Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методы оценки жизнеспособности микроорганизмов 6-19
Глава 2. Содержание микробной биомассы в почве 20-36
Глава 3. Почвы сухостепных ландшафтов Забайкалья 37-51
Глава 4. Объекты и методы исследования 52-62
4.1. Объекты исследования 52-56
4.2. Методика подготовки образцов почвы к микробиологическому анализу 56-58
4.3. Методика определения жизнеспособности прокариотных микроорганизмов 58-59
4.4. Методика исследования комплекса почвенных бактерий по посеву 60
4.5. Определение общего углерода органических и неорганических веществ в почвах 60-62
Глава 5. Характеристика структуры микробного комплекса почв Забайкалья 63-72
Глава 6. Определение углерода органического вещества и расчет в нем доли углерода прокариотной и эукариотной биомасс в изученных почвах и их горизонтах 73-84
Глава 7. Показатели роста прокариотных микроорганизмов в различных почвах 85-94
Глава 8. Дифференциация различных почв по показателям роста прокариотных микроорганизмов 95-103
Глава 9. Изучение скоростей роста чистых культур бактерий, выделенных из различных горизонтов изученных почв 104-107
Глава 10. Рост прокариотных микроорганизмов в почвенных суспензиях разных горизонтов 108-118
одного типа почв
Заключение 119-123
Выводы 124-125
Литература 126-141
- Методика определения жизнеспособности прокариотных микроорганизмов
- Определение общего углерода органических и неорганических веществ в почвах
- Определение углерода органического вещества и расчет в нем доли углерода прокариотной и эукариотной биомасс в изученных почвах и их горизонтах
- Дифференциация различных почв по показателям роста прокариотных микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность проблемы. В рамках сезонной сукцессии в почве происходят постоянный рост и отмирание почвенных микроорганизмов. Сменяют друг друга доминирующие популяции, происходят существенные флуктуации общей численности микробов. Общий учет численности микроорганизмов в почве связан с большими методическими трудностями и преимущества различных подходов здесь до настоящего времени являются предметом дискуссии. Все еще достаточно популярны оценки общей численности микроорганизмов в почве с помощью посева на плотные питательные среды. При этом имеются огромные различия между данными, полученными с помощью посева и данными, полученными прямыми микроскопическими методами. Все больше исследователей склоняются к мнению о предпочтительности прямых микроскопических методов учета.
Изучение прямыми микроскопическими методами численности и биомассы микроорганизмов в почве и особенно динамики этих показателей по сезонам является актуальным направлением современной почвенной микробиологии. Однако, изучая динамику численности различных групп микроорганизмов, исследователь оказывается перед необходимостью оценивать соотношение живых и мертвых клеток. Необходимо знать, какая часть учитываемой микробной биомассы является жизнеспособной, а какая - только потенциальным субстратом в каждый данный момент времени.
Большое самостоятельное значение имеет вопрос о скорости реутилизации отмирающей микробной биомассы.
До настоящего времени не предложено надежного прямого метода дифференцированного учета живых и мертвых микроорганизмов в природных местообитаниях. Диапазон предлагающихся методов дифференциации живых и мертвых прокариотных микроорганизмов не так широк. В первую очередь используются различные методы окрашивания (Мейсель, Заварзина, 1947; Разумовская, Осипова, 1958; Babiuk, Paul, 1970; Coleman, 1980; Lubdgren, 1981; Kjoller, Struwe, 1982; Луста, Фихте, 1990; Полянская, Головченко, Звягинцев, 1998). Существуют также различные приемы оценки жизнеспособности прокариотных пропагул по критериям термотолерантности и устойчивости к ультразвуковому воздействию (Ефременкова и др., 1978; Полянская, 1979; Звягинцев и др., 1981, 1982). При изучении соответствующей литературы обращает на себя внимание огромный разброс в оценках соотношения в почве живой и мертвой биомассы прокариотных микроорганизмов (Kjoller, Struwe, 1982). Существующие среди исследователей разногласия свидетельствуют об актуальности дальнейшего совершенствования приемов учета живых *и мертвых прокариотных микроорганизмов в почве.
На основе метода прямого учета эукариотной микробной биомассы в различных почвенных местообитаниях (Полянская, 1996; Головченко, Полянская, 1996; Звягинцев и др., 1999; Павлова и др., 2000; Полянская,
Свешникова, 2001) был разработан метод дифференциации живой и мертвой грибной биомассы на основе роста грибных пропагул в почвенных суспензиях на препаратах для микроскопирования (Полянская, Головченко, Звягинцев, 1998; Головченко, Полянская, 2000). С помощью этого метода было установлено, что большая часть учитываемой с помощью микроскопии грибной биомассы в почвах жизнеспособна. Разные почвы различаются по соотношению численности живой и мертвой грибной биомассы, но особенно значимы различия по этому показателю между органогенными и минеральными горизонтами почв. Именно в минеральных горизонтах происходит накопление мертвой грибной биомассы, и ее доля здесь может достигать 50% от общего содержания грибов (Полянская, Звягинцев, 2005).
Целью настоящей работы было охарактеризовать прокариотные сообщества (на примере почв Забайкалья) на основании прямых микроскопических методов, как традиционных, так и новых, позволяющих оценить жизнеспособность бактерий в этих почвах.
В задачи исследования входило:
Определение численности и биомассы прокариотных микроорганизмов в исследуемых почвах Забайкальского региона.
Определение углерода органического вещества и расчет в нем доли углерода прокариотной и эукариотной биомасс в изученных почвах и их горизонтах.
Разработка комплекса методов определения жизнеспособности прокариотных микроорганизмов и изучение ростовых параметров бактерий на микроскопических препаратах в почвенной суспензии.
Апробация вновь разрабатываемых методов на широком спектре почв и их горизонтов.
Сравнение роста прокариотных микроорганизмов в почвенных образцах и в чистых культурах.
Научная новизна. Новизна в оценке жизнеспособности прокариот в почве состоит в переходе от макрометода культивирования на чашках Петри с образованием колоний (необходимы сотни генераций) к микрометодам, когда устанавливается способность дать хотя бы одну-две генерации. Основной новацией полученных результатов является оценка жизнеспособности прокариотных клеток по росту их на препаратах, предназначенных для микроскопического учета, что позволяет судить о доли жизнеспособных клеток в общей массе учитываемых микроорганизмов. Впервые дана оценка жизнеспособности прокариотных микроорганизмов по росту почвенных бактерий и увеличению длины мицелия актиномицетов непосредственно в микроскопических препаратах почвенной суспензии. Впервые на основании изучения динамики скорости роста микробных клеток на препаратах оценены различия в структуре комплексов прокариотных микроорганизмов в разных почвах и их ^ горизонтах %
Практическая значимость. Наряду с традиционными показателями (определение численности и биомассы микроорганизмов прямыми методами), разработанные нами показатели, такие как характер роста численности прокариотных микроорганизмов, время удвоения и динамика роста численности бактерий и длины актиномицетного мицелия могут быть использованы для характеристики разных почв, их горизонтов и выявления жизнеспособности прокариотных микроорганизмов в них. На основании этих показателей можно более четко установить сходство и различие не только разных почв, но и их горизонтов, в том числе и погребенных.
Хочу искренне поблагодарить своих учителей д.б.н.. Д.Г. Звягинцева и к.б.н. А.В. Головченко. Особую благодарность выражаю д.б.н. B.C. Гузеву, к.б.н. Т.Г. Добровольской и к.б.н.. З.Н. Тюгай за практические советы и помощь в работе.
Автор признателен чл.-корр. РАН В.М. Корсунову и к.б.н. Г.Г. Гончикову (Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН) за сотрудничество и предоставление почвенных образцов.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ № 04-04-48640.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Методика определения жизнеспособности прокариотных микроорганизмов
Для установления репродуктивной способности бактерий и актиномицетного мицелия был разработан новый метод (рис. 4). Приготовленные препараты до высыхания мазков помещали во влажную камеру и инкубировали при температуре воздуха 28С и влажности 100% в течение 6,10,18,24,36 (32, 39) и 48 часов.
После инкубирования препараты высушивали на воздухе, фиксировали и окрашивали акридином оранжевым. Контролем служили препараты, зафиксированные и окрашенные сразу после приготовления мазков. Предлагаемая методика позволяет оценить скорость прорастания бактерий и актиномицетных пропагул.
Вычисляли удельную скорость роста ц: \i = Nt - Nt.i /(tnn-i) Nt_i , где Nr плотность популяции в момент времени tn, a Nt-i плотность популяции в предыдущий момент времени (tn-l)).
Для выявления таксономической структуры бактериальных сообществ гумусовых и минеральных горизонтов исследуемых почв мы использовали модифицированную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду. Посев проводили в 5-кратной повторности из экспериментально подбираемых разведений. Посевы инкубировали при 20С в течение 2-3 недель. Проводили дифференцированный учёт колоний бактерий разных таксономических групп. Для этого первоначально на каждой чашке выделяли макроморфологические типы колоний и подсчитывали количество колоний каждого типа. По 3-5 представителей из каждого типа колоний выделяли в чистую культуру. Идентификацию выделенных штаммов до рода проводили на основании морфологических, культуральных и хемотаксономических признаков, используя определители (Bergey s, 1974).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ STATGRAPHICS и STATISTICA. Для численности бактерий доля среднего квадратического отклонения (8n.i) не превышала 5%, для актиномицетного мицелия -10%.
Определение общего углерода органических и неорганических веществ в почвах проведено на базе экспресс анализатора АН-7529. Для определения содержания общего углерода в почвах использован метод сухого сжигания органического вещества почвы в токе кислорода (Когут и др., 1993).
Ход анализа. Определение содержания углерода проводится после полной подготовки анализатора к работе, в строгом соответствии с положениями, изложенными в инструкции. Градуировку анализатора осуществляют с помощью стандартных образцов почвенных масс, аттестованных на содержание общего углерода.
Подготовка образцов на анализ.
1. Почва, отделенная от корней и других растительных остатков, растирается в ступке и просеивается через сито 0,25 мм.
2. Берется навеска почвы весом 0,5 г. Образец взвешивается с точностью до 0,001 г.
Навеску почвы, помещенную в фарфоровую лодочку, сжигают в трубчатой печи при температуре 900-1000С в потоке очищенного от примесей кислорода. Углекислый газ, образовавшийся при сгорании содержащегося в почве углерода, уносится потоком кислорода в электролитическую ячейку и поглощается в ней поглотительным раствором, вызывая его закисление. Электролитическая ячейка имеет два отсека, заполненных растворами и разделенных перегородкой. Один отсек сосуда - катодный, заполняется поглотительным раствором, другой -анодный, заполнен вспомогательным раствором. Отсеки электрически соединены с помощью токопроводящей гидратцеллюлозной пленки. Закисление раствора приводит к изменению э.д.с. электронной системы и соответствующему изменению выходного напряжения рН-метра, которое затем преобразуется в импульсы тока, протекающие по участку анод -катод, вызывая восстановление ионов водорода на катоде и нейтрализацию кислоты, образующейся при поглощении СОг. Количество электричества, требующееся при нейтрализации, фиксируется пересчетным индикаторным устройством, отградуированным в % массовой доли углерода.
Для определения углерода карбонатов, а по литературным источникам эти почвы обогащены ими, использовали 20% раствор НСЮд. К навеске почвы весом 0,5 г приливали 5 мл 20% раствора НСЮ4. Образующийся углекислый газ при разложении карбонатов, уносится потоком кислорода в электролитическую ячейку и определяется методом кулонометрического титрования.
Рассчитали долю углерода микробной биомассы, прокариотного и эукариотного блоков в запасах углерода органического вещества в различных почвах и их горизонтах. Содержание углерода в микробной биомассе принимали за 50%.
Определение общего углерода органических и неорганических веществ в почвах
Исходная численность бактерий в гумусированных горизонтах исследуемых почв (каштановой, луговой и дерново-лесной) составляла миллиарды клеток/г и была в 2-3 раза выше, чем в минеральных горизонтах (рис. 5-І).
Численность бактерий в верхних горизонтах анализируемого ряда почв постепенно нарастала от каштановой (3 млрд. клеток/г) к луговой почве (4 млрд. клеток/г) и достигала своего максимума в дерново-лесной почве (6 млрд. клеток/г). В минеральных горизонтах наибольшая плотность бактериальных клеток была выявлена в луговой почве, далее в порядке убывания численности следовали дерново-лесная и каштановая почвы. В луговой почве разница между содержанием бактерий в дерновом и минеральном горизонтах была меньше, чем в каштановой и дерново-лесной почвах.
Исходная длина актиномицетного мицелия в исследуемых почвах измерялась сотнями м/г. Максимальная его плотность была выявлена в гумусированных горизонтах луговой почвы (600 мг/г). Длина прокариотного мицелия в двух других анализируемых почвах была в 1,5-2 раза ниже, чем в луговой почве и составила для гумусовых горизонтов -350-400 м/г, для минеральных - 230-250 м/г (рис. 5-II). Горизонты исследуемых почв различались по исходной численности бактерий и содержанию актиномицетного мицелия. Концентрация как одноклеточных, так и мицелиальных прокариотных микроорганизмов была выше в почвах (луговой, дерново-лесной) под фитоценозами, характеризующимися более благоприятными условиями существования для микробных популяций.
Для почв второй группы (различных вариантов землепользования) выявлены те же пределы колебаний численности бактерий и длины актиномицетного мицелия, что и для почв катены. Различия между содержанием бактерий в горизонтах А и В наблюдались только в каштановой почве под пашней. В пределах этих горизонтов в других почвах ряда численность бактерий менялась мало. Падение бактериального титра в 1,5-2 раза наблюдали только при переходе к подстилающей породе. Плотность актиномицетного мицелия закономерно убывала вниз по профилю во всех вариантах каштановых почв (рис. 6).
Таким образом, численность прокариотных микроорганизмов в исследуемых почвах была больше подвержена вертикальной вариабельности, чем горизонтальной. Плотность бактериальных популяций закономерно убывала вниз по профилю в соответствии с убыванием корневой массы и органических веществ, при этом численность бактерий и длина актиномицетного мицелия в различных горизонтах анализируемых почв различались не более чем в 1,5-3 раза.
Определение углерода органического вещества и расчет в нем доли углерода прокариотной и эукариотной биомасс в изученных почвах и их горизонтах
На примере различных типов почв Забайкалья, в том числе и их различных горизонтов, изучено содержание органического углерода и углерода микробной биомассы. На рисунке 7 представлены данные по распределению С орг., С карб., С микроб., и содержанию углерода микробной биомассы в углероде органического вещества. Как видно из рисунка, в почвах катены наибольшее содержание углерода органического вещества зарегистрировано в верхних горизонтах луговой, лугово-каштановой и дерново-лесной почв, которое составляет от 20 до 30 мг/г. В каштановой почве содержание С орг. в этих же горизонтах составляло около 10 мг/г почвы. На глубине запасы углерода органического вещества снижались, особенно в дерново-лесной и каштановой почвах.
Наибольшее содержание углерода микробной биомассы (до 5 мг/г) обнаружено в верхних горизонтах дерново-лесной почвы, в минеральных горизонтах содержание снижается до 1 мг/г. Для остальных почв катены распределение этого показателя сходно между собой и по характеру кривой и по численности.
Доля содержания углерода микробной биомассы в углероде органического вещества в зависимости от типа почв и горизонта составляет от 20-30% в дерново-лесной почве до 5-10% во всех остальных. В дерново-лесной почве она снижается до 10% в минеральных горизонтах, в луговой - до 5%, а в лугово-каштановой и каштановой - до 2%.
Как видно из следующего графика (рис. 8) в содержании углерода микробной биомассы доминирует углерод эукариотной биомассы, который составляет от 10-30% углерода органического вещества в дерново-лесной почве до 2-10% во всех остальных. Процентное содержание углерода прокариотной биомассы в углероде органического вещества невелико и практически не превышало 0,2%, исключение дерново-лесная почва, в которой в минеральных горизонтах оно было несколько выше.
Распределение углерода органического вещества по профилю каштановой почвы, представляющей различные варианты землепользования (рис. 9), сходно для целины и пашни: содержание С орг. выше в верхних горизонтах и резко снижается на глубине. Почва лесополосы занимает промежуточное положение, С орг. снижается не столь резко, по-видимому, за счет корневых выделений.
Сходный характер кривых распределения характерен и для углерода микробной биомассы.
Процент углерода микробной биомассы в углероде органического вещества в каштановой почве лесополосы в верхних горизонтах достигает 15%, в почве пашни и целинной - 1-4%. Увеличение этого показателя в этих почвах на глубине, связано не с увеличением микробной биомассы, а с падением С органического (рис. 9).
Процент содержания углерода эукариотной биомассы отражает содержание доли углерода общей биомассы (рис. 10). Необходимо отметить большую долю углерода прокариотной биомассы, доходящей до 0,4-0,6% на глубине этих почв, что связано с резким падением углерода органического вещества. В своих расчетах биомассы прокариот мы исходили из объема клетки почвенных бактерий в природном местообитании 0,1 мкм3 (Кожевин, 1989). Однако в литературе есть и другие данные (Kjoller, Struwe, 1982), оценивающие объем почвенных бактерий в 0,5 мкм и даже 1 мкм . Следовательно, реальная доля углерода прокариотной биомассы может составлять от 2-3% до 4-6% углерода органического вещества.
Дифференциация различных почв по показателям роста прокариотных микроорганизмов
Дифференциацию почв проводили по следующим показателям: характер роста численности бактерий и актиномицетного мицелия; время удвоения численности бактерий; динамика роста численности бактериальных клеток в различные промежутки времени в гумусовых и минеральных горизонтах; скорость роста численности бактерий в интервале 0-36 (0-39) часов; скорость роста актиномицетного мицелия в интервале 0-24 часа.
Для почв первой группы, расположенных по катене. максимальное сходство по выбранным критериям было выявлено для каштановой и лугово-каштановой почв (табл. 6).
В гор. А и В этих почв был зарегистрирован экспоненциальный характер роста численности бактерий, удвоение численности бактерий наблюдали через 10 ч (рис. 20). Скорость роста плотности бактериальных клеток в гумусовых горизонтах была максимальной в первые часы инкубации (0-6 ч), далее она уменьшалась в 2 раза и оставалась неизменной на всём протяжении опыта. В минеральных горизонтах почв скорость роста была одинаковой во все анализируемые промежутки времени и составляла 0,1 ч"1. Скорость роста актиномицетного мицелия в гумусовых горизонтах каштановой и лугово-каштановой почв варьировала от 0,6 до 0,8 ч 1, в минеральных горизонтах её значения уменьшались в среднем в 2 раза. Единственный показатель, по которому различались эти почвы - характер роста актиномицетного мицелия. Если для каштановой почвы рост длины актиномицетного мицелия происходил по экспоненте, как в гумусовых, так и в минеральных горизонтах, то в лугово-каштановой почве этот рост характеризовался линейной зависимостью (рис. 21).
Луговая почва в рассматриваемом ряду почв отличалась от лугово-каштановой и каштановой почв по большинству анализируемых показателей (табл. 6). Причём различия были более выражены в минеральных горизонтах этой почвы (рис. 22). Так, характер роста как одноклеточных, так и мицелиальных прокариотных микроорганизмов в этих горизонтах - линейный, в гумусовых - экспоненциальный. Удвоение численности происходило в гор. В через 6 часов, то есть гораздо раньше, чем в гор. А. Особенностями этой почвы также являются: низкие скорости роста (0,2 ч"1) численности бактерий в интервале 0-39 ч и длины актиномицетного мицелия в интервале 0-24 ч; динамика роста численности бактериальных клеток в различные промежутки времени в минеральных и гумусовых горизонтах.
Если посмотреть на спектр показателей для дерново-лесной почвы, то в нём можно обнаружить показатели, аналогичные таковым для выше рассматриваемых почв, и в тоже время найти значения, характерные только для этой почвы. К последним можно отнести динамику роста численности бактерий в различные промежутки времени в гор. А и В, а также скорость роста бактерий в минеральных горизонтах в интервале 0-39 часов, в 3 раза превышающую скорость в других почвах (табл.6).
Таким образом, среди почв первой группы, каштановая и лугово-каштановая почвы отличались от луговой почвы по большинству из проанализированных показателей. Дерново-лесная почва занимает промежуточное положение в исследуемом ряду, так как имеет показатели, аналогичные таковым для других почв ряда и свои собственные, отличные от остальных.
При сравнении показателей каштановой почвы, разных вариантов землепользования, были выявлены различия между целинными почвами, почвами под пашней и почвами под лесополосой (табл. 7). В целинных и пахотных почвах показатели отличались только для гумусовых горизонтов. Так, в пахотном горизонте характер роста численности бактерий - линейный (для целины - экспоненциальный). Удвоение численности бактерий фиксировали через 6 ч (для целины - через 10 ч). Скорость роста численности бактериальных клеток во все анализируемые промежутки времени сохранялась на одном уровне (для целины -максимальная скорость выявлена в интервале 0-6 ч, далее она уменьшалась в 2 раза и не менялась до конца опыта). Скорость роста численности бактерий в интервале 0-36 ч - 0,2 час"1 (для целины - в 2 раза выше), скорость роста актиномицетного мицелия в интервале 0- часа составляла 1,2 ч"1 (для целины - в 2 раза ниже).
Каштановая почва под лесополосой ближе по показателям к целинной почве, однако, имеет сходную динамику роста численности бактериальных клеток в горизонте А с Апах . Минеральные горизонты этой почвы отличаются от остальных почв ряда скоростью роста бактерий на разных этапах инкубирования (табл. 7).
Таким образом, анализ скоростей роста прокариотных микроорганизмов в гумусовых и минеральных горизонтах каштановых почв, представляющих различные варианты землепользования, выявил наибольшие различия между целинными почвами и почвами под пашней, причём различия в показателях были более выражены в гумусовых горизонтах, а не в минеральных. Каштановая почва под лесополосой занимала промежуточное положение в исследуемом ряду почв.
Похожие диссертации на Показатели роста прокариотных микроорганизмов в различных почвах
