Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзорный анализ литературы 10
1.1. Таксономия бактерий рода Bacillus 10
1.2. Физиолого-биохимическая характеристика бактерий рода Bacillus 17
1.3. Феномен устойчивости спор к различным факторам окружающей среды 20
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 29
2.1. Физико-географическая характеристика озера Байкал и термальных источников Котельниковский, Хакусы, Змеиный .. 29
2.2. Физико-географическая характеристика озера Хубсугул... 35
2.3. Методы исследований 39
ГЛАВА 3. Распространение, биоразнообразие и физиолого- биохимическая характеристика представителей рода Bacillus в воде, донных осадках озера Байкал и термальных источниках Прибайкалья 54
3.1. Пространственное распределение представителей рода Bacillus в воде и донных осадках озера Байкал 54
3.2. Биоразнообразие бактерий рода Bacillus, изолированных изводы и донных осадков оз. Байкал 71
3.3. Ферментативная активность штаммов рода Bacillus, выделенных из оз. Байкал 80
3.4. Ферментативная активность культивируемых бактерий рода Bacillus в термальных источниках Прибайкалья (Змеиный, Хакусы и Котельниковский) 84
ГЛАВА 4. Бактерии рода Bacillus в донных осадках оз. Хубсугул 89
4.1. Распределение и численность бактерий рода Bacillus в донных отложениях озера Хубсугул 4.2. Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий рода Bacillus 93
ГЛАВА 5. Роль микроорганизмов рода Bacillus в биодеградации сложных органических соединений и растворении соединений кремния 96
5.1. Деградация углеводородов бактериями рода Bacillus 96
5.2. Деградация бис-(2-этилгексил)фталата бактериями рода Bacillus 104
5.3 Роль представителей рода Bacillus в растворении соединений кремния 109
Заключение 116
Выводы 122
Список литературы 124
Приложения 141
- Физиолого-биохимическая характеристика бактерий рода Bacillus
- Физико-географическая характеристика озера Байкал и термальных источников Котельниковский, Хакусы, Змеиный
- Пространственное распределение представителей рода Bacillus в воде и донных осадках озера Байкал
- Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий рода Bacillus
Введение к работе
Актуальность проблемы. Представители рода Bacillus вызывает большой интерес микробиологов по причине повсеместного распространения представителей этого рода бактерий, цикла развития, необычной устойчивости их спор к химическим и физическим агентам и патогенности.
В настоящее время проводится широкий спектр исследований представителей данных бактерий, хотя гетерогенность по физиологическим, экологическим и генетическим характеристикам затрудняет классификацию бактерий рода Bacillus. Для идентификации представлен обширный список фенотипических признаков.' Кроме того, в международном генном банке зарегистрирован 3779 фрагмент последовательностей гена 16S рибосомальной РНК, которые отнесены к роду Bacillus. Следует отметить, что полные геномы получены для 38 штаммов бацилл ().
Несомненно, огромный интерес представляет изучение механизмов устойчивости спор к различным физическим и химическим факторам. Споры с момента обнаружения были признаны самой выносливой среди известных форм жизни на Земле. В состоянии покоя споры показывают высокую степень устойчивости к инактивации различными физическими и химическими факторами, включая влажный пар, высушивание, ультрафиолетовое и гамма-излучение, вакуум и окисляющие агенты (Nicholson et al, 2000). Несмотря на инактивацию метаболизма, споры остаются способными к непрерывному контролю пищевого состояния их среды, и они быстро реагируют на поступление необходимых питательных веществ, прорастая и возобновляя вегетативный рост. Покоящиеся споры показывают невероятную долговечность и могут быть обнаружены фактически в любом типе среды обитания на Земле. Например, споры строго термофильного Bacillus spp. были изолированы из осадков холодных озёр (Nicholson et al, 2000). Имеются дискуссионные сообщения о том, что
жизнеспособные споры Bacillus sphaericus были восстановлены из кишки пчелы в Доминиканском янтаре, возраст которого от 25 до 40 миллионов лет (Fischman, 1995; Сапо, Borucki, 1995).
Группа спорообразующих бактерий в озере Байкал, озере Хубсугул и термальных источниках Прибайкалья изучена недостаточно. Было показано, что эта группа бактерий составляет до 20% в составе микробного сообщества озера Байкал. Бактерии рода Bacillus в основном выделяли из придонных слоев воды и донных осадков (Максимова, Максимов, 1989). По результатам молекулярно-генетического анализа из глубоководной пробы воды, отобранной на центральной станции Южного Байкала, были получены всего 3 последовательности, отнесенные к роду Bacillus с невысоким процентом гомологии с ближайшими родственниками (Белькова и др., 1996).
Термальные источники - это особая экологическая ниша, сообщество ; микроорганизмов которых является уникальным. Несомненный интерес представляет потенциальная ферментативная активность этих термофильных бактерий. Так, например, из гидротермальных источников Змеиный и Горячинский были выделены специфичные эндонуклеазы рестрикции из Bacillus stearothermophilus (Репин и др., 2001). Очень подробно изучено микробное сообщество и его биологическая активность в гидротермах Прибайкалья (Бурятия) лабораторией института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Уде (Дармаева и Намсараев, 2002, Данилова и др., 2003, Зайцева, 2005, Шагжина, Балданова, 2005, Базаржапов и др., 2006). По данным, представленным Зайцевой СВ. и Шагжиной А.П., изолировали также и штаммы, отнесённые к роду Bacillus. Термальные источники Котельниковский, Хакусы и Змеинка ранее были изучены Бельковой Н.Л. и Тазаки К. (2003), где микробное сообщество представлено с точки зрения химических процессов.
В донных осадках озера Хубсугул бактерии рода Bacillus ранее не изучались. Была проведена работа по определению ферментативной активности донного микробного сообщества (Maximov, 2006).
Исходя из показанной особой устойчивости спор, исследование спорообразующих бактерий в экстремальных условиях высоких и низких температур представляет особый научный интерес.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - установить распространение, видовой состав и физиолого-биохимическую активность бактерий рода Bacillus в экосистемах озера Байкал, озера Хубсугул и термальных источниках Прибайкалья.
Для выполнения данной цели были поставлены следующие задачи:
изучить распространение исследуемой группы бактерий в воде и осадках оз. Байкал;
установить закономерности распределения бактерий в районах нефтепроявлений и влияния реки Селенги, содержащей промышленные и бытовые стоки;
- исследовать численность, распределение и разнообразие бактерий рода
Bacillus в донных осадках оз. Хубсугул;
отработать метод культивирования и изоляции спорообразующих бактерий из термальных источников Прибайкалья;
сформировать коллекцию чистых культур бактерий рода Bacillus из исследуемых водных объектов и определить их видовой состав и ферментативную активность;
изучить активность чистых культур в процессах деградации различных органических соединений и в процессах биоминерализации в условиях лабораторного эксперимента.
Научная новизна. Впервые группа бактерий рода Bacillus показана в различных природных экосистемах озера Байкал, озера Хубсугул и термальных источниках Прибайкалья. Проведено систематическое определение видового состава. Впервые бактерии данной группы выявлены в
8 термальных источниках, отработаны методы их изоляции при высоких температурах, определена ферментативная активность. Впервые установлена роль представителей этой группы в процессах деструкции «байкальской нефти», полициклических ароматических углеводородов, фталатов и биоминерализации соединений кремния.
Практическая значимость. Сформирована коллекция культур бактерий рода Bacillus, изолированных из озера Байкал, Хубсугул и термальных источников. Их способность деградировать различные органические соединения - нефть, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), фталаты - и высокая ферментативная активность могут быть использованы в практических целях. Кроме того, бактерии рода Bacillus могут быть использованы в экологическом мониторинге как показатели поступления органического вещества.
Защищаемые положения:
1. Бактерии рода Bacillus обнаружены во всех исследуемых природных
объектах, составляя значительную долю в культивируемом гетеротрофном
сообществе оз. Байкал, оз. Хубсугул и термальных источниках Прибайкалья.
Видовой состав бактерий рода Bacillus в оз. Байкал представлен тремя
известными в науке филогенетическими группами данного рода (В. subtilis
группа I, В. alvei группа И, В. brevis группа III), а в оз. Хубсугул - одной (В.
subtilis группа I).
2. Бактерии рода Bacillus обладают большим биологическим
потенциалом и принимают активное участие в процессах деструкции
сложных органических соединений и биоминерализации соединений
кремния.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на I микробиологическом конгрессе Европейского микробиологического общества, проходившем в Любляне, Словения (июнь-июль, 2003), на международном Байкальском микробиологическом симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ»,
9 проходившем в Иркутске (сентябрь, 2003), на научно-практическом совещании «Перспективы нефтегазоносности Байкала и Западного Забайкалья», г. Улан-Удэ (октябрь, 2003), на межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», г. Иркутск (октябрь, 2004) , посвященной 90-летию со дня рождения проф. А. Г. Гриневич, на Четвёртой Верещагинской Байкальской конференции, г. Иркутск (сентябрь-октябрь, 2005), на международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», г. Саратов (сентябрь, 2005) и на IX Съезде гидробиологического общества РАН, проходившем в г. Тольятти (сентября, 2006). По материалам диссертации опубликовано 11 работ (из них 3 статьи в рецензируемых журналах).
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзорного анализа литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (126 источников, из них 42 - зарубежных) и 8 приложений. Объем работы составляет 163 страницы машинописного текста, включающего 5 таблиц, 34 рисунка и 8 приложений.
Физиолого-биохимическая характеристика бактерий рода Bacillus
Род Bacillus объединяет прямые или почти прямые палочковидные бактерии, размеры которых 0.3-2.2 х 1.2-7.0 мкм. Большинство подвижно. Жгутики расположены перитрихиально. Образуют термоустойчивые эндоспоры, но не более одной в клетке-спорангии. Спорообразование не подавляется экспозицией на воздухе. Окраска по Граму строго положительна или положительна только при окрашивании молодой культуры. Большинство видов Bacillus - типичные хемоорганотрофы. Они не нуждаются в факторах роста и способны ассимилировать минеральные формы азота в качестве единственного его источника. Метаболизм строго дыхательный, строго бродильный или дыхательный и бродильный одновременно при использовании различных субстратов. Конечным акцептором электронов в дыхательном метаболизме служит молекулярный кислород, который для некоторых видов может быть заменён нитратами. Большинство видов образует каталазу. Они являются облигатными аэробами или факультативными анаэробами. Содержание ГЦ пар в ДНК исследованных штаммов варьирует от 32 до 62 мол.%. Типовой вид: Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn 1872 (Краткий определитель бактерий Берги, 1980).
Некоторые виды образуют антибиотики. Например, В. licheniformis образует антибиотики бацитрацин, лихениформин и протицин. Количество изученных антибиотиков, продуцируемых В. subtilis, составляет несколько десятков. Например, антибиотики группы бацилломицина, итурин, фунгистатин, микобациллин, микосубтилин и др. нарушают развитие и подавляют рост фитопатогенных грибов (Широков и др. 2002). Bacillus subtilis и фенотипически близкие штаммы являются продуцентами гексаеновых антибиотиков с противогрибковым действием (Кудряшова и др., 2005). Препараты, полученные на основе штаммов В. subtilis и обладающие антагонистической активностью в отношении ко многим патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, имеют высокую эффективность при лечении заболеваний. Спорообразующие аэробные бактерии продуцируют широкий спектр биологически активных веществ (БАВ) и различных пробиотиков (Бакулина и др., 2001, Ушакова и др. 2006). Бактерии рода Bacillus синтезируют различные литические ферменты, расщепляющие полисахариды, белки, жиры и другие макромолекулы (Бакулина и др., 2001).
Большинство бацилл - сапрофиты. Основное место их обитания - почва. Есть среди них и патогенные для животных и человека формы, например, В. anthracis - возбудитель сибирской язвы, а также виды, вызывающие различные заболевания членистоногих (Гусев, Минеева, 2006).
Виды рода Bacillus характеризуются бациллярным типом спорообразования, при котором клетка в период формирования споры сохраняется палочковидной или в некоторых случаях только слегка утолщается. Спора локализуется в центре клетки эксцентрально или терминально, в зависимости от вида микроорганизма (Гусев, Минеева, 2006). Однако некоторые виды, такие как В. stearothermophilus, В. sphaericus, В. psychrophilus, В. globisporus, характеризуются клостридиальным типом спорообразования; в этом случае во время образования споры спорангий раздувается (Краткий определитель бактерий Берги, 1980).
Необходимо отметить, что спорообразующие бактерии имеют специфичный жизненный цикл, который состоит из двух основных стадий -прорастание споры и её образование, так называемая споруляция.
В благоприятных условиях большинство спор прорастает. Этому процессу предшествует поглощение воды и набухание. При этом происходят глубокие физиологические изменения: усиливается дыхание и возрастает активность ферментов, наблюдается выделение аминокислот, дипиколиновой кислоты (ДПК) и пептидов. Кроме того, за время прорастания потеря сухой массы достигает 25-30%. В этот же период споры утрачивают свою термоустойчивость. Затем из споры выходит ростовая трубка либо на одном из концов споры (полярно), либо сбоку (латерально). При этом оболочки споры разрываются или ростовая трубка проходит через них. В результате прорастания образуется вегетативная клетка, и при благоприятных условиях питания бациллы могут неограниченное время размножаться делением.
Спорообразование начинается лишь тогда, когда ощущается недостаток в питательных веществах или когда в избытке накапливаются продукты обмена. Образование спор внутри бактериальной клетки начинается с накопления белкового материала, поэтому показатель преломления в месте ее образования возрастает. Различные метаболические превращения сопровождаются расходованием имеющихся запасных веществ. В течение пяти часов спорообразования перестраивается до 75% белков материнской клетки. При этом происходит образование специфичного для спор вещества - дипикалиновой кислоты (ДПК). Эта кислота может составлять до 15% сухой массы споры. В вегетативных клетках она отсутствует. По-видимому, ДПК в виде кальциевой соли входит в состав оболочки споры.
Спорообразование начинается с особого неравного деления клетки. В результате инвагинации цитоплазматической мембраны часть протопласта отделяется от материнской клетки. Этот протопласт содержит часть ядерного материала. Затем протопласт будущей споры окружается, как бы обрастает цитоплазматической мембраной материнской клетки. В результате он оказывается покрытым двумя цитоплазматическими мембранами: одной внутренней и одной внешней, которая обращена наружным слоем вовнутрь. Затем внутренняя мембрана секретирует материал, подобный материалу клеточной стенки. В результате этого между двумя мембранами возникает клеточная стенка, окружающая протопласт споры. Наружная оболочка споры образует протопласт материнской клетки. Пространство, остающееся между двумя оболочками (кортекс), заполняется полимерами гликопептидной природы, имеющими сетчатую структуру. Наружная оболочка споры может быть многослойной. У некоторых бактерий материнская клетка образует ещё один покров - экзоспориум.
Эндоспора, которая может существовать как свободная спора или как структура в рамках вегетативной клетки, легко определяется при использовании фазово-контрастного микроскопа, потому что она в любой стадии жизненного цикла клетки остается высоко преломляющей. Ранее исследователи использовали окраску и специальные условия (такие как длительное нагревание), чтобы окрасить химически непроницаемую спору. Однако было показано, что окраска по Граму позволяет определить присутствие спор; спора остается неокрашенной, в то время как вегетативные клетки или вегетативная часть спорангия окрашиваются. Простота микроскопического определения споры и её теплоустойчивости ранее позволяли находить различные типы эндоспорообразования. Споры могут легко изолироваться из любой естественной среды: почв, воды, пищевых продуктов и т.д. Для этого образец суспендируют в воде и нагревают до 80С в течение 10-30 мин. Вегетативные клетки и другие покоящиеся формы, такие как цисты и экзоспоры, обычно погибают при этой температуре, а теплоустойчивые эндоспоры при посеве на подходящие среды могут прорасти через 24-48 часов. Разнообразие мест обитания, из которых изолированы представители рода Bacillus, очень велико. Различные типы формирования эндоспор можно выделить при инкубировании прогретого инокулята, варьируя условия культивирования: температуру, концентрацию водородных ионов, степень аэрации и субстрат (Slepecky, Hemphill, 1992)
Физико-географическая характеристика озера Байкал и термальных источников Котельниковский, Хакусы, Змеиный
Озеро Байкал, самое глубокое и древнее пресноводное озеро на нашей планете, расположено в северо-восточной части Центральной Азии (5546 и 5129 с.ш.). Оно условно подразделяется на три части: Южный Байкал - до Селенгинского мелководья, Средний - приольхонская часть - до Академического хребта, протянувшегося от полуострова Святой нос до о. Ольхон, и Северный Байкал - самая протяженная: от п-ва Святой нос до северной оконечности озера в районе пос. Нижнеангарск (Кожов, 1962).
Байкал находится в рифтовой зоне и имеет тектоническое происхождение. Озеро появилось в результате разломов, сдвигов и образования складок в земной коре, поэтому глубина Байкала достигает рекордных для пресных водоемов отметок - 1637 м, что является его уникальной особенностью. Длина Байкала - 636 км, максимальная ширина -79 км, а минимальная ширина - около 26 км. Длина береговой линии - около 2000 км, площадь водосборного бассейна - около 23000 км . Глубоководные участки (более 250 м) занимают 80.9% акватории, тогда как мелководные участки (до 20 м) - всего 7.2%, от 20 до 70 м - 6.8%, от 70 до 250 м - 5.7% (Намсараев, Земская, 2000).
В Байкал впадает более 300 рек и речек, из них крупнейшей является Селенга. Она собирает воды через свои многочисленные притоки с обширной территории восточной части Центральной Азии. Река Селенга имеет площадь бассейна 447060 км2 и вносит в оз. Байкал около 50% всего речного стока. Воды, заполняющие обширный район Селенгинского мелководья, существенно отличаются от «собственно байкальских вод» (Голдырев и др., 1971).
Из других крупных рек необходимо упомянуть Верхнюю Ангару (длина 640 км), а также Кичеру, которые при впадении в Байкал образуют широкую и низкую дельту, заканчивающуюся Северо-Байкальским сором.
Озеро Байкал относится к типичным олиготрофным водоемам. Содержание органического вещества в водах Байкала низкое и составляет в верхнем слое воды 4.0-4.5 мг О/л, затем содержание органического вещества понижается, составляя около 3.0 мг О/л на глубине 1200-1400 м. В придонных слоях воды содержание органического вещества резко возрастает, достигая 8-Ю мг О/л, а в грунтовых растворах верхнего слоя донных отложений - 20-30 мг О/л. Минимальные концентрации органического вещества отмечены в зимний подледный период в январе-феврале и летом - в июле. Максимумы приходятся на апрель и сентябрь-октябрь, то есть проявляются вслед за окончанием массовой гибели фитопланктона (Вотинцев и др., 1975).
Озеро Байкал характеризуется своеобразным температурным режимом, который обусловлен не только климатическими условиями, а прежде всего глубиной озера и резким преобладанием глубинной зоны над мелководьями (Кожов, 1972). Сезонные изменения температуры толщи вод озера Байкал t охватывают лишь верхний слой воды, до глубины 200-250 м. Ниже его температура воды практически постоянна круглый год - 3.3-3.6С. Прогревание верхнего слоя вод начинается сразу же после установления ледяного покрова (февраль-март) за счет проникновения через него солнечной радиации. В связи с этим начинается подтаивание ледяного покрова снизу и поступление в верхний слой расплавов льда. Подледное прогревание, наряду с увеличением освещенности и поступлением талых вод, служит толчком для развития в этом слое фитопланктона и, как следствие, большого количества бактерий. После вскрытия озера ото льда проходит 40-50 и более дней, прежде чем весь верхний 20-метровый слой воды прогреется до 3.3 4.0С, а температура всей толщи воды озера практически уравняется, - наступает весенняя гомотермия. Вся толща вод в температурном отношении представляет собой единое целое. В Южном Байкале она приходится на третью декаду июня. Летнее прогревание в Южном Байкале длится от весенней гомотермии (обычно от конца июня до середины или конца августа). Поверхностный слой воды прогревается до 12-15С. На обширных мелководьях в июле-августе вода нагревается до 17-18С, в глухих заливах и сорах - до 22-24С (Кожов, 1972).
В период зимней стагнации Байкал покрыт льдом с января по апрель включительно. Для этого периода характерна обратная стратификация температур, наличие температурного скачка и развитие в марте-апреле холодолюбивого фитопланктона, сосредоточенного в слое 0-50 м (Кожов, 1962). Количество легкоокисляемого органического вещества нарастает от начала до конца периода в верхних горизонтах до 50 м (Вотинцев, 1961). После освобождения озера из-подо льда во второй половине мая наступает период весенней циркуляции и весенней гомотермии. Начинается интенсивное ветровое перемешивание. Развивавшиеся подо льдом водоросли отмирают и вместе с водными массами увлекаются вглубь. По данным К.К. Вотинцева (1961), содержание органического вещества выравнивается по всей толще, оставаясь несколько повышенным на поверхности.
В период летней стагнации с неустойчивым температурным равновесием (вторая и третья декада июля) начинается прогревание верхних слоев воды с последующим установлением прямой температурной стратификации, часто нарушаемой сильными штормами. Развивается летний комплекс фитопланктона и наблюдается годовой максимум зоопланктона (Кожов, 1962). С октября начинается понижение температуры, что сопровождается сильными штормами, вертикальными циркуляционными и горизонтальными течениями, понижением биомассы фито- и зоопланктона до годового минимума (Кожов, 1962; Шимараев, Гранин, 1991). В этот период происходит деструкция водорослей осеннего комплекса. Органическое вещество распространено по вертикали равномерно под действием интенсивного перемешивания, а скорость деструкции отмирающих водорослей оказывается гораздо меньше скорости их опускания под действием турбулентности вод (Максимова, Максимов, 1972).
Воды озера Байкал относятся к гидрокарбонато-кальциевым водам первого типа, для которых характерны крайне низкая минерализация (Вотинцев и др., 1961). Сухой остаток вод озера не превышает 95 мг/л в верхних слоях и 100 мг/л в нижних. Особенностью химического режима вод является исключительная бедность Са - 15 мг/л. Такие химические соединения как хлориды, сульфаты, гидрокарбонаты и калий распределяются во всех слоях воды равномерно, сезонные изменения их количества практически отсутствуют. Биогенные соединения - нитраты, фосфаты, силикаты и железо - распределяются по вертикали неравномерно, их количество в разные сезоны различно. Понятно, что они необходимы для фитопланктона. Их количество в верхних слоях воды в период вегетации резко уменьшается, но вновь накапливается в зоне фотосинтеза в период усиленной вертикальной циркуляции ко времени наступления весенней и осенней гомотермии. Придонные воды и грунтовые растворы значительно более минерализованы, нежели глубинные воды. Важной особенностью вод Байкала является обилие растворенного кислорода, содержание которого у дна даже в самых глубоких участках Байкала не бывает ниже 70-80% насыщения и в среднем для открытых вод составляет 11.48-11.64 мг/л (Кожов, 1972).
Пространственное распределение представителей рода Bacillus в воде и донных осадках озера Байкал
Деградация бис-(2-этилгексил)фталата. Изучали дефадацию бис-(2-этилгексил)фталата микробным сообществом воды р. Селенги и чистыми культурами Bacillus. В воду, отобранную из р. Селенги, добавляли БЭГФ до 100 мкг/л. По 50 мл полученного раствора помещали в стеклянные колбы, предварительно обработанные в течение 1 суток 0.1 М КОН и промытые дистиллированной водой, дополнительно очищенной от следов органических веществ с помощью хроматографической колонки с обращеннофазным сорбентом. Пробы инкубировали в холодильнике при температуре 4С. Для получения кинетической кривой разложения БЭГФ образцы воды анализировали через определенные промежутки времени, соответствующие динамике развития микроорганизмов в закрытой системе. Оценку возможного уменьшения содержания БЭГФ за счет сорбции на посуде проводили одновременно с анализом аналогичных проб, подвергнутых предварительной стерилизации.
Установление роли Bacillus в процессе деградации БЭГФ проводили в стерильных колбах, содержащих 50 мл минимальной среды и БЭГФ, исходная концентрация которого составляла 300 мкг/л, вносили исследуемые микроорганизмы. Пробы выдерживали в течение 11 суток при 4С. Контролем служил стерильный раствор БЭГФ. Содержание БЭГФ в среде определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на микроколоночном хроматографе «Милихром А-02» («ЭкоНова», Новосибирск, Россия) (Азарова и др., 2003).
Выделение фепантрен-деградирующих бактерий. Для изолирования микроорганизмов, способных биологически окислять фенантрен, была использована минеральная среда следующего состава (г/л): СаС12 2Н20 - 0.1; FeCl3 - 0.01; MgS04x7H20 - 0.1; NH4N03 - 0.1; КН2Р04 - 0.2; K2HP04 - 0.8; рН 7 (Kahng, 2002). В качестве единственного источника углерода и энергии был использован фенантрен (1 г/л). Один грамм исследуемого образца донного осадка помещали в колбу, содержащую 50 мл жидкой минеральной среды. Культивирование проводилось в аэробных условиях при постоянном перемешивании на качалках при 12С. Накопительные культуры выращивали в течение 4 недель. Выделение чистых культур проводили чашечным методом на минеральной среде с добавлением фенантрена, растворенного в диэтиловом эфире уксусной кислоты. Видовая принадлежность изолятов изучалась по морфологическим, культуральным, физиологическим и биохимическим свойствам в соответствии с современными принципами классификации (Определитель бактерий Берги, 1997).
Деградация фенантрена бактериями. Выделенные микроорганизмы тестировали на минимальной среде, где в качестве единственного источника углерода и энергии содержался фенантрен (Kiyohara, 1982). Измерение концентрации фенантрена проводили после выдерживания проб в течение 30 суток при температуре 12С. Исходная концентрация фенантрена составляла 4 мкг/л. Контролем служил стерильный раствор фенантрена. Содержание фенантрена определяли ВЭЖХ.
Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов. Были проведены эксперименты по определению способности бацилл участвовать в процессах деградации «байкальской нефти». Изоляция штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов проводили из проб воды, отобранных в месте естественного нефтепроявления в Южном Байкале. Для этого использовали минеральную питательную среду Раймонда (Raymond, 1961), которая имеет следующий состав (г/л): СаС12 - 0.01; MnS04x7H20 -0.02; FeS04x7H20 - 0.01; MgS04x7H20 - 0.2; Na2HP04 - 3; KH2P04 - 2; NH4NO3 - 2; Na2C03 - 0.1. В качестве единственного источника углерода вносили 0.1-0.3 мл дизельного топлива, а также «байкальскую нефть» (0.1%). Культивирование микроорганизмов проводили в колбах, содержащих минимальную среду и стерильную нефть, при температуре 12С в течение 30 дней. Затем из накопительных культур проводилась изоляция углеводородокисляющих микроорганизмов.
Деградация полицикических ароматических углеводородов (ПАУ). Бактерии, определенные до рода, использовались для проведения эксперимента по деградации трех ПАУ: пирена, фенантрена и флуорантена. Микроорганизмы культивировали на минеральной среде с добавлением указанных ПАУ. Водные растворы смеси ПАУ готовили добавлением к 1 л дистиллированной воды в стерильной колбе 1 мл раствора ПАУ в этиловом спирте с концентрацией по 4-5 мкг/мл каждого соединения. При приготовлении экспериментальных и контрольных растворов для модельных экспериментов в стерильную колбу объемом 100 мл стерильной пипеткой вносили 50 мл водного раствора смеси ПАУ и 50 мл минеральной среды. Культивирование проводили при температуре 12С в течении 30 дней.
Для определения массы ПАУ содержимое колб, в которых проводилась биодеградация, переносили в мерные колбы объемом 100 мл, добавляя по 2 мл я-гексана и 0.1 мл внутреннего стандарта, представляющего собой раствор флуорена в и-гексане (2.6 мкг/мл). Полученную смесь энергично встряхивали в течение 10 мин., затем выдерживали 10 мин. для полного разделения фаз. В случае неполного разделения фаз верхний органический слой собирали и центрифугировали (1500 об/мин). Для анализа отбирали аликвоту органического слоя 0.5 мл и переносили в пробирку автодозатора хроматографа.
Экстракты анализировали на хромато-масс-спектрометре «Agilent, GC System 6890, MSD 5973». Обнаружение ПАУ проводили методом селективного ионного детектирования по ионам с m/z = 166 (внутренний стандарт флуорен), 178 (фенантрен) и 202 (флуорантен и пирен). С целью обнаружения по характерным полосам поглощения в УФ-спектре возможных метаболитов ПАУ сконцентрированные экстракты анализировали методом ВЭЖХ на хроматографе «Милихром А-02».
Калибровку хромато-масс-спектрометра проводили в диапазоне концентраций ПАУ 20-270 нг/л по двум параллельным сериям, состоящим из четырех экстрактов водных растворов смеси ПАУ каждая. Калибровочные растворы ПАУ готовили соответствующим разбавлением дистиллированной водой исходного раствора с концентрацией каждого соединения от 4 до 5 мкг/л. Экстракцию и анализ ПАУ проводили аналогично экспериментам с исследуемыми и контрольными опытами. На полученных хроматограммах измеряли площади пиков для ионов с m/z 166 (флуорен, внутренний стандарт), 178 (фенантрен), 202 (флуорантен и пирен). Калибровочные графики строились по формуле:
Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий рода Bacillus
В последние десятилетия возрос интерес к микроорганизмам-деструкторам различных высокомолекулярных соединений. Загрязнение окружающей среды нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) является проблемой мирового масштаба и в настоящее время остается одной из сложных и многоплановых в экологии и охране окружающей среды. Разрабатываются различные методы очистки от нефтяных загрязнений: механические, физико-химические, биологические. В настоящее время подготавливаются микробиологические методы, основанные на использовании ферментативной активности микроорганизмов-деструкторов, использующих высокомолекулярные соединения в качестве единственного источника углерода (Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах, 2004). Микробиологическая деградация ПАУ является основным процессом, приводящим к очистке от этих соединений водоемов и почв. Катаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Bacillus. Бациллы способны полностью утилизировать или частично трансформировать такие соединения, как нафтален, салицилат, ортофталат, октан и др., наряду с псевдомонадами, артробактерами и родококками (Звягинцева, 2001; Плотникова и др. 2001; Zhuang et al., 2002).
Озеро Байкал, как известно, является крупнейшим на планете резервуаром пресной воды, внесенном в список участков мирового природного наследия ЮНЕСКО. Поэтому изучение происходящих в нем процессов, отслеживание возможных изменений и поиски их причин были и остаются в числе важнейших задач.
Изучение и выделение микроорганизмов рода Bacillus из озера Байкал, обладающих углеводородокисляющей активностью, позволит оценить роль данных бактерий в процессах очищения и поддержания чистоты байкальских вод.
Полициклические ароматические углеводороды - большая группа широко распространенных загрязнителей окружающей среды. Эти соединения обладают мутагенными и канцерогенными свойствами и представляют значительную потенциальную опасность для здоровья человека. Именно поэтому изучение биодеградации, микробного метаболизма и детоксикации этой группы химических соединений привлекло внимание большого количества ученых во многих странах (Doddamani, 2000, Kanaly, Harayma, 2000; Кошелева и др., 2000; Барышникова и др., 2001; Андреева и др., 2003). Углеводороды и аналогичные им битуминозные вещества поступают в водоемы вместе с растительными остатками, а также в виде нефтяных и других промышленных загрязнений (анионные ПАУ). Распад их в водной массе и донных отложениях возможен лишь при участии микроорганизмов (Андрусенко, 1967).
Как показывают исследования, биодеструкторами различных высокомолекулярных соединений являются бактерии рода Bacillus. Способность к биодеградации описана для многих штаммов данного рода: Bacillus naphtovorans (Zhuang et al., 2002), В. benzoevorans, В. gordonae (Slepecky and Hemphill, 1992). Полициклические ароматические углеводороды представляют большой разнообразный класс органических соединений, молекулы которых состоят из трех и более ароматических колец в различных структурных конфигурациях. Стабильность углеводородов зависит от числа ароматических колец. Например, в почве молекула фенантрена с тремя кольцами может сохраняться от 16 до 126 дней, в то время когда с пятью - от 229 до 1400 дней (Kanaly, Harayama, 2000). Нефтяные углеводороды в основном, относятся к парафиновому ряду с прямой, незамкнутой цепочкой или к нафтеновому с насыщенным водородом циклическим ядром. Анионные ПАУ, как известно, характеризуются выраженным антибактериальным действием и могут вызывать лизис клеток. Однако некоторые бактерии не только проявляют высокую устойчивость к этим веществам, но и способность разрушать и использовать их (Foster, 1986; Enkiri et al., 1995). Также известно, что ферменты, участвующие в процессах разложения высокомолекулярных веществ, защищены от температурного воздействия как низких, так и повышенных температур (7, 37 и 50С) (Master, Mohn, 1998). Так, например, большинство штаммов В. stearothermophilus, способных окислять фенол, было изолированно из мест, прогреваемых паротермальными газами (56-58С), в которых из органических соединений присутствуют фенолы и смолы (Головачева, Орешкин, 1975).
Среди основных факторов, влияющих на доступность углеводородов для бактериального окисления, необходимо выделить следующие: относительная растворимость углеводорода в среде, пригодность углеводорода к активному транспорту через клеточную оболочку, отсутствие специфического токсического действия на цитоплазму самого углеводорода или продуктов его окисления, а также наличие у микроорганизмов соответствующей системы ферментов. В работах Т.В. Коронелли (1994) показано, что активные углеводородокисляющие микроорганизмы, поглощающие углеводороды путем пассивной диффузии, растут лишь при такой концентрации субстрата в среде, при которой наступает насыщение им клеток от 0.1% и выше. Главная роль в окислении нефтепродуктов при невысоком их содержании в экосистеме, по мнению автора, принадлежит бактериям рода Pseudomonas.
Экспериментальная работа по биодеградации полициклических ароматических углеводородов, природных компонентов нефти, была проведена для культур Bacillus, выделенных из воды и донных осадков озера Байкал.
