Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время все большую актуальность приобретает вопрос о полноте извлечения нефти из коллекторов и разработке способов борьбы с загрязнениями окружающей среды нефтью и ее продуктами. Существует необходимость в поиске микроорганизмов - деструкторов нефти и продуцентов поверхностно активных веществ (био-ПАВ, биосурфактанты), изменяющих свойства нефтяных флюидов. С помощью микроорганизмов возможно получение ПАВ, обладающих высокой растворимостью в водах различной минерализации и с высокой поверхностной активностью. Способность к образованию биосурфактантов выявлена у широкого круга микроорганизмов. Микробное сообщество нефтяного пласта, эксплуатирующегося с применением заводнения, включает аэробные, и, в том числе, углеводородокисляющие бактерии, и анаэробные бродильные, сульфатредуцирующие и метанобразующие прокариоты. С нагнетаемой водой в пласт поступает растворенный кислород и микроорганизмы, что способствует развитию в призабойной зоне нагнетательных скважин аэробно-анаэробного микробного сообщества (Розанова, Кузнецов, 1974; Иванов и соавт., 1982; Борзенков и соавт., 1994; Назина, Беляев, 2004). Наибольший интерес представляют углеводородокисляющие бактерии, которые при росте на углеводородах нефти образуют поверхностно-активные вещества, способствующие проникновению углеводородов в клетку (Banat et al., 2008; Kuyukina et al., 2005; Филонов и соавт., 2008).
Изучению аэробных углеводородокисляющих бактерий нефтяных пластов посвящен широкий ряд работ (Розанова, Кузнецов, 1974; Иванов и соавт., 1982; Борзенков и соавт., 1996; Назина, Беляев, 2004), тогда как образование биосурфактантов пластовыми микроорганизмами мало изучено. В немногочисленных публикациях отмечалось образование биосурфактантов при нагнетании бактерий рода Bacillus и сахаросодержащих субстратов в нефтяной пласт (Youssef et al., 2007), тогда как продукция био-ПАВ из нефти в пласте не исследовалась. При использовании биотехнологии повышения нефтеизвлечения, основанной на активации аэробно-анаэробного микробного сообщества нефтяного пласта, показано образование летучих кислот, спиртов и газов в пласте (Беляев и соавт., 2004). В то же время систематические исследования образования биосурфактантов в пласте и влияния разных микробных метаболитов на вытеснение нефти не проводились.
В связи с вышесказанным, изучение распространения и разнообразия микроорганизмов, способных продуцировать ПАВ, в заводняемых нефтяных пластах, образования биосурфактантов в пласте и выделение перспективных продуцентов ПАВ представляется актуальной и важной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение распространения и разнообразия микроорганизмов - продуцентов поверхностно-активных веществ в заводняемых нефтяных пластах, образования биосурфактантов и других микробных метаболитов в пласте в ходе применения биотехнологии повышения нефтеизвлечения и оценка их воздействия на вытеснение нефти.
Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.
-
Исследовать распространение, биоразнообразие и численность аэробных органотрофных бактерий, образующих биосурфактанты, в терригенных нефтяных пластах на примере нефтяных месторождений Дацин и Даган, различающихся температурой пластов.
-
Выделить аэробные органотрофные бактерии из нефтяных пластов и определить их таксономическое положение и физиологические характеристики, способствующие распространению в нефтяных пластах.
3. Исследовать образование поверхностно-активных веществ (ПАВ),
способствующих наибольшему снижению поверхностного и межфазного натяжения,
при росте микробного сообщества пластовой воды и выделенных чистых культур на
н-алканах и других субстратах.
4. Исследовать образование поверхностно-активных веществ и других
микробных метаболитов из нефти в пласте в ходе применения биотехнологии
повышения нефтеизвлечения, основанной на введении аэрированной воды и солей
азота и фосфора, и статистически оценить влияние разных метаболитов на
вытеснение нефти.
Научная новизна работы. Впервые выполнены экологические исследования распространения аэробных бактерий, образующих биосурфактанты, в нефтяных пластах на примере изучения месторождений Дацин и Даган, отличающихся температурой пластов. Показано, что численность продуцентов био-ПАВ в ряде проб пластовой воды достигала численности аэробных органотрофных бактерий.
В нефтяных пластах Дацина, длительно заводняемых поверхностными водами, разнообразие аэробных мезофильных бактерий было велико; среди них выявлены бактерии родов Rhodococcus, Bacillus, Pseudomonas и Dietzia, образующие био-ПАВ из широкого ряда субстратов и н-алканов нефти. Выделены штаммы Rhodococcus ruber 14Н и Bacillus licheniformis 421, образующие высокоэффективные био-ПАВ гликолипидной природы, связанные с клеточной стенкой. В высокотемпературных горизонтах нефтяного месторождения Даган основными продуцентами био-ПАВ были представители рода Geobacillus, в том числе бактерии, выделенные в новый вид Geobacillus jurassicus sp. nov. Впервые проведены систематические исследования образования био-ПАВ из нефти в нефтяном пласте. Выполнен статистический анализ результатов испытаний биотехнологии повышения нефтеизвлечения, основанной на нагнетании аэрированной воды и солей азота и фосфора, на месторождении Даган, и
определено влияние различных микробных метаболитов на вытеснение нефти. Показано, что снижение поверхностного натяжения пластовой воды вследствие образования биосурфактантов, и накопление летучих кислот, образуемых аэробными бактериями при окислении нефти, оказывает основное влияние на вытеснение нефти. Практическая значимость работы. Показано, что в пластовых водах нефтяного месторождения Дацин обитает многокомпонентное микробное сообщество, включающее мезофильные аэробные бактерии, анаэробные бродильные и метанобразующие микроорганизмы. Результаты изучения продуцентов био-ПАВ, выделенных из месторождения Дацин, позволяют рекомендовать применение биотехнологии активации пластовой микрофлоры для повышения нефтеизвлечения на исследованных нефтяных пластах. Выделенные бактерии Rhodococcus ruber 14Н, Bacillus licheniformis 421 и Bacillus subtilis 32a образуют биосурфактанты, эффективные при разведении культуральной среды в 100-1000 раз, что позволяет рекомендовать нагнетание культуральных сред этих бактерий в нефтяной пласт в качестве био-ПАВ, а культуры включать в состав биопрепаратов для очистки от нефтяных загрязнений. Метод Вилкоксона-Манна-Уитни, используемый для статистической обработки результатов испытаний биотехнологии активации пластовой микрофлоры, позволяет идентифицировать добывающие скважины, реагирующие на биотехнологическое воздействие, и может быть использован для доказательства эффективности применения микробных биотехнологий повышения нефтеизвлечения.
Место проведения работы. Работа проводилась под руководством д.б.н. Т.Н. Назиной в лаборатории нефтяной микробиологии в рамках плана научно-исследовательских работ ИНМИ РАН по теме: «Биоразнообразие, метаболизм и геохимическая деятельность микроорганизмов нефтяных месторождений и других подземных экосистем и возможность совершенствования природоохранных и энергосберегающих биотехнологий» (Госрегистрация № 01200950961), а также при поддержке РФФИ (гранты № 02-04-39002, 05-04-39029 и 06-04-49128), Китайской национальной нефтяной компании (CNPC, контракт DFT04-122-IM-18-20RU), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF, RBO-1364-MO, RBO-1364-MO-02, RUB1-30028-MO-12) и Миннауки РФ (Ведущая научная школа академика РАН М.В. Иванова, 2006-РИ-112.0/001/367 и НШ-1189.2012.4).
Апробация работы. Материалы диссертации были неоднократно представлены на международных симпозиумах по подземной микробиологии (Джексон-Холл, США, 2005; Шизуока, Япония, 2008; Гармиш-Партенкирхен, Германия, 2011); на Второй международной конференции по прикладной микробиологии и молекулярной биологии нефтяных систем (2nd International Conference on Applied Microbiology and Molecular Biology in Oil Systems, Орхус, Дания, 2009); на 3-м Московском Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития"
(Москва, 2005), на VI и VIII Международной молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2010, 2012).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ, в том числе 6 статей и 7 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит их введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 134 страницах и включают 33 рисунка и 27 таблиц. Список литературы включает 39 отечественных и 182 зарубежных наименований.
