Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 5
1.1. Фракционный состав нефти 5
1.2. Воздействие нефтяного загрязнения на почву и ее компоненты 9
1.3. Воздействие нефтяного загрязнения на растительность 10
1.4. Воздействие нефтяного загрязнения на микробные сообщества 12
1.4.1. Распространение углеводородокисляющих микроорганизмов в природе 12
1.4.2. Изменение состава микробного сообщества вследствие нефтяного загрязнения 16
1.4.3. Способность микроорганизмов к использованию различных фракций нефти 19
1.4.4. Факторы, влияющие на биодеградацию углеводородов в природе 21
1.4.5. Биоремедиация почв 27
1.4.6. Характеристика микроорганизмов северных почв 28
1.4.7. Особенности микробиологических процессов деструкции нефти и нефтепродуктов в северных почвах 29
1.5. Естественная биодеградация нефти в почве 30
1.6. Природно-климатические условия Усинского района Республики Коми 32
2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы и методы исследования 38
2.1.1. Методы получения накопительных культур 38
2.1.2. Выделение чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов из накопительной культуры 40
2.1.3. Идентификация выделенных микроорганизмов 40
2.1.4. Определение белка биомассы 43
2.1.5. Определение углеводородокисляющей активности бактерий рода Cytophaga 43
2.1.6. Количественный учет микроорганизмов 45
2.1.7. Определение содержания нефти в почве 46
2.1.8. Оценка микробной деструкции нефти и нефтепродуктов 47
2.1.9. Конструирование биопрепарата 47
2.1.10. Проверка сорбционной способности препарата 48
2.1.11. Постановка модельного опыта по определению активности биопрепарата 48
2.1.12. Биологический тест на токсичность 49
2.2. Результаты 51
2.2.1. Получение накопительных культур 51
2.2.2. Выделение чистых культур 52
2.2.3. Определение выделенных микроорганизмов 52
2.2.4 Доказательство углеводородокисляющей способности бактерий рода Cytophaga 59
2.2.5. Рост выделенных углеводородокисляющих микроорганизмов при разных температурах 62
2.2.6. Изучение роста микроорганизмов на разных углеводородных субстратах 64
2.2.7. Биодеструкция углеводородов нефти
выделенными культурами 72
2.2.8. Подходы к конструированию биопрепарата
для борьбы с нефтезагрязнениями 83
2.2.9. Лабораторные испытания биопрепарата 83
2.3. Обсуждение результатов 88
Выводы 98
Список литературы
- Фракционный состав нефти
- Распространение углеводородокисляющих микроорганизмов в природе
- Выделение чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов из накопительной культуры
- выделенных углеводородокисляющих микроорганизмов при разных температурах
Введение к работе
Среди различных видов техногенных нарушений природы одним из наиболее серьезных и трудно устраняемых является нефтезагрязнение. В нашей стране основная масса почв и вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, находится в северных и умеренных широтах, где теплый период года непродолжителен и процессы биодеградации не успевают пройти в полной мере (Гузев и др., 1989).
После завершения механической очистки почвы от нефти уровень остаточного загрязнения может быть еще достаточно высоким, что подавляет развитие в почве процессов естественного самоочищения. Поэтому, вслед за проведением технической рекультивации, должен следовать процесс интенсивной доочистки с помощью специальных рекультивантов. Разложение нефти в почве происходит под воздействием почвенной углеводородокисляющеи микробиоты. Ее активность зависит от ряда факторов. Почвы с достаточным содержанием органического вещества снижают токсический эффект благодаря сорбирующим свойствам органики и способны отчасти нейтрализовать действие нефти. Однако, при аварийных разливах нефти поглотительные, буферные свойства почвы и активность микробиологического комплекса снижаются. Суровый климат также обусловливает низкую естественную биологическую активность почв. В связи с этим процессы биологической деструкции нефти в почвах Крайнего Севера сильно замедлены. В последнее время успешно разрабатываются и применяются способы микробиологической очистки природных сред от нефтяного загрязнения (Мишустин, 1975; Коронелли, 1994; Чугунов и др., 2000). Опыт работы по изучению процессов разложения нефти в почвах на Крайнем Севере показал, что наибольшей эффективностью отличаются те микробиологические препараты, которые приготовлены из окисляющих нефть видов местной микробиоты (Арчегова, 1997). Они приспособлены не только к специфическим условиям климата и питания, но и способны утилизировать конкретный тип нефти. Качественный состав добываемой нефти также должен учитываться при подготовке микробиологических препаратов.
Фракционный состав нефти
С химической точки зрения нефть представляет собой сложную смесь разнообразных по химической структуре углеводородов с примесью их производных, включающих в основном серу, кислород и азот, а также асфальтены и смолы. В сырой нефти также содержатся газообразные углеводороды (до 5%), вода (до 10%), минеральные соли (главным образом хлориды - до 4 г/л) и многие микроэлементы, как металлы, так и металлоиды (Богомолов и др., 1995).
Углеводороды нефти представлены главным образом соединениями трех классов: - парафины (алканы) - насыщенные соединения, имеющие прямую и разветвленную цепь; - циклоалканы (нафтены) - насыщенные циклические соединения рядов циклопентана и циклогексана; - ароматические углеводороды - ненасыщенные циклические соединения ряда бензола;
Смолисто-асфальтеновые вещества являются неуглеводородными компонентами нефти и наиболее высокомолекулярными. Это гетероорганические соединения, в состав которых входят такие постоянные элементы как углерод, водород, кислород, часто сера, азот и металлы. Кислородсодержащие соединения могут составлять в нефти до 10%. Они представлены в основном кислотами, фенолами, кетонами и эфирами. Содержание серы в нефти может доходить до 14%, сера может встречаться в виде элементарной серы, меркаптанов, сульфидов и дисульфидов и входить в органические соединения, содержащие также кислород и азот. Содержание азота в нефтях доходит до 1%. Он входит в состав таких соединений как моно-ди- и триметилпиридины и их производные (Сергеенко, 1964).
В зависимости от содержания в нефти одного или нескольких классов углеводородов различают парафиновые, парафино-нафтено-ароматические, нафтено-ароматические и ароматические нефти (Алешин, 1986). Они различаются также по содержанию смол, асфальтенов и других соединений.
Основные физические характеристики нефти - температура кипения, плотность, вязкость зависят от химической природы и соотношения составляющих нефть компонентов. По величине удельного веса различают легкую ( 0,83 г/см3), среднюю (0,831-0,86 г/см3) и тяжелую ( 0,86 г/см3) нефти. Физико-химические характеристики нефтей из различных месторождений весьма несхожи.
Нефть Усинского района характеризуется как тяжелая, с высоким содержанием смол и асфальтенов (табл. 1 и 2).
К нефтепродуктам обычно относят различные углеводородные фракции, получаемые из нефти: бензины (С4-С12, температура кипения 40-200С), керосины (Ci2-C16, температура кипения 200-300С), дизельные топлива, содержащие углеводороды с длиной цепи от 14 до 25 атомов углерода и температурой кипения 300-400С, а также мазут и масла разнообразного назначения (Алешин, 1986).
Наиболее значимым физико-химическим механизмом исчезновения углеводородов нефти из почвы является испарение. За первые сутки из верхнего слоя нефтяного пятна летом может испариться до 15% нефти, что включает до 80% технического бензина, 22% керосина, но только 0,3% компонентов мазута (Квасников, Клюшникова, 1981), таким образом, важное значение имеет летучесть углеводорородов нефти. По этому показателю выделяется легкокипящая фракция нефти: н-алканы и изоалканы до Сю и моноциклические соединения (бензол, толуол и др.), которые легко элиминируются из почвы путем испарения. Углеводороды следующих фракций: керосиновой (Си - С13), газойлевой (С14 - Ci7) и легких масел или соляровой (Сів - С25) - мало выветриваются, а фракции смазочных или машинных масел (С26 - С35) и гудроновой (Сзє - Сбо и более) практически не подвержены выветриванию. В связи с этим важное значение имеют климатические условия, то есть в почвах южных районов процесс абиотического выветривания нефтяных компонентов может протекать быстрее, чем в северных.
Проблема охраны почв от загрязнения приобретает острую актуальность, поскольку почвенные ресурсы земного шара ограничены. Несмотря на все меры предосторожности в процессе нефтедобычи, а также при транспортировке нефти неизбежно загрязнение почв, которое обусловливает нарушение экологического равновесия, проявляющееся в изменении структуры биоценозов, интенсивности и направленности почвообразовательных процессов (Андерсон и др., 1980).
Компоненты нефти, по разному взаимодействуя с почвенными частицами, распределяются по вертикальному профилю почвы. Показано, что при вертикальном продвижении нефти вдоль почвенного профиля в гумусовом горизонте собираются высокомолекулярные компоненты нефти, в нижние горизонты проникают в основном низкомолекулярные соединения", наиболее простые по строению низкомолекулярные, парафиновые, нафтеновые и ароматические углеводороды нефти. На поверхности почвы нефть подвергается химическому окислению, частично фотоокисляется (Пиковский, 1988). Однако следует отметить, что абиотическое окисление протекает достаточно медленно, поэтому в большей мере разрушение углеводородов нефти связано с процессом их биохимического окисления, которое происходит лишь при участии нефтеокисляющих микроорганизмов (Артемьева, 1988).
Сама нефть является сильнейшим загрязнителем, который, покрывая поверхность почвы, уничтожает растительность, создает условия кислородного голодания в почве, является токсикантом. Нефть, попадая в почву, изменяет ее физические характеристики. Она обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами, которые передаются почвенным частицам. Происходят значительные нарушения водного и воздушного режимов почв, приводящие к развитию анаэробных процессов, что отрицательно сказывается на плодородии почв (Гузев и др., 1989). Загрязнение ухудшает воздушный режим почвы, вызывает недостаток кислорода, почва обогащается сероводородом.
Распространение углеводородокисляющих микроорганизмов в природе
Почва - весьма благоприятный субстрат для выделения бактерий, относящихся к родам Pseudomonas, Rhodococcus, Mycobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium и др., использующих углеводороды (Квасников, Клюшникова, 1981; Bossert, Bartha, 1984). Углеводородокисляющие бактерии (Jensen, 1975; Atlas et al., 1980) и мицелиальные грибы (Pinholt et al., 1979; Atlas et al., 1980) используют углеводороды нефти и нефтепродуктов, в результате чего увеличивается их численность. Сонг и его группа (Song et al., 1986) провели сравнительное исследование углеводороддеградирующих бактерий и грибов в почве и обнаружили, что 82% минерализации н-гексадекана в грунте осуществляется бактериями и только 13% - грибами.
Почвы различных почвенно-климатических зон земного шара очень богаты углеводородокисляющими псевдомонадами. Из почв нефтяных месторождений Западной Украины выделены нафталинусваивающие бактерии, представленные в основном видами рода Pseudomonas: Р. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. boreopolis; штаммы обладают строгой специфичностью по отношению к нафталину как единственному источнику углеродного питания (Квасников и др., 1974). Углеводородокисляющие родококки обнаруживаются почти во всех типах почв как широтной, так и вертикальной зональности (Головлев, 1983; Нестеренко и др., 1985) и доминируют в почвах высокогорий, примитивных и парующих почвах (Умаров, 1972).
Отмечается, что в почвах, богатых органическим веществом (черноземах, каштановых), численность бактерий рода Arthrobacter невелика (Сорокина и др., 1983); они доминируют в почвах, бедных органическим веществом - примитивных высокогорных, а также в песках и горных породах. Бактерии рода Arthrobacter обнаружены во всех типах почв подзоны арктических тундр (Умаров, 1972; Квасников, Писарчук, 1980). Эти микроорганизмы составляют в песчаных почвах до 60%, в глинистых - до 90% общего числа почвенных бактерий.
Распространение углеводородокисляющих микроорганизмов в водных экосистемах.
Углеводородокисляющие микроорганизмы (бактерии, мицеллиальные грибы и цианобактерии) также широко распространены в водной среде (Leahy, Collwell, 1990; Siron etal., 1995; Raghukumaret al., 2001). В водных экосистемах среди углеводородокисляющих агентов доминирующую роль занимают бактерии. Микроскопические углеводородокисляющие грибы оказываются в незначительном положении среди морской микробиоты, однако количество их увеличивается при приближении к прибрежной зоне и в донных отложениях (Pugh, 1974; Floodgade, 1984; Kirk, Cordon, 1988; Delille et al., 1998). Мицелиальные грибы встречаются в стоячих водоемах, в поверхностной пленке воды, на остатках водорослей (Ahearn, Crow, 1986). Активно способны окислять углеводороды обитатели водных экосистем родов Rhodococcus, Corynebacterium, Nocardia, Brevibacterium, Flavobacterium, Arthrobacter, Acinetobacter. Наиболее активные деструкторы нефти относятся к роду Rhodococcus, который является широко распространенным и стабильным компонентом углеводородокисляющих бактериоценозов различных водных экосистем - пресных и соленых, полярных и тропических (Нестеренко, 1982; Espeche et al., 1994; Коронелли и др., 1994; Delille, Delille, 2000). Отмечается, что в нефтезагрязненных водах Персидского залива доминирующая роль среди бактерий принадлежит представителям этого рода. Солеустойчивость некоторых родококков (R. luteus, R. maris) позволяет им развиваться в пластовых рассолах с общей соленостью до 250 г/л (Бердичевская, 1983), в воде и илах соленых лиманов (R. ruber) и в глубинных слоях (до 200 м) арктических морей (Гусев и др., 1978; Нестеренко, 1982). Артробактерии обнаруживаются в пресной и морской воде (Коронелли и др., 1978), сточных водах, горячих источниках, активном иле, озерных отложениях. Из нефтяной пленки, собранной у побережья Финского залива, выделены нефтеокисляющие Mycobacterium mucosum, М. hyalinum, М. convolutum (Коронелли и др., 1978). Среди бактерий, окисляющих углеводороды нефти, в реках и водоемах обнаружены представители рода Pseudomonas (Гавришева, 1969). В поверхностной пленке Черного моря доминируют представители родов Mycobacterium и Pseudomonas, активно использующие нефть (Красильников и др. 1972). Из донных отложений Черного моря, содержащих нефтепродукты, выделены бактерии родов Acinetobacter, Brevibacterium, Micrococcus, Rhodococcus, Pseudomonas (Квасников, Клюшникова, 1981).
В литературе представлены лишь единичные сведения о способности водорослей утилизировать нефть. Водоросли Profotheca zopfi способны утилизировать сырую нефть, причем их активность по отношению к н- и изо-алканам и ароматическим углеводородам довольна высока (Walker et al., 1975). Показано (Cerniglia, Gibson, 1980; Narro et. al., 1992), что 9 цианобактерий, 5 зеленых водорослей, 1 вид красных водорослей, 1 вид коричневых водорослей и 2 вида диатомовых водорослей могут окислять нафталин.
Таким образом, в природных средах присутствуют многочисленные и разнообразные группы микроорганизмов, утилизирующие нефтяные углеводороды. В целом использование углеводородов не может рассматриваться как уникальное свойство, присущее лишь узкому кругу специфических в этом отношении микроорганизмов. Углеводородокисляющие микроорганизмы потребляют и другие источники углерода: углеводы, спирты, сахара, жирные кислоты и некоторые другие соединения (Коронелли, 1984; Милько, Егоров, 1991; Барышникова и др., 2001).
Выделение чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов из накопительной культуры
При идентификации выделенных нами микроорганизмов использовали следующие методики и тесты: дифференциация бактерий при окрашивании по Граму, без окрашивания (с использованием 3% КОН); подвижность клеток, тест на оксидазу, каталазу, дезаминирование фенилаланина, способность к скользящему движению (Добровольская и др., 1990, Егоров, 1995, Hold, 1994). Тест на наличие каротиноидов у бактерий рода Cvtophapa.
При обработке щелочью (20% раствор КОН) клеточной массы, окрашенной в желтый или оранжевый цвет, образующийся за счет клеточных каротиноидов, флексирубин-подобных пигментов или и тех и других, колонии обратимо меняли свой цвет с желтого на пурпурно- или красно-коричневый (Берджи, 1997). Определение типа клеточной стенки. Определение аминокислотного состава пептидогликана клеточной стенки (Наумова, Белозерский, 1966)
Сырую биомассу, отмытую холодной дистиллированной водой, разводили водой в соотношении 1:1 и разрушали клетки с помощью ультразвука на приборе УЗДН в течение 4-6 мин (2-3 раза по 2 мин при частоте колебаний 16-20 кгц) охлаждая суспензию во льду в промежутках между импульсами. Неразрушенные клетки отделяли центрифугированием при 3000 об/мин. Осадок отбрасывали. Из супернатанта при 16000 об/мин осаждали клеточную стенку. Осадок разделялся на два слоя: нижняя часть - примесь неразрушенных клеток, верхняя - светлый рыхлый слой - клеточные стенки. Собирали верхний рыхлый слой и лиофильно высушивали. К препарату нативных клеточных стенок добавляли 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (в соотношении 1:10) и полученную взвесь перемешивали при 4С в
течение 24 ч. Осадок отделяли, подсушивали ацетоном. К 40 мг остатка клеточной стенки добавляли 10 мл раствора трипсина (1 мг/мл) в трис-НСІ-буфере (рН 7,85). Смесь инкубировали 20 ч при 37С при перемешивании; фермент отмывали тем же буфером. К остаткам стенки добавляли 2%-ный раствор додецилсульфата натрия (DDS) и нагревали 5 мин при 100С, DDS многократно отмывали дистиллированной водой. Отмытый препарат пептидогликана лиофильно высушивали. Аминокислотный состав пептидогликана определяли на аминокислотном анализаторе после гидролиза 6н HCI в течение 18 ч при 105С по методике Стрешинской и др. (1979). Тип пептидогликана определяли на основании анализа количественного соотношения аминокислот пептидной части пептидогликана по методу Шлайфера и Кандлера (Schleifer, Kandler, 1972). Обнаружение миколовых кислот коринеподобных бактерий (Minnikin et al., 1975).
Сухую (высушенную на воздухе или лиофилизированную) биомассу в количестве 100 мг смешивали с безводным метанолом (5 мл), толуолом (5 мл) и концентрированной H2SO4 (0,2 мл) в 20 мл пробирках с притертыми пробками. Содержимое пробирок перемешивали. Метанолиз проводили в течение 12-16 ч при 75Са. сушильном шкафу. Смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 2 мл гексана, встряхивали и давали отстояться. Из верхнего гексанового слоя наносили образцы по 50-60 мкл на пластинки силикагеля -Merck silica gel Н (0,5 мм) или «Silufol» (ЧССР), и хроматографировали в системе растворителей петролейный эфир: диэтиловый эфир (85:15). Положение отдельных компонентов определяли после нагревания пластинок, обработанных раствором бихромата калия (5 г К2Сг207 растворяли в 5 мл Н20, доводили объем до 100 мл концентрированной H2SO4, затем разбавляли раствор в 10 раз дистиллированной водой), при 150-200С. Изучение межклеточного матрикса бактерий рода Cvtophaaa.
Бактерии выращивали агаризованной среде Чапека-Докса с сахарозой в течение суток. Биомассу смывали физраствором, интенсивно встряхивали в течение 5 мин. и центрифугировали при 39000 об/мин. 30 минут. Супернатант диализовали и исследовали следующим образом: белок определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), полисахариды - реакцией с цетилпиридиниихлоридом (Кочетков, 1967) и фенол-серным методом (Dubois et al., 1956).
Рост бактерий учитывали по количеству белка биомассы. Клетки отмывали от среды 1% HCI и гидролизовали в 1 н. NaOH 4 ч при 37С. В супернатанте, полученном после центрифугирования гидролизатов в течение 20 минут при 17000 д, определяли белок по методу Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта (Lowry et al., 1951).
выделенных углеводородокисляющих микроорганизмов при разных температурах
Культивирование при разных температурных режимах позволило отнести большинство из выделенных нами углеводородокисляющих микроорганизмов к психроактивным видам. Психроактивные организмы приспособлены к сезонным колебаниям климата, в теплый период они накапливают биомассу, но продолжают развиваться и в холодное время, когда активность других микроорганизмов снижена.
К психроактивным микроорганизмам относятся все выделенные нами из нефтезагрязненных почв Усинского района Республики Коми штаммы рода Cytophaga. Оптимальной температурой для роста была 18С, штаммы удовлетворительно развивались при 30С, и что важно, являлись активными при 6С. Развития при 37С не наблюдалось (табл. 6). При этом следует отметить, что рост на средах с сырой нефтью накопительных культур, из которых мы в дальнейшем выделяли чистые культуры рода Cytophaga, при 6С гораздо активнее, чем рост чистых культур, и сравним с развитием накопительных культур при 18С.
Природные катастрофы, приводящие к загрязнению окружающей среды и, прежде всего почвы, редко происходят с индивидуальными углеводородами. Чаще всего случаются разливы нефти или нефтепродуктов. Поэтому совершенно естественным было проверить способность выделенных микроорганизмов к окислению различных потенциальных загрязнителей -керосина, дизельного топлива, солярового масла.
Следующие рисунки (рис. 4-7) иллюстрируют процесс динамики роста углеводородокисляющих микроорганизмов в жидких минеральных средах с различными видами топлива (соляровом масле, дизельном топливе и керосине) - в качестве единственного источника углерода и энергии. Во время развития углеводородокисляющих бактерий на средах с нефтепродуктами максимальное накопление белка (соответственно и биомассы) происходит на 7 сутки у бактерий рода Rhodococcus (количество белка биомассы составляет 3,2 г/л) - на минеральной среде с керосином (рис.4), на 8 сутки у бактерий рода Mycobacterium (около 2 г/л белка биомассы) - на среде с дизельным топливом (рис. 7) и на 11 сутки у штамма Pseudomonas sp. и Arthrobacter sp. - на средах с дизельным топливом (рис. 5) и соляровым маслом (рис. 6), соответственно.
Клетки выделенных нами штаммов накапливают значительную биомассу (1,6-3,2 г/л по белку, что соответствует примерно 3-6 г/л абсолютно сухой биомассы). Это является показателем активной деструкции углеводородов в процессе роста на средах, где единственным источником углерода были фракции нефти.
Взяв за критерий фактор накопления белка биомассы разными штаммами Cytophaga в жидких культурах при 6С на разных субстратах, был проведен подбор оптимальной культуры для деструкции определенного субстрата (рис. 8). Таким образом, можно отметить, что из выделенных нами микроорганизмов рода Cytophaga для деструкции сырой нефти при пониженной температуре (6С) в большей степени подходят штаммы С. agarovorans Д5-2, С. agarovorans М1, С. agarovorans М27; С. uliginosa М7-1; для деструкции солярового масла - С. agarovorans Д5, С. agarovorans М29; С. uliginosa Д32-1, С. uliginosa М16-1, С. uliginosa М21-1-2; дизельного топлива - С. agarovorans Д2; керосина - С. agarovorans М4; С. uliginosa Д12-2, С. uliginosa Д9-2.
Биодеструкцию нефтяных углеводородов под воздействием углеводородокисляющих микроорганизмов оценивали по изменению содержания алифатических и ароматических углеводородов, а также смол.
Потребление различных фракций нефти или нефтепродуктов (керосина, дизельного топлива, солярового масла) определяли методом колоночной жидкостно-адсорбционнои хроматографии с использованием двойного минерального сорбента (Карпову и др. 1998, в собственной модификации). Собранные после экстракции отдельные фракции (алифатическая фракция легких ароматических углеводородов, тяжелых и полициклических ароматических углеводородов и фракция смол) анализировали на УФ-спектрофотометре в области 200-370 нм.
Одним из недостатков метода с использованием растворителей является их способность экстрагировать не только нефтепродукты, но и липидные компоненты биомассы, что теоретически может приводить к завышенной оценке содержания остаточных нефтепродуктов (например, в случае накопления значительной биомассы микроорганизмов на фоне низких концентраций углеводородов). Однако контрольные эксперименты показали, что в условиях анализа из культуральной жидкости микроорганизмов, выращенных на синтетической среде в отсутствие нефтепродуктов, растворителями экстрагируется органического материала не более 0,1 мг/мл, т.е. вклад побочных продуктов составляет не более 0,5 % от содержания нефтепродуктов в модельных экспериментах. Это подтверждают и литературные данные (Барышникова и др, 2001).
