Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Распространение, видовое разнообразие и геохимическая деятельность
микроорганизмов в месторождениях нефти 9
1.1.1. Физико-химическая характеристика месторождений нефти как среды обитания микроорганизмов 9
1.1.2. Распространение и геохимическая деятельность микроорганизмов нефтяных пластов 12
1.1.3. Метаболическое разнообразие прокариот в микробных сообществах нефтяных пластов 14
1.1.3.1. Сульфатвосстанавливающие бактерии 15
1.1.3.2. Метанобразующие бактерии 17
1.1.3.3. Анаэробные органотрофные бактерии 20
1.1.3.4. Железоредуцирующие бактерии 24
1.1.3.5. Фототрофные бактерии 25
1.1.3.7. Аэробные органотрофные и углеводородокисляющие бактерии 26
1.2. Перспективы применения микробных метаболитов в нефтяной промышленности 34
Экспериментальная часть 44
Глава 2. Объекты и методы исследования и
2.1 Характеристика нефтяных месторождений 44
2.1.1. Нефтяное месторождение Дацин 44
2.1.2. Залежь Кондиан нефтяного месторождения Даган 44
2.1.3. Залежь 302 Ромашкинского нефтяного месторождения 45
2.2. Отбор проб 45
2.3. Состав питательных сред, условия культивирования и учёта микроорганизмов 46
2.4. Микроскопические методы 48
2.5. Аналитические методы 48
2.6. Методы оценки интенсивности анаэробных микробных процессов, происходящих в нефтяных пластах 52
2.7. Молекулярно-биологические методы 53
ГЛАВА 3. Результаты исследований 55
3.3. Распространение микроорганизмов в нефтяных пластах 55
3.3.1. Микробиологическая характеристика нефтяного месторождения Дацин 55
3.3.2. Микробиологическая характеристика залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган 59
3.3.3. Микробиологическая характеристика залежи 302 Ромашкинского нефтяного месторождения 64
3.2 Физиология и филогенетическое разнообразие аэробных бактерий нефтяного месторождения Дацин 68
3.3. Физиология и филогенетическое разнообразие аэробных бактерий из залежи Кондиан 75
3.4. Описание новых термофильных углеводородокисляющие бактерий, выделенных из нефтяных пластов 83
3.4.1. Характеристики колоний и клеточная морфология 83
3.4.2. Потребности в элементах питания и физиология 84
3.4.3. Содержание Г+Ц пар в ДНК, ДНК-ДНК гомология 89
3.4.4. Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК 90
3.4.5. Состав жирных кислот и хинонов 93
3.4.6. Диагноз Geobacillus gen. nov. 98
3.4.7. Диагноз Geobacillus subterraneus sp. nov. 98
3.4.8. Диагноз Geobacillus uzenensis sp. nov. 99
3.4.9. Диагноз «Geobacillus jurassicus» sp. nov. 100
3.5. Образование нефтевытесняющих метаболитов аэробными микроорганизмами в лабораторных условиях 101
3.6. Динамика микробиологических процессов в высокотемпературном нефтяном пласте при испытании биотехнологии повышения нефтеотдачи 107
ГЛАВА 4. CLASS Обсуждение результато CLASS в 115
Выводы 123
Список литературы 124
- Физико-химическая характеристика месторождений нефти как среды обитания микроорганизмов
- Состав питательных сред, условия культивирования и учёта микроорганизмов
- Микробиологическая характеристика залежи 302 Ромашкинского нефтяного месторождения
- Образование нефтевытесняющих метаболитов аэробными микроорганизмами в лабораторных условиях
Введение к работе
Одним из интенсивно развивающихся направлений современной микробиологиии является изучение микрофлоры подземных экосистем. Интерес к микроорганизмам глубинных экосистем определяется необходимостью выяснения особенностей микробного разнообразия и установления нижней границы биосферы, а также закономерностей геохимической деятельности микроорганизмов в нижних слоях Земли для рационального управления биогенными процессами (Кузнецов и соавт., 1962; Onstott et aL, 1988; Amy, Haldeman 1997).
Уникальной группой подземных экосистем являются нефтяные месторождения, для которых важность микробиологических исследований обусловливается ключевым значением нефти для экономики. Интенсивное развитие промышленности послужило причиной возрастания потребности в нефти и нефтепродуктах, в то время как используемые в настоящее время способы добычи нефти дают возможность извлекать лишь 20-60 % нефти, содержащейся в нефтематеринских породах. Кроме того, современные возможности обнаружения новых нефтяных месторождений с высококачественной нефтью ограничены. В настоящее время активно ведутся разработки новых технологий, позволяющих увеличить добычу нефти из уже эксплуатирующихся месторождений. Одним из перспективных направлений являются микробиологические методы увеличения нефтеотдачи пластов, основанные на способности микроорганизмов образовывать в процессе жизнедеятельности различные метаболиты, способствующие вытеснению нефти из вмещающих пород (Иванов и соавт., 1982, 1985; Беляев и соавт., 1982а; Hitzman, 1982; 1991; Moses, Springham, 1982; Розанова и соавт., 1987). В этой связи представляет научный и практический интерес изучение экологии, биоразнообразия и геохимической деятельности микроорганизмов в нефтеносных горизонтах для поиска активных продуцентов нефтевытесняющих соединений, а также возможной регуляции микробной активности в пласте с целью получения нефтевытесняющего эффекта in-situ (Иванов, Беляев, 1989; Беляев и соавт., 1993; 1998; Назина, 2000; Ибатуллин и соавт., 2003).
Нефтяные пласты, как правило, характеризуются бескислородными условиями, поэтому основное внимание исследователей привлекали анаэробные микроорганизмы. Из нефтяных пластов были выделены анаэробные органотрофные бактерии, сульфат-, серо-, железо-, марганец- восстанавливающие микроорганизмы, метаногены (Розанова, Кузнецов, 1974; Belyaev et al., 1983; Давыдова-Чарахчьян и соавт., 1992а,б.; Stetter et al.,
1993; Назина и соавт., 1995; Nazina et al., 1995; Ravot et al., 1995; Nilsen, Torsvik, 1996; Greene et al., 1997; Борзенков и соавт., 1997; Lien et al., 1998; Slobodkin et al., 1999; Назина, 2000; Magot et al., 2000; Orphan et al., 2(XX); Takahata et al., 2001; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003).
Аэробные органотрофные бактерии нефтяных пластов изучены относительно слабо. Тем не менее, аэробные микроорганизмы также обитают в нефтяных пластах, куда они, как правило, проникают с нагнетаемой водой, буровым раствором и в результате естественных гидродинамических потоков. Нагнетаемые воды часто содержат растворенный кислород, и в призабойной части пласта создается аэробная или микроаэробная зона, где возможно развитие этой группы бактерий. В нефтяных месторождениях, эксплуатирующихся с использованием заводнения, аэробные органотрофные микроорганизмы, в том числе нефтеокисляющие бактерии, являются начальным звеном аэробно-анаэробной микробной трофической цепи, осуществляющей биологическую трансформацию нефти (Иванов и соавт., 1982; Беляев и соавт., 1982а; Розанова, Назина, 1982; Розанова, 1991; Милехина и соавт., 1991; Назина, 2000).
Развитие в нефтяных горизонтах аэробно-анаэробного бактериального сообщества может приводить как к отрицательным, так и положительным последствиям. К нежелательным явлениям, возникающим в результате жизнедеятельности микрофлоры в нефтяных пластах, можно отнести увеличение вязкости нефти вследствие потребления легких углеводородов, снижение проницаемости вмещающих пород, коррозию металлического оборудования. Позитивными результатами, сопровождающими функционирование микробных сообществ в нефтяных месторождениях, являются образование в процессе бактериальной жизнедеятельности различных нефтевыгесняющих соединений (СОг, органические кислоты, спирты, поверхностно-активные вещества, биополимеры и другие), которые являясь обычными продуктами метаболизма бактерий, способствуют нефтеотдаче пластов. Наиболее активными из известных микроорганизмов — продуцентов нефтевытесняющих метаболитов являются аэробные органотрофные, в частности, нефтеокисляющие, бактерии (Atlas, 1981; Rosenberg, 1989; Van Hamme et al., 2003). Введение микроорганизмов в нефтеносные горизонты с последующим размножением их и образованием нефтевыгесняющих соединений или активация пластовых нефтеокисляющих бактерий может приводить к доизвлечению нефти (Иванов и соавт., 1985, 1994; Беляев и соавт., 1993, 1998; Назина и соавт., 19896; Ибатуллин и соавт., 2003).
Таким образом, весьма актуальным является изучение закономерностей распространения и биоразнообразия аэробных органотрофных, в том числе нефте- и углеводородокисляющих бактерий и их роли в трансформации органического вещества нефти.
Целью настоящей работы было изучение экологии, физиологии и биологического разнообразия аэробных органотрофных микроорганизмов в нефтяных пластах, их отношения к органическому веществу нефти, а также определение их филогенетического положения и места в трофической системе подземного микробного сообщества.
Для достижения этой цели следовало решить следующие задачи:
Изучить распространение и численность. аэробных органотрофных микроорганизмов в месторождениях нефти с различными физико-химическими условиями и типом вмещающих пород.
Выделить доминирующих представителей аэробных органотрофных микроорганизмов, изучить их биологические особенности, способствующие распространению и деятельности в нефтяных пластах.
Определить таксономическое и филогенетическое положение выделенных подземных изолятов с использованием методов полифазной таксономии.
Выяснить возможность образования нефтевытесняющих метаболитов (поверхностно-активные вещества и экзополисахариды) аэробными бактериями из нефтяных пластов.
Изучить влияние биотехнологического воздействия, основанного на введении аэрированной воды и солей азота и фосфора, на микробные процессы, протекающие в высокотемпературном нефтяном пласте.
Научная новизна работы. Впервые с использованием современных методов полифазной таксономии изучен видовой состав аэробных органотрофных микроорганизмов нефтяных месторождений с разными физико-химическими условиями. Выделены и достоверно идентифицированы бактерии родов Clavibacter, Gordonia, Brevihacillus, Cellulomonas, Oceanohacillus, Thermoactinomices представители которых ранее в нефтяных пластах не обнаруживались. Выделены и охарактеризованы фенотипически и филогенетически термофильные углеводородокисляющие спорообразующие бактерии, относящиеся к новым видам: Geohacillus subterraneus sp. nov., Geohacillus uzenensis sp. nov. и "Geohacillus jurassicus" sp. nov.. Полученные результаты расширяют представления о таксономическом и физиологическом
разнообразии аэробных микроорганизмов в подземных экосистемах. Впервые изучено влияние биотехнологического воздействия, основанного на введении кислорода воздуха и минеральных солей азота и фосфора, на микробные процессы и образование нефтевытесняющих метаболитов в высокотемпературном нефтяном пласте.
Практическая значимость работы состоит в выделении и создании коллекции мезофильных и термофильных углеводородокисляющих бактерий - продуцентов био-ПАВ и экзополисахаридов, которые могут применяться в биотехнологиях повышения нефтеотдачи и очистки различных экосистем от нефтяных загрязнений. Результаты диссертационной работы обосновывают возможность применения биотехнологии увеличения нефтедобычи, основанной на внесении кислорода воздуха и минеральных солей азота и фосфора с целью активации пластовой микрофлоры в заводняемом нефтяном пласте, на высокотемпературном нефтяном месторождении. В ходе подготовки диссертационной работы указанная биотехнология была впервые применена на высокотемпературной залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган (КНР).
Полученные в работе результаты расширяют представления о таксономическом и физиолого-биохимическом разнообразии бактерий в нефтяных пластах, и их функциональной роли в подземных экосистемах. Результаты могут быть использованы при составлении определителей бактерий, а также для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях.
Апробация работы. Материалы диссертации работы были представлены на 5-й Международной конференции молодых учёных, аспирантов и студентов по фундаментальным наукам «Ломоносов 99» (Москва, 1999), Школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино-на-Оке, 2000), на Международном семинаре-презентации инновационных проектов «Биотехнологии 2001» (Пущино-на-Оке, 2001), на 4-м и 5-м Международных симпозиумах по микробиологии подземных экосистем (США, 1999; Дания, 2002), на 2-ом Международном конгрессе «Биотехнологии-2003» (Москва, 2003).
Публикации- По теме диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, включая 6 тезисов докладов, одна статья принята в печать.
Место проведения работы. Основная часть работы проводилась в Институте микробиологии РАН в лаборатории нефтяной микробиологии под руководством профессора С.С. Беляева и д.б.н. Т.Н. Назиной. В отдельных этапах работы принимали участие И.А. Борзенков, А.Е. Иванова, B.C. Ивойлов, Т.Л. Бабич, Л.Е. Дулов, Г.В.
Федотова, Д.Ш. Соколова, Н.М. Шестакова, М.А. Гавура, Е.М. Михайлова, В.В. Петруняка. В полевых исследованиях на нефтяных месторождениях участвовали А.Н. Буторин (ИБВВ РАН), Сюэ Янфен и Ванг Сиуян (ИНМИ КАН, КНР); Ни Фангтиан и Фенг Кшинфенг (Даганская нефтяная компания, КНР). Электронно-микроскопические исследования проводили в ИНМИ РАН совместно с Л.Л. Митюшиной; геносистематические - с Т.П. Туровой, A.M. Лысенко (ИНМИ РАН) и А.Б. Полтараусом (ИМБ РАН); хемотаксономические — с Г.А. Осиповым (РАМН), В.М. Аданиным (ИБФМ), реологические - с Сюэ Янфен (ИНМИ КАН, КНР) и Фенгом Кшинфенгом (Даганская нефтяная компания, КНР).
Автор выражает глубокую признательность научным руководителям д.б.н. Т.Н. Назиной и профессору, д.б.н. С.С. Беляеву, за постоянное внимание, полезные советы и помощь при обсуждении результатов. Автор приносит благодарность всем упомянутым участникам работы, а также коллегам и друзьям за содействие и поддержку.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства промышленности и науки РФ, государственный контракт № 43.073.1.1.2515, по теме «Биогеотехнология добычи и переработки полезных ископаемых» в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники», раздел «Технология живых систем»; а также в рамках Международного проекта «Микрофлора нефтяных месторождений и её биотехнологический потенциал»; Российско-китайского контракта с Джинханским нефтяным университетом, проекта РФФИ «Ведущие научные школы», грантов РФФИ № 98-04-48682; 01-04-49250, MAC 02-04-06060; 02-04-39002; гранта CRDF RBO-1364-MO-02.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста и включают 8 рисунков и 33 таблицы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть» (включающая главы «Объекты и методы исследования», «Результаты исследования» и «Обсуждение результатов»), «Выводы» и «Список литературы», который содержит 142 отечественных и 233 зарубежных наименований.
Физико-химическая характеристика месторождений нефти как среды обитания микроорганизмов
Первые свидетельства обитания микроорганизмов в глубинных нефтяных водах появились в 1901 г., когда инженер В. Шейко (Шейко, 1901) обнаружил клетки бактерий во фракциях нефти на Бакинских нефтяных приисках. Этому факту не было придано значение, так как большинство учёных в то время считало нефть антисептическим веществом. Но уже в 1926 г. были опубликованы результаты микробиологических исследований, демонстрирующих широкое распространение сульфатредуцирующих бактерий в пластовых водах нефтяных месторождений (Гинзбург-Карагичева, 1926; 1932; Bastin, 1926а, б). Прямые доказательства наличия бактерий в глубинных водах и породах были получены Андреевским (1959, 1961) на Ярегском нефтяном месторождении (Республика Коми), где нефть добывалась шахтным способом. Специфика шахтной добычи нефти позволяет асептически отбирать пробы воды, нефти и породы из пласта сразу после опалки породы, т.е. в условиях, практически исключающих попадание с буровым раствором контаминантной микрофлоры.
В последующем в нефтяных месторождениях были обнаружены бактерии, относящиеся к различным физиологическим группам, в том числе органотрофные бактерии с бродильным типом метаболизма, сульфат-, серо-, железоредуцирующие, ацетогенные, пурпурные, метаногены; а также аэробные микроорганизмы, окисляющие метан и длинноцепочечные парафины, аэробные органотрофные бактерии, тионовые бактерии.
Способность микроорганизмов не только выживать, но и активно развиваться в подземных экосистемах, содержащих нефтяное органическое вещество, бьша замечена давно. Разнообразную бактериальную флору обнаруживали в образцах с явными признаками нефтеносности (особенно доломиты и песчаники), где общая численность микроорганизмов составляла 12-117x106 клеток в одном грамме сухой породы (Экзерцев, 1951). В тоже время, осадочные породы, не связанные с нефтеносностью, имеют чрезвычайно бедное бактериальное население. Содержание бактерий в кернах нефтенасыщенных пород, как правило, на несколько порядков больше, чем в нефти и пластовой воде того же горизонта (Штурм, 1950,1958; Кузнецов, 1950; Розанова, 1991).
Обязательным условием для развития микроорганизмов в нефтяных пластах является наличие водной фазы с растворенными в ней солями. В литературе неоднократно отмечался факт наибольшего разнообразия микрофлоры в пробах пластовой воды и обводненной нефти по сравнению с безводными нефтями (Кузнецова, Ли, 1964; Розанова, Кузнецов, 1974; Розанова, 1991). Наиболее активное развитие бактерий протекает на контакте нефть-вода, при этом концентрирование тех или иных видов бактерий происходит на поверхности твёрдых субстратов, на которых образуется пленка жидкости, обладающая высоким поверхностным натяжением, в результате бактерии не могут оторваться от твёрдого субстрата (Бирштехер, 1957; Милехина и соавт., 1998; Wyndham, Costenon, 1981; Lappin-Scott, Costerton, 1990).
Жизнедеятельность бактерий в нефтяных пластах зависит также от минерализации и кислотности нефтяных флюидов. Степень минерализации пластовых вод может различаться от пресных вод до рассолов; значения рН in-situ обычно находятся в пределах от 3 до 8.5. Общая численность микроорганизмов в пластах с жёсткими и гидрокарбонатно-натриевыми водами, как правило, невелика и не превышает десятков тысяч клеток в 1 мл воды (Розанова, 1971). Существенно, что в месторождениях, характеризующихся высокой минерализацией пластовых жидкостей, развитие микробного сообщества определяется соотношением двухвалентных и одновалентных катионов в пластовой воде (Кузнецова, 1963; Кузнецова, Швец, 1970). В частности показано, что рассолы, общая минерализация которых превышает 250 г/л, офаничивают распространение аэробных органотрофных бактерий в результате действия высокого содержания ионов кальция (Бердичевская, 1989). Углеводородокисляющие бактерии были выделены из пластовых жидкостей, минерализация которых превосходила 300 г/л (Бердичевская, 19826; Куличевская и соавт., 1991; Милехина и соавт., 1991).
Транспорт микроорганизмов в толще породы нефтяного месторождения во многом зависит от проницаемости вмещающего коллектора, которая должна быть не менее 75 mD (Updegraff, 1983), т.е. диаметр пор должен быть, по крайней мере, в два раза больше диаметра клеток бактерий. Давление в нефтяных пластах, которое может достигать 500 атм., не исключает развитие микроорганизмов in-situ, однако может влиять на физиологические свойства и метаболизм бактерий (Magot et al., 2000).
Одной из характеристик окружающей среды, определяющей развитие микрофлоры в нефтяном пласте, является температура. Так, при использовании культуральных, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов бактериальная активность была выявлена в заводняемых нефтяных месторождениях с температурой 60-80С (Philippi, 1977; Fisher, 1987; Беляев и соавт., 1990а; Barth, 1991; Adkins et al., 1992; Bernard et al., 1992; Belyaev, Borzenkov, 1993; Stetter et al., 1993b; Grassia et al., 1996; Nazina et al., 1995; Розанова и соавт., 2001; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003; Orphan et al, 2000). Благоприятные условия для развития микробных сообществ в высокотемпературных пластах создаются в призабойных зонах нагнетательных скважин, где происходит смешение поверхностных холодных вод и горячих пластовых жидкостей (Назина и соавт., 1992; Nazina et al., 1995; Розанова и соавт., 1997; Назина, 2000). Численность микроорганизмов в пластовых водах высокотемпературных нефтяных пластов ниже по сравнению с низкотемпературными месторождениями (Беляев и соавт., 1990а; Назина и соавт., 1992; Nazina et al., 1995).
Микробные сообщества нефтяных пластов существуют в обстановке затрудненного водообмена с исключительно медленным массообменом, при постоянной температуре, они не зависят от современной атмосферы и солнечного света и могут рассматриваться как закрытые или полузакрытые системы. Основным источником органического вещества для микроорганизмов в нефтяных пластах служит сама нефть. Сырые нефти качественно состоят из углеводородов и гетероциклических соединений, содержащих кислород, серу, азот и микроэлементы. В составе нефтяных газов преобладают углеводороды метанового ряда, СОг, N2; реже встречается Нг; в пластах с сульфатсодержащими водами присутствует H2S (Добрянский, 1961; Сает и соавт., 1990). Молекулярный и аммонийный азот находятся в количествах достаточных, чтобы удовлетворить потребность микрофлоры в азоте, тогда как содержание фосфора невелико и лимитирует биогенные процессы в этой экосистеме (Davis, 1967; Розанова, Кузнецов, 1974; Иванов и соавт., 1982; Tanner et al., 1991; Adkins et al., 1992).
В условиях нефтяных пластов, характеризующихся преимущественно низким окислительно-восстановительным потенциалом среды, первостепенное значение приобретают анаэробные процессы деструкции органического вещества нефти. Возможными акцепторами электронов в пластах могут быть углекислота, сульфат и другие окисленные соединения серы, гидроокислы железа. Так, присутствие даже следовых количеств сульфатов в воде способствует распространению и развитию сульфатвосстанавливающих бактерий (Розанова, Кузнецов, 1974; Назина и соавт., 1995; Onstott et al., 1998). Нитрат и другие оксиды азота, как правило, отсутствуют в пластовых водах. Потенциальными донорами электронов могут служить водород, а также органические кислоты. Концентрация органических кислот может превышать 20 mM (Barth, 1991; Barth, Riis, 1992; Розанова и соавт., 1993; Belyaev, Borzenkov, 1993). Чаще всего в нефтяных флюидах содержится ацетат, пропионат, бутират, формиат и бензоат. Концентрация более сложных "нафтеновых" кислот может достигать 100 mM. Кроме того, возможными источниками электронов для анаэробного метаболизма могут служить разнообразные углеводороды и гетероциклические соединения, входящие в состав нефти (Magot et al., 2000; Widdel, Rabus, 2001;Van Hamme et al., 2003).
Состав питательных сред, условия культивирования и учёта микроорганизмов
Численность бактерий различных физиологических групп в пластовых водах определяли путем посева проб пластовой воды в жидкие питательные среды методом десятикратных разведений в двух повторностях. Результаты оценивали методом наиболее вероятного числа (Koch, 1994).
Аэробные микроорганизмы. Аэробные бактерии культивировали в пробирках Хангейта или пенициллиновых флаконах с воздушной газовой фазой. Среды инокулировали пробами пластовой воды, используя шприцы. Численность углеводородокисляющих бактерий оценивали в модифицированной среде Раймонда с н-гексадеканом (4 об. %) (Nazina et al., 1985). Аэробных гетеротрофов определяли в среде (TYEG): содержащей (г/л): бакто-триптон (Difco) - 5.0, дрожжевой экстракт (Difco) - 2.5, глюкозу (Merck) - 1.0, рН 7.0-7.2, В среду вносили микроэлементы по рецепту Пфенига и Липперта (Pfennig, Lippert, 1966).
Чистые культуры аэробных бактерий получали путем последовательных пересевов накопительных культур со среды с гексадеканом на плотные питательные среды - Plate Count Agar (Difco), питательный агар (Nutrient agar, Merck), кровяной агар (Blood agar, Merck), картофельный агар и агаризованную модифицированную минеральную среду Раймонда со смесью парафинов (С12-С22, Ю мл/л среды). Посевы инкубировали аэробно при температуре нефтяного пласта в течение 3-14 суток до образования отдельных колоний. Все различающиеся по цвету, форме, консистенции и размерам колонии были отобраны для дальнейших исследований.
Для культивирования, изучения биохимических и физиологических характеристик, а также для подержания углеводородокисляющих бактерий использовали модифицированные среды Розенберга (г/л): NaCl - 10.0, MgSCU - 0.5, NH4NO3 - 1.0, FeCI3 - 0.025, КН2РО4 - 0.3, К2НРО4 - 0.7, рН 7.0-7.2 (Rosenberg et al., 1989; Rosenberg, 1992) и Адкинса (г/л): К2НР04 - 1.5, КН2Р04 - 0.75, NH4C1 - 1.0, СаС12 -0.02, СаСОз - 0.2, NaCl - 0.8, MgS04- 0.25, KCl - 0.01, рН 6.8-7.2 (Atkins et al, 1992). В среды вносили микроэлементы по рецепту (Pfennig, Lippert, 1966). Морфологию и физиолого-биохимические признаки бактерий исследовали традиционными методами (Герхардт, 1984; The Prokaryotes..., 1989).
Для определения таксономического положения и физиологических особенностей, выделенных нами термофильных аэробных углеводородокисляющих спорообразующих бактерий, в работе также исследовали различные диагностические признаки штаммов валидных видов Bacillus, а также штаммов, выделенных ранее сотрудниками лаборатории нефтяной микробиологии ИНМИ РАН из различных высокотемпературных нефтяных месторождений.
Образование нефтевытесняющих соединений аэробными бактериями изучали в среде следующего состава (г/л): NaN03 - 2,0; MgS04 - 0,25; КН2Р04 - 1,0; СаС12 - 0,01; дрожжевой экстракт - 1,0. Источниками углерода служили (г/л): сахароза - 40; глюкоза -10; натрия ацетат - 5.0; натрия пропионат — 5,0; натрия бутират — 5,0; смесь парафинов (С12-С22) - 1-6 об. %; н-гексадекан - 1-6 об. %, микроэлементы по рецепту (Pfennig, Lippert, 1966). Посевы инкубировали на качалке (150 об ./мин) или стационарно при температуре, соответствующей температурному режиму нефтяного пласта.
Анаэробные бактерии. Анаэробную технику Хангейта (Hungate, 1969) использовали для приготовления сред для анаэробных бактерий. Все среды инокулировали пробами пластовой воды, используя шприцы. Анаэробные бактерии культивировали, используя в качестве газовой фазы очищенный от кислорода аргон; за исключением среды для метаногенов, где использовали смесь Н2+СО2.
Численность анаэробных бактерий с бродильным типом метаболизма оценивали, измеряя прирост Нг в среде с бакто-пептоном (4 г/л) и глюкозой (10 г/л) (Postgate, 1984). Сульфатредуцирующие бактерии анализировали по увеличению H2S в среде В (Postgate, 1984) с лактатом натрия (4 г/л), восстановленной Na2Sx9H20 (0.2 г/л). Метаногенов учитывали по увеличению содержания СЩ в среде (Zeikus et al., 1975) с ацетатом (2.2 г/л) или Н2+СО2, дополненной микроэлементами (Wolin et al., 1963) и дрожжевым экстрактом (1 г/л). В среду с Н2+СО2 (4:1), вносили также ацетат (1.36 г/л), формиат (0.68 г/л), и метанол (0.3 мл/л) в соответствии с рекомендациями (Tanner, Wolfe, 1988).
Все посевы инкубировали при температуре нефтяного пласта до установления роста культур, около 30 суток. Часть проб из призабойных зон нагнетательных скважин высокотемпературных месторождений обследовали на присутствие термофильных и мезофильных аэробных бактерий, образцы с этими пробами инкубировали при 60 и 30 С. Все посевы были исследованы в световом микроскопе с фазово-контрастным устройством. 2.4. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Морфологию бактерий изучали с помощью светового микроскопа Jenaval (Carl , Zeiss, Германия), снабженного фазово-контрастным устройством, при увеличении 100x10. Размеры клеток определяли в экспоненциальной фазе роста культуры с помощью окулярного винтового микрометра.
Электронно-микроскопические методы. Для исследования ультратонкого строения клеток биомассу бактерий собирали центрифугированием при 5000 об./мин в течение 20 мин и фиксировали по методу Ритер-Келленбергера (Ryter, Kellenberger, 1958) 1%-м раствором, осмиевой кислоты в ацетат-вероналовом буфере (рН 6.2) в течение 12 часов. Затем клетки заключали в агар и дофиксировали в течение 2 часов при комнатной температуре 0.5% раствором уранил-ацетата, приготовленным в буфере того же состава.
Агаровые блоки с клетками подвергали обезвоживанию растворами этанола с возрастающей концентрацией, ацетоном, и заключали в смесь эпоксидных смол. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-4800. После дополнительного контрастирования цитратом свинца по Рейнольду (Reynolds, 1963), препараты были исследованы в электронном микроскопе JEM-100 С (JEOL, Япония) со съёмкой на фотопластины при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 20-30 тыс.
Определение биомассы. Прирост биомассы в жидкой среде оценивали по величине оптической плотности, которую измеряли на приборе ФЭК-56М, а также фотометре КФК-4, в кюветах толщиной 0,5 см при длине волны 590 нм. В качестве контроля использовали инокулированную среду без источника углерода.
Определение белка. Содержание белка в микробной биомассе определяли колориметрическим методом Лоури (Lowry et al., 1951), а также используя кит-набор (Protein assay kit, Sigma diagnostics, США).
Определение редуцирующих Сахаров. Редуцирующие сахара определяли колориметрическим методом (Dubois et al., 1956).
Определение метана. Метан в составе газовой фазы накопительных культур метаногенов измеряли на хроматографе М3700 с пламенно-ионизационным детектором на колонке размером 1.5 м х 0.3 см, заполненной Sovpol В. Температура инжектора была 100 С, температура испарителя - 130 С, температура детектора - 140 С. Аргон служил в качестве газа-носителя, его подавали со скоростью 140 мл/мин.
Определение водорода. Водород в составе газовой фазы накопительных культур бактерий с бродильным типом метаболизма определяли на хроматографе М3700, снабженном детектором по теплопроводности на колонке размером 3.0 м х 0.2 см, заполненной молекулярным ситом 5А. Температура колонки была 40 С, температура испарителя - 70 С, температура детектора - 90 С. Аргон служил в качестве газа-носителя, который подавали со скоростью 100 мл/мин.
Определение сероводорода. Сероводород определяли колориметрически по методу Пахмайра с Ы -диметил-р-фенилендиамином в модификации Трюпера и Шлегеля (Triiper, Schlegel, 1964).
Микробиологическая характеристика залежи 302 Ромашкинского нефтяного месторождения
Залежь 302 башкирских отложений среднего карбона Ромашкинского нефтяного месторождения эксплуатируется с 1975 г. С целью поддержания пластового давления в 1981 г. было начато нагнетание речной воды.
Исследованный участок был представлен двумя элементами, каждый из которых содержал в центре одну нагнетательную скважину, окруженную 4-6-ю добывающими скважинами. Нагнетательная скважина 26421 была гидродинамически связана с добывающими скважинами 26416, 26417, 26422, 26426, 26420, 26509, а нагнетательная скважина 36276 - со скважинами 26435,35851,37950,36275.
Пластовые воды залежи 302 относились к хлоркальциевому и хлормагниевому типу, имели минерализацию 40-50 г/л, Eh от -215 до - 395 мВ, рН от 6.6 до 7.4. Залежь представляла собой экосистему, пластовые воды которой содержали высокие концентрации сероводорода, достигающие 140-190 мг/л. Температура пласта варьировала в пределах 17-23 С (Табл. 14).
С нагнетаемой водой в пласт поступали растворенный кислород (2-4 мг/л), аэробные органотрофные (10-Ю2 кл/мл), анаэробные бродильные (10 кл/мл) и сульфатвосстанавливающие бактерии (десятки кл/мл).
Призабойная зона нагнетательной скважины 26421 характеризовалась максимальной численностью аэробных углеводородокисляющих и анаэробных бродильных и сульфатредуцирующих бактерий (Табл. 15). Численность метаногенов в призабойной зоне не превышала десятков кл/мл.
В зоне добывающих скважин из-за восстановленной обстановки популяция аэробных углеводородокисляющих бактерий была мала (десятки кл/мл). В составе микробного сообщества доминировали анаэробные бродильные ( 10 кл/мл) и сульфатвосстанавливающие бактерии ( 10 кл/мл) (Табл. 15). Метаногены также обнаруживались в пластовой воде, где их численность не превосходила 10" кл/мл.
Высокое содержание сульфатов и сульфатредуцирующих бактерий обусловили доминирование процесса сульфатредукции в нефтяном пласте, скорость которого в пробах из призабойной зоны нагнетательной скважины 26421 достигала 114,4 мкг S2" л"1 сут . Скорости образования метана из бикарбоната и ацетата не превышали 17.5 и 0.74 мкг СН4 л 1 сут"1 соответственно (Табл. 14).
Представленные в настоящем разделе результаты свидетельствуют о том, что геохимически активные микробные сообщества были обнаружены в нефтяных пластах Дацина, Дагана и залежи 302 Ромашкинского нефтяного месторождения, различающихся по физико-химическим условиям, составу пластовой воды и нефти и типу вмещающих пород. Микроорганизмы относились к физиологическим группам аэробных органотрофных, в том числе углеводородокисляющих, бактерий и анаэробных бродильных и сульфатвосстанавливающих бактерий, а также метаногенов.
Все исследованные горизонты разрабатывались с применением нагнетания в пласт сборных нефтепромысловых вод. Вместе с нагнетаемой водой в пласт попадали разнообразные аэробные и анаэробные микроорганизмы, способные потреблять углеводороды нефти и продукты их окисления.
Наибольшая численность микроорганизмов, а также максимальная интенсивность бактериальных процессов, были отмечена в призабойной зоне нагнетательных скважин. Вследствие того, что с поверхностными водами в пласты поступал растворенный кислород, в зоне, локализованной вблизи нагнетательных скважин, доля аэробных микроорганизмов, в том числе углеводородокисляющих бактерий, была выше, чем в зоне добывающих скважин. В связи с бескислородными условиями в области добывающих скважин доминировали анаэробные бактерии.
Благоприятные условия для развития активного аэробного микробного сообщества сложились в пресных пластовых водах Дацина, характеризующихся низким содержанием сульфатов и сероводорода, а также температурой порядка 40-46 С.
Внутрипластовая температура около 60 С явилась причиной невысокой численности аэробных бактерий в пластовых водах залежи Кондиан. Нагнетание в высокотемпературный горизонт охлаждённых нефтепромысловых вод привело к появлению в призабойной зоне Кондиана как термофильного, так и мезофильного микробных сообществ. В пластовых водах Дацина и Кондиан, для которых вмещающими породами являлись песчаники и алевриты при низких концентрациях сульфата, основным терминальным процессом биотрансформации нефти являлся метаногенез.
Для карбонатного коллектора залежи 302 умеренная минерализация (40-50 г/л) пластовых вод не препятствовала развитию микробного сообщества. Низкая активность аэробной микрофлоры была связана с восстановленными условиями в пласте и высокими концентрациями сероводорода в пластовых водах. Доминирующими бактериями были бродильные и сульфатредуцирующие бактерии. Высокое содержание сульфата в пластовых водах обусловило преобладание сульфатредукции в терминальных процессах преобразования органического вещества в залежи 302.
Образование нефтевытесняющих метаболитов аэробными микроорганизмами в лабораторных условиях
В работе изучали способность аэробных органотрофных бактерий из нефтяного месторождения Дацин и залежи Кондиан образовывать нефтевытесняющие метаболиты, такие как поверхностно-активные вещества и экзополисахариды.
При исследовании штаммов из месторождения Дацин показано, что даже в неоптимальпых условиях на простых питательных средах ряд бактериальных культур проявлял высокую эмульгирующую активность и продуцировал ПАВ и экзополисахариды. В средах с н-алканами наибольшая эмульгирующая активность отмечена для бактерий R. ruber (штаммы 41, 33, 14Н), В. licheniformis шт. 421, Kocuria erythroniyxu шт. 32Ґ к Dieizia sp. шт. 263. Образование ПАВ зависело от источника углерода и биологических свойств микроорганизмов (табл. 26 и 27). Например, штамм 263 одинаково эффективно продуцировал ПАВ на сахарах, летучих кислотах и ряде индивидуальных углеводородов, для штамма 32f предпочтительнее были среды с глюкозой и н-додеканом; штаммы Л ruber (41, 33, 14Н) характеризовались еще большей специфичностью в отношении субстратов.
Поверхностно-активные метаболиты образовывали представители родов Bacillus, Rhodococcus, Dietzia, Gordonia, Pseudomonas, Acinetobacter. Отдельные штаммы снижали поверхностное натяжение культуральных сред на границе с воздухом с 55-63 до 28-40 мН/м (Табл. 26 и 27). Среди исследованных культур наиболее эффективные биоэмульгаторы синтезировали В. licheniformis, Gordonia sp., Cellulomonas cellulans и R. ruber; культуральные среды которых, разведенные в 100 и 1000 раз, характеризовались низкой величиной межфазного натяжения на границе с деканом (20-37 мН/м).
Бактерии В. licheniformis часто используют в модельных и полевых экспериментах по разработке биотехнологий повышения нефтеотдачи. Исследованный штамм В. licheniformis 421, способный расти в широком интервале температур, при 55 С изменял реологические свойства культуральных сред в меньшей степени, чем в мезофильных условиях. Так при инкубировании бактерий В. licheniformis штамма 421 при 55 С в среде с сахарозой поверхностное натяжение снижалось с 49.1 до 40.1 мН/м.
Рост нескольких штаммов на жидких парафинах сопровождался заметным повышением вязкости среды и увеличением содержания экзополисахаридов, определяемых по приросту Сахаров в среде (Табл. 26 и 27). Наибольшая вязкость была отмечена при росте штаммов R. rubber в средах с сахарозой и бутиратом, но она была ниже таковой промышленных штаммов рода Xanthomonas — известных продуцентов экзогликанов (Finnerty, Singler, 1984).
Кроме того, для сравнения мы исследовали образование нефтевытесняющих метаболитов термофильными бактериями "Geobacillus jurassicus" DS1T и G. thermoglucosidasius 3 Feng, выделенными из пластовых вод Дагана, а также подземных изолятов из других месторождений: G. uzenensis UT, G. subterraneus 34т и G. subterraneus Sam (Табл. 28). Также, мы изучали воздействие термофильного микробного сообщества, обитающего в призабойной зоне скважины 1098, на реологические свойства среды (вязкость и межфазное натяжение). Среды, содержащие различные органические субстраты, инокулировали пластовой водой (10 % об.), полученной при изливе 25 м жидкости из нагнетательной скважины 1098. Посевы инкубировали в аэробных условиях в течение 5 суток при 55 С на качалке (150 об./мин).
Обнаружено, что микробное сообщество из призабойной зоны, а также отдельные исследованные штаммы бактерий изменяли поверхностные свойства культуральных сред. Штамм DS1 образовывал поверхностно-активные метаболиты в средах с сахарозой, ацетатом, бутиратом, жидкими парафинами и сырой нефтью. Наименьшее значение межфазного натяжения (12 мН/м) штамм DS1 демонстрировал в средах с сырой нефтью залежи Кондиан, из которой он был выделен. Характерно, что термофильное бактериальное сообщество из призабойной зоны также снижало поверхностное и межфазное натяжение в среде с нефтью месторождения Даган. (Табл. 28). Штамм DS 1т и микробное сообщество призабойной зоны залежи Кондиан изменяли реологические свойства сред даже в большей степени, чем штамм Bacillus licheniformis 421 при 55 С.
Штаммы G. subterraneus 34т и Sam, G. uzenensis UT при росте в средах с нефтью или парафинами снижали поверхностное натяжение культуральных сред с 56 до 40-50 мН/м и межфазное натяжение на границе с гексадеканом -с 17 до 12-15 мН/м (Табл. 28).
Вязкость исследуемых жидкостей варьировала незначительно и была в пределах 0,60-0,74 мПА с. Наибольшая вязкость была отмечена для культуральных сред штамма G. thermoglucosidasius 3Feng, хотя межфазное и поверхностное натяжение в средах не снижалось. Высокие значения эмульгирующей активности, по всей видимости, были вызваны эмульгаторами, связанными с клеточной стенкой.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в пластовых водах месторождений Дацин и залежи Кондиан обитают различные аэробные микроорганизмы, способные образовывать нефтевытесняющие метаболиты, такие как поверхностно-активные вещества и экзополисахариды. Исследованные штаммы продуцировали биосурфактанты из широкого ряда индивидуальных субстратов и нефти, что представляется важным в условиях нефтяного пласта, где источником органического вещества служит нефть, являющаяся многокомпонентным соединением.
Некоторые углеводородокисляющие микроорганизмы продуцировали экзогликаны, незначительно повышающие вязкость среды. Немаловажно, что некоторые аэробные бактерии из нефтяных пластов (например, штаммы R. ruber) образовывали из нефти не только эффективные поверхностно-активные вещества, но и экзополисахариды. Эта способность аэробной микрофлоры нефтяных пластов может найти применение в нефтедобывающей промышленности для повышения вязкости нагнетаемых и пластовых вод, изменения гидродинамических потоков и охвата залежи заводнением.
