Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из основных направлений исследований в биохимии является изучение процессов метаболизма белков в организме. И если в вопросах синтеза белков мы обладаем значительным объемом информации, то другая сторона проблемы — катаболизм белков — остается пока недостаточно изученной. Среди многочисленных проблем деградации белков в клетке вопросы распознавания поврежденных белков эндогенными протеазами остаются на настоящий момент практически невыяснеными. Существует ряд данных, указывающих на то, что самоинактивация ферментов в ходе катализа и изменения в структуре белка, которыми она сопровождается, могут быть начальной стадией универсального механизма деградации белков в организме1.
Одним из белков, способных инактивироваться в ходе катализа, является цитохром Р4502.
Микросомальная монооксигеназная система, локализованная в эндоплазматической сети клеток печени, выполняет в организме важную функцию по окислительной модификации неполярных физиологически активных веществ, как поступающих в организм извне — ксенобиотиков, так и образующихся в клетке: холестерин, стероидные гормоны, жирные кислоты, простагландины и т.д.3 В процессе некоторых из этих реакций цитохром Р450 может самоинактивироваться как реакционно—способными метаболитами субстратов, так и продуктами неполного восстановления кислорода (О,-, Н20„, ОН), которые, как правило, появляются в результате
разобщения основного каталитического цикла цитохрома Р4504.
Механизм инактивации цитохрома Р450 активными интермеди— тами, которые образуются в реакциях окисления суицидных субстра —
Oliver С. N. et al., in: Cellular Regulation and Malignant Growth, Токіо, Japan Sci. Soc.
Press, 1985, pp. 320-331.
Karuzina 1. I., Archakov A. I., Free Rad. Biol. & Med., 1994. v. 17. pp. 557-567.
Archakov A, et al., Cytochrome P450 biochemistry and biophysics Moscow: 1NCO—TNC, Joint Stock Company. 1992, pp. 673-679.
Archakov A.. Zhukov A., Drug metabolism—from molecules to man, London: Taylor & Francis. 1987. P. 473-476.
тов, исследован в достаточной мере подробно. В его основе лежит модификация гема, реже апофермента5.
Второй путь, являющийся следствием разобщенности моно — оксигеназных реакций, исследован в гораздо меньшей степени. Цитохромы Р450 микросом печени, в отличие от бактериальных цитохромов Р450, не окисляют ни один из известных субстратов с полным сопряжением и часть редокс эквивалентов расходуется в побочных оксидазных реакциях. Продукты неполного восстановления кислорода, которые, как правило, появляются при распаде окси— и пероксикомплексов цитохрома Р450 в результате разобщения монооксигеназного цикла, могут быть вовлечены в инактивацию цитохрома Р4506.
Окислительная модификация цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях может быть начальной стадией в процессе его распада, и выяснение молекулярных механизмов этой реакции открывает новые возможности для понимания путей обновления белков в клетке.
Цель и задачи исследования:
В настоящей работе исследовалась инактивация изолированного цитохрома Р450 2В4 в монооксигеназной реконструированной системе в процессе окисления бензфетамина с целью выявления изменений в структуре гемопротеина под действием перекиси водорода, образующейся в активном центре фермента.
Исходя из основной цели исследования,были поставлены следующие задачи:
-
Провести исследования инактивации цитохрома Р450 в монооксигеназной реконструированной системе при различном соотношении Р450 2В4 и НАДФН — зависимого флавопротеина.
-
Исследовать влияние каталазы и цитохрома Ь5 на скорость инактивации цитохрома Р450 и накопление продуктов реакции.
-
Исследовать причины обесцвечивания цитохрома Р450 в процессе его инактивации, провести исследование механизма модификации гема цитохрома Р450.
-
Исследовать возможность модификации апофермента цитохрома Р450 в процессе окислительной самоинактивации гемопротеина.
Ortiz de Montellano P., Stearns R.A., Drug. Metab. Rev., 1989, v. 20, pp. 183- 191. Karuzina I. I., Archakov A. 1., Free Rad. Biol & Med., 1994, v. 16, pp. 73-97.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В результате проделанной работы удалось показать, что изолированный цитохром Р450, функционирующий в монооксигеназной реконструированной системе, инактивируется Н„0„, которая образуется в активном центре цитохрома Р450 прямым путем при распаде пероксикомплекса. Окислительная самоинактивация цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях сопровождается потерей гема с последующим его разрушением под действием Н.О,, накопленной в инкубационной среде. Наряду с деградацией гема в процессе окисли — тельной инактивации цитохрома Р450 была обнаружена модификация апоферменте, которая сопровождалась агрегацией и полимеризацией гемопротеина. Также было показано, что в процессе инактивации Р450 происходит модификация первичной структуры белка. Выяснение молекулярных механизмов окислительной модификации цитохрома Р450 в процессе катализа открывает новые возможности для понимания путей обновления белков в клетке и возникновения ряда патологических состояний в организме.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 8 —ой Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Португалия, Лиссабон, 1993), на 10-ом Международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Канада, Торонто, 1994) и на 9 —ой Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Швейцария, Цюрих, 1995). Апробация диссертации состоялась на научной конференции лабораторий НИИ биомедицинской химии РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включая 2 таблицы и 18 рисунков, и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение полученных результатов", "Выводы", "Список литературы".
Высокоочищенный препарат цитохрома Р450 2В4 получали по методу Карузиной и соавт.7 с некоторыми модификациями аффинной хроматографии, предложенной Imai и Sato8.
НАДФН —цитохром Р450 редуктазу выделяли по методу Yasukuchi и Masters9.
Мономеризацию цитохрома Р450 2В4 и НАДФН — цитохром Р450 редуктазы проводили по методу Бачмановой и соавт10.
Концентрацию цитохромов Р450 и Ь5 измеряли на спектрофотометре "Hewlett Packard" 8451А (США) по дифференциальному спектру поглощения его восстановленного СО—комплекса при длинах волн 450 и 490 нм п. При расчетах использовали коэффициенты молярной экстинкции 91 и 165 мМ~ см- , соответственно.
Содержание свободного гема определяли пиридингемохромоге — новым методом Ч.
Содержание гема, связанного с цитохромом Р450, измеряли методом гель—проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке BioSil Sec250 фирмы "BioRad", США. Содержание гема в элюате регистрировали с помощью спектрофотометра с проточной кюветой фирмы Waters при 418 нм.
Содержание белка измеряли по методу Lowry и соавт.12, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Содержание свободных аминогрупп измеряли в процессе проведения гель—фильтрации методом постколоночной модификации с ортофталевым альдегидом (реактив "Fluor" фирмы "Beckman"). Смешивание буфера (100 мкМ К —фосфатным буфером (рН 7.4) с эмульгеном 913) и ортофталиевого альдегида происходило в постколоночном реакторе (диаметр 0.14 мм, общий объем 0.3 мл) в соотношении 5:1, соответственно. Через 30 сек после смешивания
Карузина И., и др., Биохимия, 1979, т. 44, с. 1049 — 1057.
Imai Y., Sato R., BBRC, 1974, v. 60, pp. 8-14.
Yasukuchi Y., Masters В., J. Biol. Chem.. 1976. v. 251, pp 5337-5344.
Bachmanova G. etal., BBRC, 1986, v. 139. P. 883-888.
Omura Т., Sato R., J. Biol. Chem., V964, v. 239, pp. 2379-2385.
Lowry O., et al., J. Biol. Chem., 1951, v. 193. P. 265-275.
флуоресценцию регистрировали на флюориметре "Шимадзу" (Япония) с проточной кюветой при длине волны возбуждения 340 нм и испускания 455 нм.
Гель—проникающую высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили в нативных и денатурирующих условиях:
а) В нативных условиях гель — проникающую хроматографию
проводили на колонке BioSil Sec250 фирмы "BioRad", США
(диапазон фракционирования 300—1 кДа). Содержание белка в
элюате регистрировали методом иостколоночной модификации с
ортофталевым альдегидом, с последующим измерением флюо
ресценции (см. измерение NH2 — групп).
б) В случае определения молекулярной массы в денатурирующих
условиях гель — проникающую хроматографию проводили на
колонке TSK4000 фирмы "LKB", Швеция (диапазон фракциони
рования в присутствии 0.1% SDS 450 — 5 кДа). Содержание белка
в элюате регистрировали с помощью спектрофотометра с
проточной кюветой в диапазоне длин волн 210—280 нм.
Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в присутствии SDS по методу Laemmli 13.
Образование карбонильных групп регистрировали по методу Levine и Federici14.
Определение содержания SH —групп проводили с использованием пиренмалеимида в качестве флюоресцирующей метки с последующим применением метода пептидного картирования ,5.
