Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 9
1.1.1. Основные типы болезней, вызываемые фитопатогенными грибами 9
1.1.2. Современные методы зашиты растений 12
1.1.3. Возможности биологических средств защиты растений от грибных болезней 15
1.1.4. Теоретические предпосылки использования антибиотических веществ в качестве экологически безопасных средств для борьбы с фитопатогенными грибами 19
1.2.1. Бактерия в. Thuringiensis и современные направления её использования 21
1.2.2. Токсины в. Thuringiensis 23
1.2.3. Белковый кристаллический дельта-эндотоксин 28
1.2.4. Механизмы действия дельта-эндотоксина в. Thuringiensis 31
1.2.5. Безопасность препаратов на основе в. Thuringiensis и их cry-токсинов 38
Глава 2. Объекты и методы исследований 40
Глава 3. Антифунгальная активность дельта-эндотоксина в. Thuringiensis в отношении ряда фитопатогенных грибов 49
Глава 4. Фунгистатическое действие дельта-эндотоксина в. Thuringiensis на прорастание спор a. Brassicae 75
Глава 5. Влияние дельта-эндотоксина в. Thuringiensis на дыхание клеток культур фитопатогенных грибов 78
Глава 6. Возможности использования дельта-эндотоксина для подавления грибных фитопатогенов 86
6.1. Влияние дельта-эндотоксина на развитие фитофтороза плодов томата при хранении 86
6.2. Действие дельта-эндотоксина на развитие корневой гнили злаковых культур . 90
Выводы 102
Литература 104
Приложения 124
- Возможности биологических средств защиты растений от грибных болезней
- Белковый кристаллический дельта-эндотоксин
- Влияние дельта-эндотоксина на развитие фитофтороза плодов томата при хранении
- Действие дельта-эндотоксина на развитие корневой гнили злаковых культур
Введение к работе
Актуальность темы.
Предотвращение загрязнения окружающей среды становится одной из наиболее актуальных проблем современности. Интенсивное использование синтезированных пестицидов для борьбы с вредителями и болезнями растений привело, особенно в последние десятилетия, к насыщению биосферы химическими веществами, токсичными для человека, животных, полезной флоры и фауны (Федоров, Яблоков, 1999). Вред пестицидов не исчерпывается только их прямым токсическим воздействием, так как в процессе разложения может происходить образование метаболитов, обладающих повышенной токсичностью и устойчивостью (Минеев с соавт., 1991).
Помимо этого, некоторые пестициды отличаются мутагенными, канцерогенными и тератогенными свойствами, могут изменять иммунный статус, нарушать репродуктивные функции (Ракитский, 2001). Убедительные данные свидетельствуют о том, что именно применение пестицидов вносит сегодня значительный вклад в ухудшение здоровья населения (Майрапетян, Татевосян, 2001).
Агрессивная политика химизации сельского хозяйства приводит не только к загрязнению окружающей среды, но и снижению эффективности традиционно используемых ядохимикатов в результате возникновения у фитопатогенов резистентности к ним. Известно, что снижение биологической эффективности химических препаратов достигает 20-60% (Буга с соавт., 2000; Рябчинская, Харченко, 2002). Вместе с тем, потери сельскохозяйственной продукции в результате поражения агроценозов болезнями, вредителями и сорняками в период 1960-1990гг. оставались в мире практически неизменными, составляя ежегодно 30-40% (Харина, 2000), поэтому необходимость защиты растений безальтернативна.
В связи с этим, в последнее время происходит переориентация стратегии и тактики систем защиты растений от фитопатогенов в направлении расширения ассортимента и объёма применения различных биологических препаратов.
Известно, что наибольшей селективностью и экологичностью обладают биопрепараты на основе микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности.
Микробиологические средства защиты растений имеют ряд преимуществ перед химическими, которые сводятся к следующему: высокая экологическая безопасность, достаточная биологическая эффективность, избирательность действия, безвредность для теплокровных животных и человека, отсутствие фитотоксичности и отрицательного влияния на вкусовые качества растительной продукции, отсутствие опасности накопления токсических веществ в окружающей среде (Лиховидов с соавт., 1986).
Одной из наиболее перспективных и широко используемых в качестве основы биопрепаратов является спорообразующая бактерия Bacillus thuringiensis. На её основе разработан ряд отечественных и зарубежных препаратов: энтобактерин, битоксибациллин, дендробациллин, лепидоцид, гомелин, дипел и др., в своей совокупности они составляют 90-95% биопрепаратов, используемых в сфере защиты растений от вредителей (Вершинина, Алимова, 2000; Захаренко, 2003).
Такие препараты признаны Управлением по контролю за качеством продовольствия и лекарственных средств США вполне безопасными для человека и окружающей среды (Харвуд, 1992).
Главным токсическим компонентом бактериальных инсектицидов на основе В. thuringiensis являются параспоральные кристаллы дельта-эндотоксинов. Установлено, что объектом его действия являются клетки эпителия средней кишки чувствительных насекомых (Percy, Fast, 1983). Дельта-эндотоксин, прежде всего, взаимодействует с рецепторами мембран чувствительных клеток, формируя в них специфические каналы-поры (Himeno et al., 1987). Установлено также нарушение транспорта ионов, зависящего от ионов К+ транспорта аминокислот, активирование АТРаз, разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания (Percy, Fast, 1983; Каменёк, Штерншис, 1985).
Кроме инсектицидного действия дельта-эндотоксины, вырабатываемые некоторыми подвидами В. thuringiensis, а именно spp. thuringiensis, finitimus, kurstaki, gallenae, проявляют антибиотическую активность по отношению к ряду аэробных микроорганизмов (Егоров с соавт., 1990; Юдина, Бурцева, 1997), подавляют рост опухолевых клеток млекопитающих. Имеются также данные об антибиотическом действии на фитопатогенные грибы спорокристаллического комплекса В. thuringiensis (Кандыбин, Смирнов, 1999; Смирнов, 2000) и дельта-эндотоксинов подвидов finitimus, wuhanensis (Юдина, Егоров, 1996). Тем не менее, возможности применения В. thuringiensis и её дельта-эндотоксинов в борьбе с грибными фитопатогенами остаются малоизученными.
Известно, что пути окислительного синтеза АТР имеют общие черты у всех аэробных организмов. Тем самым, возможно предположить наличие единого специфического механизма действия дельта-эндотоксина В. thuringiensis на чувствительные эукариотные организмы, включая фитопатогенные грибы. Изучение данных закономерностей может служить теоретической основой для разработки путей практического использования полученных результатов. Цель и задачи исследования.
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось установление антибиотической активности и особенностей механизма действия дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki в отношении фитопатогенных грибов различных таксономических групп, а также разработка практических приёмов их использования в борьбе с грибными патогенами растений.
Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи: 1. Выявить чувствительные к дельта-эндотоксину В. thuringiensis subsp. kurstaki фитопатогенные грибы: Rhizoctonia solani Kuhn., штамм S 160, Fusarium graminearum Schwabe, Fusarium oxysporum (Schlecht.) Snyd. et Hans., штамм -6-137, Fusarium oxysporam f.sp. lycopersici, Altemaria brassicae (Berk.) Sacc, Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker, Phytophthora infestans (Mont.) dBy, штаммы 3 и 5.
Определить характер фунгицидного действия дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki.
Выявить особенности механизма действия дельта-эндотоксина на клетки чувствительных микромицетов.
Изучить в условиях лабораторных и вегетационных опытов фунгицидное действие дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki на болезни растений, вызываемые P. infestans и F. graminearum.
Научная новизна результатов исследований.
Впервые дана оценка действия дельта-эндотоксина В. thuringiensis в отношении представителей 5 родов фитопатогенных грибов.
Установлено, что дельта-эндотоксин B.thuringiensis subsp. kurstaki обладает фунгистатическим действием по отношению к протестированным микромицетам. Наиболее чувствительными к дельта-эндотоксину оказались фитопатогенные грибы - P. infestans, R. solani, В. sorokiniana, наименее -A.brassicae. Степень чувствительности зависит от биологических свойств тест-культуры, фазы роста грибов, скорости радиального роста мицелия и концентрации токсина.
Показано, что в первые минуты инкубации суспензии клеток культур грибов F. graminearum, F. oxysporum f. sp. lycopersici, P. infestans с дельта-эндотоксином происходит резкая стимуляция поглощения кислорода, что характерно при обработке клеток веществами-разобщителями окислительного фосфорилирования и дыхания. Практическая значимость работы.
Выявленный фунгистатический эффект дельта-эндотоксина В. thuringiensis в отношении фитофтороза плодов томата в условиях хранения и фузариоза злаковых культур в процессе вегетации может быть использован для разработки новых экологически безопасных бактериальных препаратов.
Применение таких препаратов возможно в период вегетации растений, для предпосевной обработки семян и в процессе хранения сельскохозяйственной продукции.
Положения, выносимые на защиту:
Чувствительность фитопатогенных грибов pp. Rhizoctonia, Fusarium, Alternaria, Bipolaris, Phytophthora к дельта-эндотоксину B.thuringiensis.
Характеристика культурально-морфологических признаков чувствительных микромицетов и их изменений под влиянием токсина.
Стимулирование дельта-эндотоксином потребления кислорода клетками фитопатогенных грибов как симптом разобщения окислительного фосфорилирования и дыхания.
Возможности практического применения дельта-эндотоксина для подавления фитопатогенных грибов в процессе вегетации растений и хранения сельскохозяйственной продукции.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на I Международной научной конференции молодых учёных и студентов «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2000), IV республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы республики Татарстан» (Казань, 2000), XII всероссийской юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001), Международной конференции «Актуальные вопросы экологии и организации здравоохранения» (Ульяновск, 2001), V Пущинской всероссийской конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2001), на Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы плодородия почв на современном этапе развития» (Пенза, 2002), VII Пущинской всероссийской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), на кафедре экологии и генетики человека Ульяновского государственного университета. Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объём диссертационной работы.
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальных глав, выводов и приложения общим объёмом 136 страниц компьютерного набора. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 21 рисунком. Список литературы состоит из 202 наименований, в том числе 76 наименований на иностранном языке.
Возможности биологических средств защиты растений от грибных болезней
Многие виды почвенных бактерий, грибов и актиномицетов способны подавлять развитие целого ряда грибов, в том числе фитопатогенных.
Механизмами антигрибного действия микробов-антагонистов, которое, безусловно, может проявляться и как фунгицидное, и как фунгистатическое, считают антибиоз (Belanger, Deacon, 1996; Belanger, Benyagoub, 1997), лизис (Podile, Prakash, 1996; Bryk et al., 1998) и конкуренцию (Baker, Cook, 1974; Couteaudier, 1991; Kohl etal., 1997).
Важное место в защите растений от фитопатогенных микромицетов принадлежит вырабатываемым микроорганизмами антибиотическим веществам, которые возникли в ходе эволюции как мощное средство борьбы микроорганизмов друг с другом (Глик, Пастернак, 2002). После открытия антибиотиков для борьбы с заболеваниями растений, как правило, стали использовать не сами микроорганизмы, а продуцируемые ими вещества. Однако и сейчас в ряде стран выпускаются препараты, содержащие микроорганизмы, которые оказывают губительное действие на возбудителей болезней растений, причём произошло разделение сферы применения антибиотиков и микроорганизмов-антагонистов. Для борьбы с семенной инфекцией и для обработки поражённых вегетирующих растений используют антибиотические вещества, тогда как для борьбы с почвенной инфекцией, сохраняющейся на растительных остатках, применяют микробы-антагонисты в виде чистых культур или компостов для обогащения почвы. Дело в том, что эффективность внесения антибиотиков в почву невелика из-за быстрого разрушения их почвенными микроорганизмами (Вершинина, Алимова, 2000).
Также микроорганизмы, которые можно использовать для уменьшения ущерба, наносимого грибными фитопатогенами, способны синтезировать ферменты. Такие ферменты, как хитиназа, р 1,3-глюканаза, протеаза и липаза способны разрушать клеточную стенку грибов, позволяют снизить частоту-возникновения болезней растений, вызываемых микромицетами (Дьяков с соавт., 2001).
До недавнего времени поиск активных микробов-антагонистов проводился в основном среди грибов. Наиболее обширные исследования связаны с использованием в защите растений представителей рода Trichoderma (Федоринчик, 1978; Колобков, 1978; Салина с соавт., 1981; Великанов, Сидорова, 1988; Тулемисова, 1990; Марютин, 2000; Александрова с соавт., 2000; Коломбет с соавт., 2001; Громовых с соавт., 2002; Илларионова, 2002), Gliocladium (Manibhushan et al., 1989; Штейнберг с соавт., 1991) и Trichothecium (Kashyap, 1978; Юрина с соавт., 1989). Trichoderma продуцирует антибиотики (глиотоксин, виридин и др.) и комплекс различных ферментов (хитиназа, целлюлаза и др.), обладающих антигрибковыми свойствами. В России производимый на основе Trichoderma lignorum препарат триходермин широко используется только в защищенных грунтах для предпосевной обработки семян, опрыскивания растений и внесения в почву (Вершинина, Алимова, 2000).
Лишь недавно в число агентов микробиологического контроля численности возбудителей болезней растений были включены бактерии и актиномицеты. Как показали многочисленные исследования, наиболее перспективны для защиты от микозов бактерии родов Bacillus Cohn., Pseudomonas, Streptomices (Гораль, 1999; Utkhede, Amer, 2000). На основе этих бактерий выпускаются биофунгициды: фитоспорин-М, бактофит, псевдобактерин-2, агат-25К, планриз, фитолавин 300 и др. (Список пестицидов..., 2002). Эти биопрепараты применяются для борьбы с фитопатогенными грибами родов Fusarium Link, Sclerotinia Fuck., Botrytis Mich., Helminthosporium Link et Fr., Verticillium Nees, Rhizoctonia D C, Alternaria Nees и др. Однако удельный вес применения этих биопрепаратов по ряду причин невелик (Федоров, Яблоков, 1999; Шкаликов с соавт., 2001).
Бактерии рода Bacillus рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней растений в силу их широкого распространённого природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам. В качестве агентов биологического контроля болезней растений наиболее часто предлагаются штаммы, относящиеся к следующим таксономическим группам бацилл: В. subtilis, В. polymyxa, В. megaterium, В. pumilis, В. mesentericus, В. mycoides (Islam, Nandi, 1985; Gabriel et al., 1990; Новикова, 1995; Никонорова, 1996; Каленич с соавт., 1999; Мелентьев, 1999, 2000, 2001; Калько с соавт., 2001).
Не менее перспективны для борьбы с грибными заболеваниями препараты на основе В. thuringiensis (Spurr, Bailey, 1983; Кандыбин, Смирнов, 1999; Смирнов, 2000; Гришечкина с соавт., 2002). Так, проведённые исследования позволили сделать вывод, что В. thuringiensis subsp. darmstadiensis - продуцент препарата бацикола обладает антибиотической активностью против Botrytis cinerea Pers., Н. sativum Р.К. et В., F. oxysporum Snyd. et Hans., Rhizoctonia sp. Отмеченное действие связывается со спорокристаллическим комплексом этой бациллы и является специфичным в отношении фитопатогенных грибов (Смирнов, 2000; Гришечкина с соавт., 2002).
Установлено, что В. thuringiensis полностью подавляет рост Cercospora arachidicola и Cercosporidium personatum, возбудителей болезней арахиса, in vitro и на 70% - в полевых условиях, повышает урожай (Spurr, Bailey, 1983). Также известно, что грибы Verticillum latiriticum проявили небольшую чувствительность к действию полипептидов включений В. thuringiensis spp. finitimus, wuhanensis (Юдина, Егоров, 1996).
Высокая биологическая эффективность биопрепаратов на основе бацилл может быть обусловлена комплексом факторов. Представители рода Bacillus активно синтезируют циклические олигопептиды, ингибирующие синтез клеточной стенки (бацитрацин), олигопептиды, нарушающие функции мембран (грамицидины, полимиксин), основные пептиды, ингибирующие образование комплекса инициации трансляции на малой субъединице рибосом (эдеины), а также аминогликозиды, нарушающие функции рибосом (Новикова с соавт., 1995). Анализ литературы позволяет сделать вывод, что при антагонистическом действии Bacillus на фитопатогенные грибы ведущую роль отводят миколитическим ферментам: хитиназе, протеазе, липазе, целлюлазе и другим (Смирнов, 2000; Гришечкина с соавт., 2002).
Вместе с тем, ряд исследований указывает на отсутствие анагонистического действия очищенных ферментов бацилл. Так, в результате изучения роли миколитического комплекса ферментов культуры Bacillus sp.739 установлено отсутствие взаимосвязи между литическои активностью очищенной хитиназы Bacillus sp.739 и её способностью ингибировать ростовые процессы у фитопатогенных грибов (Мелентьев, 2000). Хитиназный комплекс Bacillus sp.739 обладает выраженной литическои активностью в отношении интактного мицелия зрелой культуры микромицетов, но не оказывает заметного влияния на молодой, активно растущий мицелий. Хитинолитические ферменты большинства почвенных бацилл имеют, скорее всего, другое экологическое значение, нежели хитиназы микопаразитических и энтомопатогенных организмов, а также высших растений. Их роль заключается в обеспечении клеток бацилл доступными источниками углерода и азота, образующимися при ферментативном гидролизе хитина (Мелентьев и соавт., 2001).
Белковый кристаллический дельта-эндотоксин
Дельта-эндотоксины параспоральных кристаллов В. thuringiensis -основной токсический компонент бактериальных инсектицидов, обеспечивающий их высокоспецифичное действие на насекомых. Общепризнанным является представление о том, что именно он является основным фактором патогенносте с собственно токсической функцией, обеспечивающим развитие комплекса специфических симптомов заболевания. Параспоральные кристаллы обычно состоят не менее чем из 2-х разновидностей дельта-эндотоксинов, часто отличающихся по интенсивности, специфичности инсектицидного действия. Соотношения этих дельта-эндотоксинов в кристаллах может изменяться в зависимости от состава сред, условий культивирования и других факторов, влияющих на экспрессию генов (Winder, Whiteley, 1989).
-29 Бактерии В. thuringiensis продуцируют дельта-эндотоксин через 2-3 часа после окончания экспоненциальной фазы роста, т.е. после завершения синтеза проспоровой перегородки (Bulla and al., 1976). Параспоральное включение формируется вне экзоспориума и лежит в спорулирующей клетке рядом со спорой. При освобождении споры освобождается также включение. Исключением является подвид В. thuringiensis subsp. finitimus, способный образовывать кристаллы как вне, так и внутри экзоспориума (Ревина с соавт, 1999). В последнем случае кристаллы после лизиса спорангиев остаются сцепленными со спорами. В одной клетке формируется одна спора и чаще одно параспоральное включение. Лишь В. thuringiensis subsp. kurstaki продуцирует на одну спору от 2 до 5 кристаллов.
Форма параспоральных включений В. thuringiensis варьирует от штамма к штамму, а также в пределах одного штамма. Включения могут иметь форму тетрагональных октаэдров, быть кубоидальными, каплевидными или овальными.
Так, кристаллы выделенного в Западной Сибири подвида novosibirsk (Н24а24с) представляют собой параллелепипеды с утолщёнными гранями. Кристаллические включения подвида wuhanensis имеют неправильную форму или являются шестигранниками. Для В. thuringiensis subsp. yunnanensis характерно образование маленьких сферических телец и редко встречающихся, крупных, в основном, бипирамидальных кристаллов. Коммерческий штамм В. thuringiensis subsp. kurstaki продуцирует кристаллы бипирамидальной и кубоидальной формы (Юдина, Бурцева, 1997).
Параспоральный кристалл является фактически протоксином. В условиях кислотных значений рН, присущих содержимому желудка большинства насекомых, протоксин устойчив. Иная ситуация имеет место для чешуекрылых. Для них характерны щелочные рН содержимого средней кишки, и при этих условиях в результате частичного протеолиза с участием кишечных ферментов и, возможно, протеаз, продуцируемых самой бактерией, из протоксина высвобождается устойчивый к протеазам пептид с молекулярной массой около 65000-85000 Д, то есть дельта-эндотоксин (Huber et al., 1981; Chestukhina et al., 1982). Растворимость кристаллов в щелочной среде свидетельствует о кислом характере белка. Установлено, что в составе белка входит более 25% аспарагиновой и глутаминовой кислот, которые и обуславливают кислотные свойства полипетида.
Субъединицы белка кристаллов подвидов, токсичных для чешуекрылых, состоят из димеров, каждый из которых включает мономеры. Они связаны дисульфидными мостиками. Протоксин сероварианта Н-1 содержит 18 сульфгидрильных групп на поверхности каждого димера, которые образуют внутри- и межмолекулярные дисульфидные мостики, обеспечивая стабильность кристаллов (Huber-Lukas, 1982).
Проведено большое количество работ по разделению белкового кристалла на фракции и выделению из них наиболее токсичных. Наибольшее внимание уделено изучению фракций эндотоксинов подвида kurstaki, продуцирующего бипирамидальные и кубические включения. Показано, что бипирамидальный кристалл состоит из белка Р-1, а кубоидальный включает и Р-1, и Р-2 (Yamamoto, Lizuka, 1983). Субъединицы белка Р-1 имеют относительную молекулярную массу 130 кД, а Р-2 - 65 кД (Samasanti and al., 1986). По другим данным (Tojio, 1985), токсическим компонентом кристаллов бипирамидальной формы является фрагмент с относительной молекулярной массой 59 кД. X. Шнепф и X. Уайтли (Schnepf, Whitely, 1985) указывают, что протоксин subsp. kurstaki с относительной молекулярной массой 134 кД в результате протеолиза образует пептиды с молекулярной массой около 70 кД, токсичные для чешуекрылых. Показано, что 55%-ная аминотерминальная последовательность белкового протоксина достаточна для того, чтобы он был токсичен. Оказалось, что кристаллы большинства подвидов В. thuringiensis содержат только один энтомоцидный белок Р-1, но некоторые штаммы (spp. kurstaki, thuringiensis, kenyae, tolworthi) продуцируют дополнительный белок Р-2, отличающийся по структуре (Yamamoto, Lizuka, 1983). Благодаря многочисленным исследованиям было установлено, что в образовании дельта-эндотоксина клетками В. thuringiensis участвуют специфические плазмиды (Дебабов с соавт.,1977; Gonzales et al., 1981). Эксперименты, основанные на последовательном удалении плазмид, показали, что в штаммах HDL и HD-73 (подвид kurstaki) и HD-2 (подвид thurmgiensis) гены кристаллов находятся в составе больших (50-105 мД) плазмид, так как потеря именно этих органелл приводила к потере способности продуцировать кристалл (Gonzales et al., 1981).
Доказательством того, что гены, ответственные за синтез кристаллов, находятся на плазмидах, может быть половой процесс бактерий. При смешивании клеток двух штаммов В. thuringiensis или В. thuringiensis и В. cereus может происходить с высокой частотой перенос плазмиды (Gonzales et al., 1982). При этом штаммы Cry- преобразуются в Сгу+ и синтезируют кристаллы с такой же антигенностью, как у донора, что доказывает плазмидную локализацию структурного гена.
Благодаря методам генной инженерии появилась возможность конструировать рекомбинантные микроорганизмы, которые будут продуцировать токсины с заданной специфичностью. Так, перенос таких плазмид в штаммы, неспособные к образованию кристалла, превращает их в кристаллообразующие. Ген инсектицидного белка типа К-73, расположенный на плазмиде размером 75 т.п.н. В. thuringiensis subsp. kurstaki, клонировали на плазмиде pBR 322 Escherichia coli. Биотест показал, что Е. coli производит токсин, обладающий такой же специфичностью, т.е. поражающий тех же насекомых, что и исходный штамм В. thuringiensis (Мс Linden et al., 1985).
К настоящему времени установлено, что наиболее характерным свойством дельта-эндотоксинов является способность действовать с высокой специфичностью на клетки эпителия средней кишки чувствительных насекомых, что обычно приводит к гибели последних (Aronson et al, 1986; Lane et al., 1987).
Изучению механизма действия дельта-эндотоксина посвящено довольно много работ. Так, Ангус (Angus, 1956) одним из первых высказал мнение, что в механизме энтомоцидного действия белкового кристалла В. thuringiensis ведущим процессом является паралич средней кишки с глубокими нарушениями проницаемости её стенки и обмена некоторых ионов, в частности калия.
Влияние дельта-эндотоксина на развитие фитофтороза плодов томата при хранении
В связи с тем, что в предварительных испытаниях дельта-эндотоксин B.thuringiensis проявил наибольшую антагонистическую активность по отношению к культуре P. infestans, представляло интерес исследовать влияние токсина на развитие фитофтороза плодов томата в условиях хранения на естественном инфекционном фоне.
Согласно полученным данным, дельта-эндотоксин сдерживает распространение фитофтороза и уменьшает степень поражения плодов томата на начальной фазе развития болезни. Так, при обработке токсином плодов томата без внешних признаков заболевания на 18-е сутки наблюдений поражённые плоды не наблюдались, хотя в контроле развитие и распространение фитофтороза составило 16,5 и 33,0% соответственно. На 25-е сутки в варианте опыта с токсином наблюдали увеличение количества пораженных плодов по сравнению с контролем на 28,0% и статистически недостоверное (р 0,05) снижение развития болезни на 4,0% (табл. 7).
Для сравнения эффективности действия дельта-эндотоксина с химическими препаратами, часть плодов томата была обработана нистатином концентрации 1%. Данный антибиотик показал 100%-ную эффективность в борьбе с фитофторозом томата, так как ни на 18-е, ни на 25-е сутки не наблюдалось развитие болезни. Действие нистатина на фитопатогенные грибы было отмечено ранее (Тарр, 1975; Сичунь Чжан, Лутова, 1999), но в связи с тем, что это препарат медицинского назначения, совершенно недопустимо, чтобы данное вещество оставалось на плодах в сколько-нибудь заметном количестве.
Необходимо отметить, что эффективность действия дельта-эндотоксина зависела от начального балла поражения обрабатываемых плодов: чем больше изначальный балл, тем менее эффективно влияние токсина. Так, при обработке токсином плодов с первым и вторым баллом поражения к 18-м суткам наблюдений развитие болезни составило 43,8 и 62,5% соответственно (72,3 и 74,0% - в вариантах без обработки токсином плодов того же балла поражения). Обработка плодов токсином, первоначально имеющих поражение фитофторозом до 26-50% (3-й балл), способствовала уменьшению развития болезни на 16,7% по сравнению с контролем. Действие дельта-эндотоксина на плоды, поверхность которых поражена свыше 50% (4-й балл) не отмечено (табл. 7).
Таким образом, проведённые опыты указывают на достаточно высокую эффективность действия дельта-эндотоксина на P. infestans, но только на начальной стадии развития микромицета. Биологическая эффективность дельта-эндотоксина в борьбе с фитофторозом плодов томата на 18-е сутки наблюдений составила 100% (на 25-е сутки разница между развитием болезни в опыте и контроле недостоверна) (табл. 8).-89 При обработке плодов томата, уже имеющих внешние признаки заболевания, действие дельта-эндотоксина зависело от первоначальной степени развития болезни. Биологическая эффективность токсина при обработке плодов первого балла поражения на 18-е сутки составила 39,4%, второго - 15,5%, третьего - 16,7%, четвертого - 0% (табл. 8). Тем самым, токсин не обладает искореняющим действием и эффективен именно в профилактических целях.
Полученные данные представляют практический интерес в связи с вредоносностью и широким распространением фитофтороза томатов (Дорожкин и соавт., 1976; Лисовий, Питель, 1999; Сичунь Чжан, Лутова, 1999; Chaban, Kyrylyuk, 2000). Как известно, культура томатов достаточно чувствительна к воздействию патогенной микрофлоры (Власова, Гаранько, 1974). Вредоносные болезни - фитофтороз, увядания, пятнистости, гнили и другие типы поражений способны резко снижать урожай восприимчивых сортов на 25-60% и больше (Власова, 1977; Билай с соавт., 1988).
На перспективность применения микробиологических препаратов на основе В. thuringiensis и её дельта-эндотоксинов для подавления фитофтороза томатов также указывают исследования О.В. Смирнова (2000). Так, наблюдения 1998г. показали резкое снижение проявления фитофтороза томатов при поливе растений суспензией бацикола (препарата на основе В. thuringiensis subsp. darmstadiensis и традиционно используемого для борьбы с вредными насекомыми).
Действие дельта-эндотоксина на развитие корневой гнили злаковых культур
Существенные колебания урожайности зерновых культур, возделываемых на полях России, влияют на стабильность всего агропромышленного комплекса. Важной причиной значительных потерь урожая зерна, а также ухудшения его качества являются болезни растений. Среди большого числа фитопатогенных микроорганизмов, поражающих зерновые культуры, наиболее распространёнными являются возбудители фузариоза.
Негативные последствия фузариоза колоса оцениваются как в форме прямых потерь урожая (трухлявость зерен, различная степень их щуплости), так и косвенных - снижение урожая вследствие изреживания посевов, развития корневых гнилей, белоколосости и так далее, то есть различных патологий роста и развития (Иващенко с соавт., 1997а). Помимо этого, все виды рода Fusarium, паразитирующие на злаках, образуют различные фузариотоксины. Их экономический ущерб сельскому хозяйству определяется не только прямыми потерями продуктов питания и кормов, но и гибелью, резким снижением привесов и воспроизводства сельскохозяйственных животных, возрастанием их чувствительности к инфекционным заболеваниям (Muriuki, Mirocha, 2000; Соколова с соавт., 2001; Бородин с соавт., 2002).
Несмотря на более чем вековую историю изучения, фузариоз колоса по-прежнему относят к числу наиболее вредоносных болезней злаковых в России и странах ближнего зарубежья (Билай, 1977; Иващенко с соавт., 19976, 2000; Клечковская, 1999; Крючкова, 2000; Кислых, 2000; Шералиев, Бухаров, 2001). Установлено, что распространение корневых гнилей злаковых (особенно озимых культур) с 1997 по 1999 гг. увеличилось с 69 до 94% (в 1,4 раза), а развитие болезни - с 29 до 54% (почти вдвое) (Безуглов, 2002).
Обилие публикаций о поражении зерновых культур фузариозом в странах Западной Европы, Америки и Азии свидетельствует о широком распространении фузариоза колоса (Klingenhagen, Frahm, 1999; Gonzales, Trevathan, 2000; Gilbert, Tekauz, 2000; Gilbert, Morgan, 2000; Utkhede, Amer, 2000).
Один из опасных возбудителей фузариоза - F. graminearum. Данный фитопатогенный гриб вызывает заплесневение сеянцев пшеницы, кукурузы, семян, гнили корней, цветочную гниль колосьев, стеблевую, листовую (Билай, 1977).
В настоящее время наиболее экономически выгодным и экологически безопасным средством получения здоровых всходов является предпосевное протравливание семян. Против корневых гнилей семян протравливание является обязательным технологическим приёмом, поскольку протравливающая субстанция поступает с семенами именно туда, где находится возбудитель (Секун с соавт., 1999; Титко, 1999; Amelung, 2000; Schluter, Blucher, 2000; Безуглов с соавт., 2002). Для достижения защитного эффекта при использовании данного метода достаточно, в сравнении с обычным опрыскиванием, лишь 2% действующего вещества. Протравители уничтожают поверхностную и внутрисемейную инфекцию, предохраняют ростки от плесневения, стимулируют рост и развитие растений, улучшают перезимовку озимых зерновых культур. Наиболее эффективно протравливание в борьбе с корневыми гнилями (Шкаликов с соавт., 2001).
В связи с этим, одним из перспективных и доступных приёмов борьбы с корневыми гнилями злаковых возможна предпосевная обработка семян дельта-эндотоксином В. thuringiensis. Изучение действия дельта-эндотоксина на возбудителя корневой гнили злаков F. graminearum проводили в лабораторно-вегетационных опытах на искусственном инфекционном фоне.
Сравнительный анализ средней степени развития корневой гнили овса в различных вариантах опыта свидетельствует о достоверном снижении (р 0,05) данного показателя при предпосевной обработке семян дельта-эндотоксином (табл. 9).
Так, средний балл поражения растений фузариозом при инфицировании семян F.graminearum составил 4,1, а в том же варианте опыта, но с дополнительной обработкой токсином было выявлено снижение развития болезни до 3,3 баллов. Достаточно эффективной также оказывается обработка токсином семян на фоне внесения фитопатогена в почву: развитие корневой гнили достоверно снижалось на 20,7%. Сдерживание развития фитопатогена в варианте обработки неинфицированных семян овса дельта-эндотоксином является статистически недостоверным (р 0,05).
Необходимо отметить, что влияние дельта-эндотоксина на развитие корневой гнили определялось способом заражения. Обработка семян овса токсином на фоне внесения F.graminearum в почву снижает развитие фузариоза на 20,7%, на фоне заражения семян - 19,5%. Вероятно, это обусловлено тем, что искусственное инфицирование растений овса посредством семян является более эффективным: средний балл развития корневой гнили превышает данный показатель при инфицировании почвы в 1,4 раза.
Возможно, при внесении инфекционной суспензии в почву не обеспечивается необходимый для успешного заражения контакт патогена с семенами растения. Известно, что пропагулы большинства грибов фиксируются почвенными частицами на том или ином расстоянии от корней, которое им необходимо преодолеть (Дьяков, 1998). При этом общий уровень распространённости болезни (70,0-88,0%) указывает на достаточно эффективное заражение овса. Известно, что если показатель поражения растений составляет более 60%, то инфекционный фон считается достаточно жёстким (Методика по оценке устойчивости ..., 2000).
Необходимо отметить, что при обработке токсином семян овса и внесении фитопатогена в почву эффективное снижение степени развития корневой гнили сочеталось с увеличением её распространённости. Так, распространённость болезни на 18-е сутки наблюдений в опыте составила 70,0%, с токсином - 80,0% (р 0,05). Увеличение распространённости болезни на 5,0% также наблюдали при обработке токсином предварительно инфицированных семян. А в случае обработки здоровых семян овса отмечали снижение распространённости болезни на 5,0%. Но результаты статистической обработки не позволяют утверждать о наличии указанных закономерностей (Р 0,05).
Согласно данным таблицы 10, дельта-эндотоксин на искусственном инфекционном фоне увеличивает всхожесть семян овса в среднем на 27,0-30,0% (р 0,05). Наблюдаемое увеличение жизнеспособности здоровых семян овса при обработке их токсином статистически недостоверно (р 0,05).
Анализ средней высоты растений овса указывает на достоверное снижение (р 0,05) данного показателя в вариантах инфицирования семян F. graminearum и внесения фитопатогена в почву по сравнению с контролем (табл. 11). Это объясняется воздействием корневой гнили на развитие растений. Известно, что при наличии корневой гнили у больных растений снижается высота на 16%, сухая масса - на 14% и масса зерна - на 5% (Janczak, Pawlak, 1998).
