Введение к работе
Актуальность проблемы. Микроорганизмы нефтяных пластов служат объектом исследования с 1926 года. С использованием микробиологических, радиоизотопных и молекулярно-биологических методов в пластовых водах выявлены анаэробные бродильные, сульфат-, серо-, тиосульфат- и железо-редуцирующие прокариоты, ацетогены и метаногены (Назина, Беляев, 2004; Magot et al., 2000; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). Аэробные бактерии обнаружены в заводняемых нефтяных пластах, куда они, вероятно, проникают с буровым раствором и нагнетаемой водой при разработке месторождения (Розанова, Кузнецов, 1974). Растворенный кислород поступает в пласт с нагнетаемой водой и способствует росту аэробных микроорганизмов (Кузнецова, Ли, 1964; Иванов и соавт., 1982; Розанова, Назина, 1982). Показано, что в заводняемом нефтяном пласте обитает аэробно-анаэробное микробное сообщество.
Особый интерес представляют аэробные углеводородокисляющие бактерии, которые являются первым звеном трофической цепи, основанной на биодеградации нефти. Из нефтяных пластов выделен ряд мезофильных углеводородокисляющих бактерий. Термофильным аэробным бактериям посвящено немного работ. Выделенные из нефтяных пластов термофильные бактерии относятся к родам Bacillus, Geobacillus, Thermoactinomyces, Thermus и Petrobacter (Nazina et al., 2001, 2005; Hao et al, 2004; Salinas et al, 2004).
Изучение углеводородокисляющих бактерий актуально для решения фундаментальных и прикладных задач. При окислении углеводородов бактерии образуют поверхностно-активные вещества (ПАВ), способствующие проникновению углеводородов в клетку. ПАВ существенно изменяют реологические свойства нефти, что обусловливает использование этих бактерий в технологиях повышения нефтеотдачи (Беляев и соавт., 2004; Youssef et al., 2009). По геохимическим данным, температура залежей деградированной нефти не превышает 80С (Head et al, 2004). Однако аэробные и анаэробные микроорганизмы, осуществляющие окисление нефти при столь высокой температуре, пока не выделены.
Кроме того, не исследованы генетические аспекты биодеградации углеводородов термофильными прокариотами. У мезофильных аэробных бактерий хорошо изучены гены alkB, кодирующие фермент алкан-монооксигеназу, который вводит атом кислорода в концевой атом н-алкана. Сведений о генах биодеградации углеводородов термофильных микроорганизмов практически нет. К началу
настоящей работы в Генбанке было лишь два фрагмента последовательностей alkB генов термофильных бактерий рода Geobacillus.
Геобациллы неоднократно выделяли из нефтяных пластов, но молекулярными методами геобациллы выявляли лишь однажды (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). Методы анализа генов 16S рРНК, выявленных во фракции ДНК микроорганизмов пластовой воды, направлены на выявление последовательностей всех присутствующих прокариот, но не позволяют оценить степень их активности в пласте. Подобные исследования микробных сообществ выполнены на высокотемпературных нефтяных пластах США (Orphan et al, 2000; Gieg et al., 2010), Западной Сибири (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003), Китая (Назина и соавт., 2006; Shestakova et al., 2011; Li et al, 2006 и др.). Известно, что в растущей клетке существенно возрастает количество рибосом, поэтому анализ фракции рРНК, выделенной из исследуемой пробы, позволяет выявить метаболически активные компоненты сообщества (Poulsen et al., 1993). Данный подход не применялся для изучения микроорганизмов нефтяных пластов, что свидетельствует об актуальности этих исследований.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение разнообразия микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов (на примере нефтяного месторождения Даган) и выявление метаболически активных прокариот, выделение аэробных термофильных углеводородокисляющих бактерий и поиск генов ферментативной системы окисления н-алканов у представителей рода Geobacillus и в подземном микробном сообществе.
Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.
1. Определить численность и распространение микроорганизмов основных
метаболических групп в пластовых водах месторождения Даган.
2. Выделить доминирующие термофильные углеводородокисляющие бактерии,
определить их таксономическое положение и метаболические свойства,
способствующие распространению и деятельности в нефтяных пластах. Исследовать
рост выделенных штаммов на углеводородах нефти и индивидуальных н-алканах.
3. Осуществить поиск генов ферментативной системы биодеградации н-
алканов у бактерий рода Geobacillus.
4. Определить филогенетическое разнообразие прокариот и выявить
метаболически активные группы путем создания библиотек клонов генов 16S рРНК
и alkB и 16S крДНК (комплементарной 16S рРНК) на основе тотальных ДНК и РНК,
выделенных из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины в
период биотехнологического воздействия.
Научная новизна работы. Впервые для анализа микробного сообщества нефтяного пласта применен комплексный подход, сочетающий микробиологические и радиоизотопные методы с молекулярно-экологическим методом, основанным на анализе генов 16S рРНК и alkB в библиотеках клонов, созданных на основе ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды. Показано, что аэробные спорообразующие бактерии рода Geobacillus доминируют в посевах наибольших разведений пластовой воды на среды с н-алканами и сырой нефтью, что подтверждается выделением чистых культур (G. subterraneus, G. stearothermophilus) и доминированием генов 16S рРНК геобацилл в ДНК-библиотеке клонов микробного сообщества пластовой воды. Выделенные и коллекционные штаммы геобацилл окисляют н-алканы нефти с длиной цепи Сі2-С29-зі при температуре инкубации от 45 до 70-75С. При исследовании 11 штаммов, принадлежащих к разным видам рода Geobacillus, впервые обнаружено 8 различных гомологов гена alkB (alkB-geol - alkB-geoS), кодирующего фермент алкан-монооксигеназу. В геноме каждого штамма геобацилл присутствовало от 3-х до 6-й гомологов гена alkB, из которых только alkB-geol и alkB-geo4 были универсальны для всех штаммов. Последовательности alkB-geol -alkB-geo6 гомологов геобацилл имеют 87.7-99.2% сходства с генами alkB бактерий рода Rhodococcus, что не позволяет использовать эти гены для детекции геобацилл в природном местообитании. Впервые выявлено доминирование последовательностей геобацилл в библиотеках клонов генов 16S рРНК и alkB, созданных на основе ДНК из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины высокотемпературного нефтяного пласта. Биодеградация нефти в пласте сопровождается увеличением содержания растворенных минеральных карбонатов, обогащенных изотопом С, и летучих кислот в пластовой воде. Выявлены последовательности 16S рРНК мезофильных и термофильных аэробных органотрофных и бродильных бактерий, а также микроорганизмов цикла серы, что свидетельствует о метаболической активности этих микроорганизмов в нефтяном пласте.
Научно-практическая значимость работы. Выделенные бактерии рода Geobacillus могут использоваться в биотехнологиях очистки от нефти при высокой температуре, а также в биотехнологиях повышения нефтеизвлечения для интродукции в высокотемпературные нефтяные пласты. Метод анализа ДНК- и РНК-библиотек клонов генов 16S рРНК и 16S крДНК микроорганизмов пластовой воды, позволяющий полнее охарактеризовать микробное сообщество и выявить метаболически активные микроорганизмы, может быть рекомендован для выбора участков пласта, пригодных для применения биотехнологии повышения
нефтеизвлечения, основанной на активации пластовой микрофлоры. Результаты изучения генов биодеградации н-алканов у термофильных прокариот и экологии микроорганизмов нефтяных пластов могут быть использованы при чтении лекций по микробиологии в высших учебных заведениях.
Исследования выполняли в 2002-2012 годах при поддержке РФФИ (гранты №№ 02-04-39002, 05-04-39029 и 06-04-49128), Китайской национальной нефтяной компании (контракт DFT04-122-IM-18-20RU), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF RBO-1364-MO и RBO-1364-MO-02) и Миннауки РФ (Ведущая научная школа академика РАН М.В. Иванова, 2006-РИ-112.0/001/367 и НШ-1189.2012.4).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-м Московском Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), II и III Международной молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2006, 2007) и симпозиумах (International Symposium for Subsurface Microbiology) (Джексон-Холл, США, 2005; Шизуока, Япония, 2008).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей и 5 тезисов.
Место проведения работы. Работа проводилась в ИНМИ РАН (лаборатория нефтяной микробиологии) под руководством д.б.н. Т.Н. Назиной и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ЦКП "Геном") под руководством к.б.н. А.Б. Полтарауса. В отдельных этапах работы принимали участие Н.М. Шестакова, B.C. Ивойлов и Д.Ш. Соколова. Геносистематические работы проводили совместно с д.б.н. Т.П. Туровой, ДНК-ДНК гибридизацию - с к.б.н. A.M. Лысенко, жирные кислоты клеточной стенки анализировали под руководством д.б.н. Г.А. Осипова.
Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. Т.Н. Назиной, профессору, д.б.н. С.С. Беляеву, к.б.н. А.Б. Полтараусу и д.б.н. Т.П. Туровой за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Автор благодарит всех коллег, друзей и свою семью за полезные советы и поддержку.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста и включают 17 рисунков и 19 таблиц. Диссертация состоит их разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть", включающая "Объекты и методы исследования", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы" и "Список литературы", который содержит 54 отечественных и 215 зарубежное наименование.
