Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Деградация гербицидов, используемых для борьбы с сорняками на полях риса 9
1. Краткая характеристика свойств гербицидов 9
2. Микробное окисление феноксиуксусных кислот 14
3. Деградация пропанида 24
4. Разложение тиокарбаматных гербицидов 33
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования
1. Объекты исследования 42
2. Методы исследования 42
ГЛАВА III. Деградация ордрама и сатурна в почве; влияние ордрама на микрофлору почв рисовых полей Кзыл- Ординской области и Ніжного Прибалхашья 52
ГЛАВА ІV. Микроорганизмы и их способность превращать ордрам и сатурн 56
1. Способность микроорганизмов использовать гербициды в качестве единственного источника углерода 56
2. Трансформация ордрама и сатурна микрофлорой почв рисовых полей 57
3. Кометаболизм тиокарбаматных гербицидов 58
3.1. Взаимосвязь процесса деградации ордрама и сатурна микроорганизмами с превращением косубстратов 58
3.2. Влияние природы, косубстратов на деградацию ордрама 63
3.3. Особенности кометаболизма ордрама в зависимости от таксономического положения культур 68
ГЛАВА V . Изучение путей превращения гербицидов микро организмами 68
1. Деградация ордрама 68
2. Деградация сатурна 80
ГЛАВА VІ. Условия микробной деградации ордрама 88
1. Влияние аэрации^на скорость и характер разложения ордрама 88
2. Зависимость деградации ордрама от температуры, концентрации солей и сорбции 91
Обсуждение результатов 94
Выводы 98
Литература 100
Приложения 121
- Краткая характеристика свойств гербицидов
- Объекты исследования
- Способность микроорганизмов использовать гербициды в качестве единственного источника углерода
- Деградация ордрама
Введение к работе
Одной из наиболее актуальных проблем современного сельского хозйства является защита растений от вредителей, болезней и сорняков. JB последние годы рисоводство во всех развитых странах базируется на широком использовании гербицидов, что практически способствует получению высоких стабильных урожаев этой важнейшей продовольственной культуры.
Однако при внесении в биосферу все возрастающих количеств пестицидов, удобрений, стимуляторов роста и других соединений, могут быть нежелательные последствия для конкретных биогеоценозов и биосферы в целом. Нередко внесенный пестицид способен накапливаться и сохраняться в окружающей среде длительное время. Кроме того известны случаи, когда внесенный препарат под действием биологических факторов превращается в более опасные продукты трансформации, которые могут быть стабильны и распространяться на большие расстояния.
В соответствии с Постановлением Совета Министров СССР и Совета Министров Казахской ССР (1980) "Об усилении охраны малых рек от загрязнения, засорения и истощения и о рациональном использовании их водных ресурсов" необходимо усилить поиск эффективных средств и способов регулирования скорости разложения остатков токсикантов и предупреждения загрязнения окружающей среды гербицидами и основными продуктами их трансформации. Это решение имеет прямое отношение к районам рисосеяния Казахстана - долинам рек Или и Сыр-Дарьи, которые в общей сложности занимают 85 тысяч гектар. Ежегодно в эти почвы вносятся десятки и сотни тонн гербицидов в том числе 2,4-Д, 2М-4Х, пропанида, ордрама и сатурна. Поведение 2,4-Д и пропанида в почвах рисовых полей Казахской ССР изучено детально и многосторонне (Торманов, Шарипова, 1982), в время как судьба тиокарбаматных гербицидов ордрама и сатурна в условиях Казахстана оставалась неизвестной.
Состояние вопроса. По литературным данным, однако, было известно, что в условиях Северного Кавказа (Краснодарский край) и Подмосковья ордрам разлагался достаточно медленно и, что самое главное отдельные продукты его превращения сохранялись в воде и иле водоема Пущинского питомника свыше 9 месяцев и были токсичнее, чем исходный препарат для теплокровных животных. Набор образующих- ся продуктов и скорость их превращения сильно зависели от региона и климатических условий.
Цель и задачи исследования. В связи с этим целью настоящей работы было изучение превращения микрофлорой почв рисовых полей Казахстана тиокарбаматных гербицидов ордрама и сатурна, выяснение их биодеградабельности в условиях Казахстана, изучение продуктов их превращения микроорганизмами.
В задачи исследования входило:
I - изучение влияния ордрама на численность основных групп микроорганизмов поев рисовых полей Кзыл-Ординской области;
2. - выделение микроорганизмов, способных разлагать ордрам и сатурн;
3 - исследование особенностей микробиологической трансформации ордрама и сатурна выделенными штаммами;
4 - изучение путей микробной деградации этих гербицидов, установление структуры и устойчивости основных промежуточных продуктов разложения ордрама и сатурна;
5 - выяснение оптимальных условий разложения гербицидов микроорганизмами.
Научная новизна. Из почв рисовых полей Казахстана выделены активные микроорганизмы, способные трансформировать гербициды ордрам и сатурн в условиях кометаболизма. Изучены пути и условия деградации ордрама и сатурна чистыми культурами. Установлено, что в процессе микробной деградации ордрама образуется целый спектр продуктов первичного превращения, ряд из которых сохраняется в среде длительное время.
Исследованы пути, микробной трансформации сатурна и доказано строение основных продуктов микробного превращения сатурна. Показано, что лишь сульфоксид сатурна сохраняется длительное время в почве и культуральной жидкости, остальные продукты не накапливаются, а подвергаются дальнейшему разложению.
Практическая ценность. На основании изучения превращения ордрама и сатурна микрофлорой почв рисовых полей сделан вывод, что сатурн более предпочтителен для использования в широких масштабах в условиях Казахстана.
Данные по влиянию отдельных факторов на микробиологическую деградацию ордрама могут быть использованы при разработке и обосновании рекомендаций по эффективному и безопасному для окружающей среды применению ордрама в условиях Казахской ССР.
Результаты по влиянию внесения дополнительных субстратов на деградацию этих гербицидов могут послужить основой для подбора дешевых органических субстратов естественного происхождения с целью активации способности естественной микрофлоры разлагать остаточные количества тиокарбаматных гербицидов.
Разработан метод полуколичественного определения сатурна.
Краткая характеристика свойств гербицидов
Для уничтожения болотных сорняков (клубнекамыш приморский, тростник обыкновенный, частуха подорожная, рогоз широколистный и узколистный) применяют феноксиалкановые кислоты 2,4-Д, 2М-4Х. В настоящее время из препаратов 2,4-Д и 2М-4Х наибольшее применение в Казахстане нашли натриевая и аминная соли 2,4-Д, бутиловый эфир 2,4-Д и натриевая соль 2М-4Х (табл.1).
По данным Кзыл-Ординской опытной станции, при применении натриевой соли 2,4-Д в дозе 2 кг/га через 30 дней после первого опрыскивания поля погибало 39%, а после повторного - 48% клубнекамыша приморского, а при дозе 4 кг/га - соответственно 81 и 85% (Коваленко, Дуденко, 1974).
Скорость действия гербицидов группы 2,4-Д зависит от температуры. Оптимальная температура +16- +25С. Атмосферные осадки, выпавшие в первые 2-4 часа после опрыскивания, снижают эффективность обработки. При жаркой погоде +25- +30С натриевую и аминную соли 2,4-Д применяют в более низких дозах. При пониженной температуре ниже +20С, а также при неустойчивой и дождливой погоде посевы обрабатывают эфирньми препаратами повышенной дозы (Коваленко, Дуденко, 1974).
Феноксиалкановые кислоты 2,4-Д и 2М-4Х могут поступать в организм человека и теплокровных животных через кожу, органы дыхания и желудочно-кишечный тракт. В соответствии с гигиенической классификацией пестицидов большинство препаратов этой группы являются среднетоксичными. Они вызывают изменения кожного покрова и слизистых оболочек, могут задерживаться в организме теплокровных животных и быть причиной хронических отравлений. В продуктах питания остаточные количества 2,4-Д не допустимы (Мельников с соавторами, 1980).
Для борьбы с просянками на посевах риса применяются гербициды контактного действия - пропанид, СТАМ, ДСРА и другие, содержащие 35-40% действующего вещества 3,4-дихлорпропионанили-да. Эффективное действие этих гербицидов возможно только на открытой листовой поверхности сорняков. При обработке всходов просянок на просушенной почве гибель их ускоряется, а рост новых намного задерживается. Однако на засоленных почвах легкое подсушивание почвы может привести к повышению концентрации солей в верхнем горизонте почвы и гибели всходов риса, поэтому целесообразно проводить обработку по увлажненной почве, увеличив дозу гербицида (Коваленко, Дуденко, 1974).
Пропанид и его аналоги, выпускаемые за рубежом, соединения средней токсичности для теплокровных животных (табл.1). Токсичность гербицида возрастает при повьшіении температуры окружающей среды. Под влиянием токсических доз пропанида у крыс, кроликов, кошек уменьшается содержание эритроцитов, гемоглобина, изменяется активность окислительно-восстановительных ферментов крови -каталазы и пероксидазы. Пропанид обладает выраженными кумулятивными свойствами. Коэффициент кумуляции при 1/50 ЛД д-равен 1,2 Шайер-Боде, 1972, Справочник по пестицидам, 1974, Мельников с соавт., 1977).
В предпосевной период, а также после появления всходов широкое применение нашел тиокарбаматный гербицид ордрам - ялан, молинат. В Казахстане испытание этого гербицида проводилось на Кзыл-Ординской опытной станции и Ташкарасуйском опорном пункте КазНИИ земледелия в течение трех лет. Опыт показал, что внесение гербицида в почву должно проводиться за 4-5 суток до посева риса и затопления почвы водой. Внесение ордрама в более ранние сроки, за 9 и более дней до затопления полей, снижает токсичность гербицида до 30%, так как препарат обладает повышенной летучестью и подвергается солнечной радиации (Коваленко, .Пуденко, 1974, Soderquist е. а. , 1977, Crosby , 1982).
Ордрам - среднетоксичен при однократном введении в желудок Таблица I. Физико-химические и токсические свойства гербицидов. белых мышей и крыс (табл.1). При концентрации 1-2 мг/м3 в воздухе оказывает эмбрио- и гонадотоксическое действие, влияет на генеративные функции (Фудель-Осипова с соавт., 1981, Kundiev е.а., 1974). Коэффициент кумуляции больше 10 при введении крысам 1/20 ЛД о Ордрам угнетает окислительные процессы в организме, нарушает функции щитовидной железы, коры надпочечников, обмена нуклеиновых кислот (Дядичева, 1970, Врочинский с соавт., 1975).
Другой тиокарбаматный гербицид сатурн или бентиокарб применяется для борьбы с просовидными сорными растениями в рисе путем опрыскивания почвы до посева или до появления всходов культуры; возможно применение и в фазу появления 1-2 листьев. Учитывая меньшую токсичность сатурна для теплокровных животных, рыб и многих насекомых (Мельников с соавт., 1980, Ishikawa e.a.,13J3, Casida е.а., 1974, 1975), а главное меньшую летучесть по сравнению с ордрамом следует считать его весьма перспективным. Последнее его качество представляет большой интерес именно для условий Казахстана, так как в силу ряда факторов не всегда удается провести своевременное затопление посевов риса после обработки ордрамом, что приводит к большим потерям гербицида и резкому снижению его эффективности. В этом отношении сатурн предпочтительнее.
Объекты исследования
Воздействие ордрама на микрофлору почв изучали в лабораторных условиях в вегетационных сосудах объемом 2-3 литра, гербицид вносили в почву в виде водной эмульсии в концентрации, в три раза, превышающей производственные дозы ( Atlas, Pramer, Bartha, 1978).
Влияние ордрама изучали на следующие группы микроорганизмов: сапрофитные микроорганизмы, грибы и актиномицеты. Посевы проводили по общепринятым в микробиологии методам из десяти разведений. Для этого брали 10 г почвы и переносили в колбу со ЮО мл стерильной водопроводной воды. Почвенную суспензию перемешивали на качалке в течение 15 мин и затем делали разведение. Одновременно брали почву для определения ее влажности. Анализ почвенной микрофлоры проводили, начиная с первого дня внесения гербицида и через 3, 7, 19, 30 суток. Количество микроорганизмов учитывали на средах: мясо-пептонном агаре (МПА), и крахмало-аммйачном агаре (КАА). Состав питательных сред и методы их приготовления взяты из "Большого практикума по микробиологии" под общей редакцией Г.Л. Селибера (Аристов-ская с соавт., 1962). Для выявления культур, разлагающих гербициды, высевы проводили и на агаризованную среду 8-Е (Ерошин с соавт., 1965) с ордрамом и сатурном .в качестве единственных источников углерода. Гербициды вносили в концентрациях 50 и ЮО мг/л. Для отбора микроорганизмов, разлагающих гербициды ордрам и сатурн, использовали воду сточных и оросительных каналов и почвы рисовых полей АлмагАтинской (Прибалхашье) и Кзыл-Ординской областей. Отбор культур, превращающих ордрам, вели тремя методами: высевом непосредственно из почвенных образцов и воды; высевом из почв модельных опытов по изучению воздействия ордрама на микрофлору почв; выделением из накопительных культур. Для накопительных культур использовали почвенные образцы рисовых полей Кзыл-Орцинской и Алма-Атинской областей, а также воду из стоков и оросительных каналов. Культивирование проводили в качалочных колбах при 29С. В колбы с минеральной средой 8-Е вносили по I г почвы или по I мл воды. В качестве единственного источника углерода использовали ордрам в концентрации 25 и 50 мг/л. Накопительные культуры поддерживали в течение двух месяцев, пересевая каждые 10 дней. При пересевах отбирали 50% исходной накопительной культуры, добавляя свежеприготовленную среду с соответствующей концентрацией гербицида.
Выделенные микроорганизмы идентифицировали по 8 изданию определителя Берги (Buchanan, Gibbons, 1974). Способность выделенных культур усваивать гербициды в качестве единственного источника углерода изучали ауксанографи-чески путем посева суспензии суточных культур штрихом на ага-ризованную среду 8-Е с различными концентрациями гербицидов от 50 до 250 мг/л. Контролем служила та же среда без источника углерода. Изучение способности чистых культур микроорганизмов трансформировать гербициды проводили в жидких синтетических средах следующего состава: Минеральная среда 8-Е (г/л): NaCl-0,5; MgS04 7H20-0,8; КН2Р04 0,7; (HH gHPC -l,5; вода водопроводная 800 мл; фосфаты готовились отдельно на дистиллированной воде 200 мл и смешивались с остальным раствором после стерилизации и охлаждения; Среда для Pseudomonas (г/л): (NH4)2S04-4,0; КН2Р04-1,5; NagHPO S; MgS04«7H20 - 0,2; FeS04«7H20-0,OOt; СаС12»2Н20-0,01;Вода водопроводная - I л. Трансформацию гербицидов проводили в колбах на 750 мл и в колбах Эрленмейера на 250 мл с объемом среды 100 и 50 мл соответственно, при перемешивании на качалке (180 об/мин) при температуре 29С. Гербициды вносили в концентрации от 25 до 100 мг/л. Деградацию гербицидов осуществляли и в условиях кометаболизма, в качестве косубстратов использовали различные концентрации сахарозы, глюкозы, этанола 0,1; 0,5; 1%; гексадекана, глицерина, натриевых солей бензоата и пропиона-та 0,05; 0,1; 0.5%. Динамику деградации ордрама почвенной суспензией изучали в лабораторных условиях в качалочных колбах на качалке и в микроаэрофильных условиях. Ордрам вносили в концентрации 50 мг/л. Для изучения влияния различных концентраций солей на трансформацию ордрама чистыми культурами использовали минеральную среду 8-Е, разбавленную в 10 и 100 раз, воду озер Подмосковья: из пруда расположенного близ города Пущино (время отбора март); из Тульчинского и Липицкого озер (май, июнь); из сточных и оросительных каналов рисовых полей Кзыл-Ординской области и Прибалхашья (июнь, октябрь), а также ди-и тридистиллированную воду и 0,0Ш раствор фосфатного буфера. Влияние аэрации на микробиологическую деградацию ордрама изучалось в различных режимах перемешивания (12 часов на качалке и 12 часов без перемешивания), а также в микроаэрофильных условиях в колбах Эрленмейера на 250 мл со средой налитой под пробку. Влияние температуры исследовалось в четырех режимах и с перепадом температур от 29 до 10 и 37 до ЮС. Изменение условий аэрации и режима температур проводили через каждые 12 часов с культивированием колб на качалке с температурой 29 или 37 и 12 часов культивирования без перемешивания при ЮС.
Способность микроорганизмов использовать гербициды в качестве единственного источника углерода
Способность микроорганизмов использовать гербициды в качестве единственного источника углерода С целью выяснения способности микрофлоры почвы и воды превращать тиокарбаматные гербициды ордрам и сатурн, из почв рисовых полей, воды стоков и коллекторов, почв модельных опытов и накопительных культур было выделено 350 штаммов микроорганизмов, отнесенных нами к родам Bacillus, Nocardia, Streptomy-ces, Mycobacterium, Pseudomonas.
Вся выделенная коллекция была проверена на способность расти наагаризованной среде с различивши концентрациями ордра-ма в качестве единственного источника углерода. Выяснилось, что ни одна культура не росла на среде с ордрамом в качестве единственного источника углерода, но 36 штаммов выдерживали концентрацию 100 мг/л и выше.
Эти штаммы были проверены и на способность расти на среде с различными концентрациями Сатурна и данные также были отрицательные, ни одна культура не росла на среде с Сатурном в качестве единственного источника углерода, но девять штаммов были устойчивы к концентрациям Сатурна 100-200 мг/л. Среди штаммов, устойчивых к тиокарбаматам были представители следующих родов: Bacillus - 23 штамма; Nocardia - 2 штамма; Streptomyces - 2 штамма; грамотрица-тельных палочек - 7 штаммов.
Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что чистьте культуры, выделенные из природных источников, не используют тиокарбаматные гербициды в качестве источника углерода и энергии.
Тридцать шесть штаммов - представителей различных таксономических групп, выдерживающих высокие концентрации ордрама и сатурна, были проверены на способность трансформировать ордрам и сатурн в жидкой среде в обычных условиях, когда ордрам и сатурн вносились в качестве единственных, источников углерода.
Результаты опытов показали, что ни один из проверенных штаммов не трансформировал ордрам. При инкубации отмытых клеток с гербицидом в буферном растворе не было обнаружено никаких продуктов трансформации. Лишь одна культура В. megaterium 168 осуществляла следовую трансформацию сатурна в жидкой минеральной среде 8-Е, где он присутствовал как единственный источник углерода. Причем окисление наблюдалось только по атому серы с образованием сульфоксида сатурна.
Чужеродные соединения, не атакуемые микроорганизмами в обычных условиях,нередко подвергаются трансформации, а иногда и полной деградации в условиях кометаболизма (при внесении в среду дополнительных субстратов) (Скрябин с соавт., 1974, 1975, 1978), нами была проверена возможность превращать ордрам в условиях кометаболизма всеми культурами, выделенными из почв вегетационного опыта с внесением этого гербицида. Оказалось, что из 144 проверенных штаммов 24 осуществляли трансформацию ордрама при внесении различных дополнительных субстратов (табл.4).
Кометаболизм сатурна изучали только культурами, устойчивыми к высоким концентрациям его в среде (100-200 мг/л). Скрининг активных микроорганизмов, способных разлагать сатурн, показал, что 4 штамма В. thuringiensis 24, В. megaterium 168, Bacillus sp. 172 и К. erythropolis 119 трансформировали сатурн в этих условиях.
Однако только одна культура В. megaterium 168 полностью разлагала сатурн при внесении дополнительного субстрата. Табл. 4. Деградация ордрама культурами, выделенными из почв рисовых полей Кзыл-Одинской области. Организмы Концентрация ордрама мг/100 мл -Организмы. Вари- Исх.Через Через ант 7 дн. 14 дн. Концентрация ордрама мг/100 мл штаммами бацилл (12, 25, 36, 109, 124, 157, 165, 172). Детальное изучение динамики деградации ордрама и сатурна было проведено на примере трех культур В. thuringiensis 24, В. megaterium 168 и И« erythropolis 119.
Деградация ордрама
Учитывая, что микробный метаболизм ордрама сопровождался образованием промежуточных продуктов, накапливающихся в среде, нами было предпринято изучение соединений, образующихся в процессе трансформации гербицида. Изучение путей микробной деградации ордрама детально проводили на примере трех культур: В. thuringiensis 24, Б. megaterium 168, N. Примечание: В качестве косубстрата использовали сахарозу. Культуры В. thuringienais 24 и В. megaterium 168 образовывали в процессе деградации ордрама 4 продукта (I - 4), отличавшихся по хроматографической подвижности в различных смесях растворителей. Продукты окисления ордрама культурой N. erythropolis 119 (5 - 9) также были выделены и охарактеризованы (табл.6).
Ниже приведены физико-химические характеристики, позволившие определить структуру выделенных соединений. Продукт I. - полярное вещество (табл.6), появлялось через несколько часов после начала ферментации, при опрыскивании хроматограмм раствором хлористого палладия окрашивалось в ярко-оранжевый цвет. ИК-спектр этого продукта в основном напоминал спектр ордрама за исключением новой появившейся полосы 1070 см7 характерной для валентных колебаний - so группы (рис.1. Приложения). Сульфоксидная природа продукта подтверждалась и широкой полосой поглощения третичной амидной группировки с двумя максимумами - 1664 и 1688 см , В масс-спектре этого соединения, полученном при фотоионизации на -линии (Я =121 б К) был зарегистрирован малоинтенсивный пик молекулярного иона с м/е 203 (табл.7). На основании полученных характеристик было высказано предположение, что продукт I является сульфоксидом ордрама. Для окончательного подтверждения строения этого продукта был проведен химический синтез сульфоксида ордрама (Фи-зер, I960). Сравнения хроматографического поведения в смесях растворителей (табл.6), физико-химических характеристик (ИК-спектроскопия, масс-спектрометрия) продукта I и синтезированного сульфоксида ордрама показало полную их идентичность. Табл. 6. Хроматографическая подвижность продуктов микробной деградации ордрама
Продукт 2. - появлялся позже сульфоксида, был менее полярным чем сульфоксид (табл.б), при опрыскивании раствором хлористого палладия окрашивался в желтый цвет. В ИК-спектре продукта 2 имелись интенсивные полосы 1065 и 3440 см", ответственные за деформационные и валентные колебания ОН- группы (рис.2. Приложения). Анализ спектра ПМР показал, что окси-группа находилась у д-углеродного атома гексагидроазепиново-го кольца ордрама (рис.6а. Приложения). На основании полученных данньк продукт был идентифицирован как S - этилгексагидро-З-окси-1- N-азепин-І-карботиоат
Продукт 3 - появлялся почти одновременно с предыдущим продуктом, при опрыскивании раствором хлористого палладия также окрашивался в желтый цвет, что указывало на присутствие в молекуле вещества атома серы. ИК-спектр продукта 3 в пленке на КВч содержал полосы поглощения 1055 см" и 3440-3450 см-, что означало наличие в молекуле продукта ОН- группы. Анализ спектра ПМР показал, что гидроксилирование прошло у Y-углеродного атома гексагидроазепинового кольца ордрама (рис.6. Приложения). На основании этих данных продукту 3 была приписана структура s - этилгексагидро-4-окси-1- іг-азепин-1-кар-ботиоат Г VC-S-C2H5
Продукт 4 - появлялся на третьи сутки ферментации, раствором хлористого палладия окрашивался в желтый цвет. Хро-матографически был более подвижен, чем первые три вещества. В продукте 4 согласно данным хромато-масс-спектрометрии было обнаружено дегидропроизводное ордрама в следовых количествах (4 а) и кетоформа ордрама (4 б). Результаты хромато-масс-спек-трометрического анализа ордрама и продуктов его матеболизма приведены в таблице 7. ИК-спектр этого продукта показал наличие сильного поглощения в области 975 см , обусловленного деформационными колебаниями - GH- при двойной связи (рис.3.Приложения) . Таким образом, на основании данных ИК-спектроскопии и хромато-масс-спектрометрии в четвертом продукте было найдено в следовых количествах дегидропроизводное ордрама (4а).
Похожие диссертации на Деградация гербицидов ордрама и сатурна микроорганизмами, выделенными из почв рисовых полей Казахстана
