилизацией фермента на рабочую поверхность электрода наносили 2 мкл раствора золотых наночастиц, стабилизированных дидодецилдиметиламмоний бромидом (ДДАБ) в хлороформе и инкубировали в течение 30 минут. На электроды Au/ДДАБ наносили 2 нмоль цитохрома с (2 мкл 1 мМ раствора в ОДМ калий-фосфатном буфере), 0,2 нмоль цитохрома Р450 2В4 (2 мкл 100 мкМ раствора в ОДМ калий-фосфатном буфере), через 30 минут наносили 1 мкл 5% раствора нафиона. Электрохимические измерения проводились с использованием потенциостата Autolab PGSTAT 10 (Eco Chemie, Нидерланды) с программным обеспечением GPES. Электрохимический сигнал электродов с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4 регистрировали методом циклической вольтамперометрии. Измерения проводились в ОД М фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 50 мМ NaCl (электролитный буфер), скорости сканирования от 5 до 200 мВ/с, в интервале потенциалов +200 +- —700 мВ. Значения потенциалов приведены относительно хлорсеребряного электрода (Ag/AgCl) сравнения.
Для регистрации в кинетическом режиме образования пероксида водорода и поглощения кислорода был использован бипотенциостат IPCween (Институт физической химии и электрохимии им. Фрумкина РАН, Россия) с программным обеспечением IPC_Tween. Данный прибор позволяет поддерживать заданное напряжение независимо на каждом из двух рабочих электродов (измерительном и операционном с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4). Электрохимическое восстановление цитохрома Р450 2В4 проводилось в 0,5 мМ растворе бензфетамина (или без субстрата) в электролитном фосфатном буфере при потенциале на рабочем электроде Е = - 450 мВ. В качестве датчиков пероксида водорода использовались печатные электроды, модифицированные берлинской лазурью [253] а также печатные графитовые электроды, модифицированные цитохромом с [254]. Потенциал, подаваемый на измерительные электроды, был равен 0 мВ и -50 мВ соответственно. Определение концентрации пероксида водорода проводили по методу градуировочного графика. Концентрацию пероксида водорода в исходном растворе определяли спектрофотометрически (8240=4-3.6 М" см"1) [254]. Измерение количества кислорода, поглощаемого в ходе ферментативной реакции цитохрома Р450 2В4, производили амперометрически с помощью микроэлектрода Кларка (Instech, США) при потенциале -700 мВ [255]. Над раствором создавалась атмосфера аргона для предотвращения дополнительного доступа кислорода воздуха в ячейку. Калибровка микроэлектрода Кларка проводилась амперометрически, измерением тока при атмосферном давлении (100% содержания кислорода, 240 мкМ) с последующим добавлением дитионита натрия и регистрацией максимального изменения тока, принимаемого за нулевое значение кислорода в буфере. Разность значений этих токов принималась за величину, соответствующую концентрации растворенного в буфере кислорода [255,257]. Для определения термодинамических параметров каталитического цикла на электроде с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4 регистрировались цикловольтамперограммы в анаэробных условиях в диапазоне температур 5-М-0С с шагом 5С. Из цикловольтамперограмм определяли величины окислительно-восстановительного потенциала для каждой температуры как среднее значение соответствующих потенциалов Ер.а. и Ер.с,. Термодинамические параметры рассчитывались из зависимостей Е от Т и Е/Т от 1/Т. В работе использовался термостат ThermoStatPlus (Eppendorf, США). Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Сагу 100 (Varian Inc, Нидерланды). Скорость N-деметилирования бензфетамина в каталитической реакции цитохрома Р450 2В4 определяли по количеству выделившегося формальдегида, дающего окрашенный продукт с реактивом Нэша, используя коэффициент экстинкции s4i2= 4000 М см-1 [257,258]. Измерение пероксида водорода, образовавшегося в результате электрокаталитической реакции цитохрома Р450 2В4, проводили спектрофотометрически с использованием пероксидазы хрена и субстрата АБТС [259].
Электрохимические характеристики ферментных электродов
За основу для получения электродов с иммобилизованным цитохромом Р450 2В4 были взяты ранее полученные электроды [252]. В работе были использованы печатные электроды с графитовым рабочим и вспомогательным электродом и хлор-серебряным электродом сравнения (рис. 9). Рис. 9. Схематическое изображение печатного электрода 1 - рабочий электрод 2 - вспомогательный электрод 3- электрод сравнения AgAgCl 4 - серебряные контакты Модифицированные электроды на основе наночастиц золота, дидодецилдиметиламмоний бромида, покрытые пленкой нафион, используемые в исследовании, были охарактеризованы методом цикловольтамперометии, квадратно-волновой вольтамперометрии. Сущность метода амперометрии состоит в измерении тока окисления или восстановления электроактивных частиц. В большинстве случаев в ходе эксперимента на рабочий электрод подается постоянный потенциал относительно электрода сравнения. Наблюдаемый ток оказывается пропорционален либо объемной концентрации электроактивных частиц, либо скорости их расхода или образования в биокаталитическом слое. Цикловольтамперометрия представляет собой вольтамперометрию с относительно быстрой треугольной разверткой потенциала, позволяющей регистрировать одновременно вольтамперограммы с анодной и катодной разверткой потенциала, отражающие, в частности, и электрохимические Квадратно-волновая вольтамперометрия — способ снижения границы определяемых концентраций вещества при проведении вольтамперометрии, при котором на постоянную составляющую напряжения налагают переменную Цикловольтамперограммы позволяют определить окислительный (Ера) и восстановительный (Ера) пики, количество электроактивного вещества на электроде, величину полупотенциала (Е ш) и другие параметры. 3 -10D О 200 400 600 Е, мВ Рис. 12. Основные параметры цикловольтамперограммы. Был разработан метод иммобилизации ферментов на наноструктурированные электроды. Между печатным графитовым электродом, модифицированным золотыми наночастицами, стабилизированными синтетическим поверхностно-активным веществом дидодецилдиметиламмоний бромидом (ДДАБ) и гемом цитохрома Р450 2В4, включенного в эту матрицу, наблюдается прямой безмедиаторный перенос электронов [252]. P450 2B4 P450 2B4 Золотая наночастица Печатный электрод Печатный электрод Рис. 13. Схема действия наночастиц золота при переносе электрона с электрода на белок. По-видимому, золотые наночастицы выполняют роль системы близко расположенных, но изолированных наноэлектродов, облегчающих электронный транспорт от электрода на гем цитохрома Р450 2В4, за счет сравнимого размера с молекулой цитохрома. Это приводит к усилению электрохимического отклика системы, что известно из литературных данных на примере различных белков и нуклеиновых кислот [260-265] и подтверждено в наших исследованиях. Сравнительные цикловольтамперограммы для электродов Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион и ДДАБ/Р450 2В4/нафион приведены на рис. 14. Золотые наночастицы были синтезированы по методике [266,268] и охарактеризованны спектрофотометрически (кто. = 520 нм). Золотые наночастицы, стабилизированные дидодецилдиметиламмоний бромидом, имеют размеры 40-70 нм по данным сканирующей электронной микроскопии (рис. 16). Р450 2В4, иммобилизованного на печатном электроде. Циклические вольтамперограммы электродов: А) Аи/ДДАБ/Р450 2В4/нафион, Б) ДЦАБ/Р450 2В4/нафион. Скорость сканирования v=50 мВ/с. Аэробные условия. 0,1 М калий-фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 0,05 мМ NaCl, объем электролита 1 мл. Длина волны, нм —г Рис. 15. Спектр поглощения золотых наночастиц в хлороформе. S3400 5.O0KV x2QM SE 2.00um S3400 50bkV x20.0k BSECOMP Рис. 16. Данные сканирующей электронной микроскопии для печатных электродов, модифицированных ДДАБ (А), Au/ДДАБ в хлороформе (Б). Дидодецилдиметиламмоний бромид - синтетический мембраноподобный материал широко используемый в качестве матрицы для включения белка и иммобилизации на поверхность электродов. ДДАБ является подходящей матрицей для включения наночастиц золота и их стабилизации. 4/нафион при скоростях сканирования от 10 до 100 мВ/с. Аэробные условия. 0,1 М калий-фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 0,05 мМ NaCl, объем электролита 1 мл. При скоростях сканирования от 5 мВ/с до 250 мВ/с зависимости величин катодного и анодного тока от скорости сканирования в анаэробных условиях линейны, что говорит о том, что электрохимические процессы протекают на поверхности электрода: регистрируются электрохимические процессы, происходящие на иммобилизованном гемопротеине, а не в растворе [267].
