Введение к работе
Актуальность проблемы. Насекомые - вредители запасов наносят существенный экономический ущерб. По данным Организации по продовольствию и сельскому хозяйству (ФАО) ООН, они ежегодно уничтожают не менее 5-10% мировых запасов зерновых культур. Из насекомых - вредителей запасов на территории нашей страны одним из наиболее опасных является большой мучной хрущак Tenebrio molitor ,
В свого очередь, гусеницы пчелиной огневки Galleria mellonella наносят ощутимый вред пчеловодству. Так, потери воска, связанные с размножением этого насекомого, достигают по меньшей мере 20 % от его производства, а поражснность пчелиных семей составляет 10-28 % от их общего числа.
Применение химических методов борьбы с насекомыми-вредителями в большинстве случаев не возможно, так как делает продукцию не пригодной к употреблению. Значительно более перспективными являются биоинсектициды, и, прежде всего, препараты, полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных подвидов В. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (8-эндотоксинов, Cry-белков), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства видов животных и человека. Создание высокоэффективных биоинсектицидов данного класса для конкретных насекомых-вредителей, а также разработка путей предохранения от возникновения у них резистентности к этим препаратам требует знания процессов, происходящих при попадании эндотоксинов в организм насекомого-мишени. Таким образом, изучение различных стадий патологического эффекта 8-эндотоксииов (активации под действием кишечных протеиназ, связывания со специфическими токсинсвязывающими белками в мембранах кишечного эпителия, образования трансмембранных пор) является весьма актуальным.
Цели н задачи исследования. Целью работы было изучение взаимодействия энтомоцидных белков СгуЗА (В. thuringiensis ssp. tenebrionis) и Сгу9А (В. thuringiensis ssp. galleriae) с пищеварительной системой чувствительных к ним насекомых, личинок Т. molitor и гусениц G. mellonella, соответственно.
Для ее достижения были определены следующие задачи:
- изучить первичные характеристики пищеварительных протеиназ средней кишки гусениц G. mellonella и их участие в активации 5-эндотоксина Сгу9А;
- выделить из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Т. molitor и
гусениц G. mellonella белки, специфически связывающие токсины, эффективные против
этих насекомых (СгуЗА и Сгу9А, соответственно);
- изучить действие 8-эндотоксина СгуЗА на ионную проницаемость апикальных
мембран кишечного эпителия личинок большого мучного хрущака.
Научная новизна. В работе впервые:
- охарактеризован комплекс пищеварительных протеолитических ферментов
гусениц G. mellonella; получен препарат электрофоретически чистого трипсина из этого
насекомого; доказана способность кишечных протеиназ G. mellonella эффективно
активировать белок Сгу9А, токсичный против этого насекомого;
методом аффинной хроматографии из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Т. molitor выделены белки 66 и 58 кДа, специфически связывающие 8-эндотоксин СгуЗА, а из аналогичных мембранных препаратов гусениц G. mellonella - 67 кДа белок, специфически связывающий активированный токсин Сгу9А; произведена предварительная идентификация указанных белков;
показано наличие в апикальных мембранах клеток кишечного эпителия личинок Т. molitor ионных каналов и частично изучены их свойства; установлено, что 6-эндотоксин СгуЗА увеличивает проницаемость этих мембран, что связано либо с активацией собственных ионных каналов, либо с образованием новых, обладающих сходными свойствами.
Практическая ценность работы. Полученные данные о взаимодействии энтомоцидных токсинов СгуЗА и Сгу9А с элементами пищеварительной системы личинок Т. molitor и гусениц G. mellonella создают базу для дальнейших исследований механизма энтомоцидного эффекта этих белков, а также путей адаптации патогенного микроорганизма к физиологическим и биохимическим особенностям организма-хозяина. В свою очередь, результаты проведенных исследований могут быть использованы при создании биоинсектицидов нового поколения с существенно повышенной эффективностью против насекомых - вредителей запасов и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008) и IV Симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009).
Диссертационная работа была апробирована на заседании секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика»
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, обсуждение результатов, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста и содержит 36 рисунков и 7 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 235 источников, в том числе 6 на русском языке.
