Введение к работе
Актуальность проблемы
Широкомасштабные добыча и использование нефти и нефтепродуктов в России сделали их приоритетными загрязнителями окружающей среды не только в нашей стране, но и за рубежом (Государственный доклад…, 2011). Попадая в окружающую среду, нефтяные углеводороды оказывают выраженное воздействие на все компоненты экосистемы (Иваненко, 2006). Среди них растения и микроорганизмы – продуценты и редуценты – заслуживают особое внимание, т.к. представляют собой базовые природные системы синтеза и разложения органических соединений. Процессы аккумуляции, трансформации и деградации нефтяных углеводородов растениями и микроорганизмами активно изучаются в последнее время как для оценки риска и предотвращения попадания токсикантов в пищевые цепи, так и с целью поиска природных механизмов детоксикации и деградации антропогенных загрязнителей. Результатами этих исследований стали, с одной стороны, выделение штаммов микроорганизмов-деструкторов, описание путей микробного катаболизма углеводородов (Van Hamme, 2003; Head et al., 2006), а с другой – характеристика метаболизма некоторых углеводородов в растениях (Kvesitadze et al., 2009).
Микробная деградация углеводородов составляет основу современной технологии биоремедиации (биоаугментации) нефтезагрязненных объектов окружающей среды (Sarkar 2005; Trindade 2005). Однако за годы практического использования этой биотехнологии выявился ряд ее недостатков, связанных с вытеснением аборигенной микрофлорой интродуцированных микроорганизмов-деструкторов, опасностью интродукции как таковой (т.е. введением в природные экосистемы селекционированных микроорганизмов, включая генетически модифицированных), а также высокой стоимостью процесса обработки загрязненных объектов, особенно на значительных площадях.
Выявление эффекта повышенной биодеградации поллютантов в корневой зоне послужило поводом объединения усилий физиологов растений и микробиологов в разработке биотехнологии фиторемедиации – использования растений и ассоциированных с ними микроорганизмов для очистки окружающей среды (Gunther et al., 1996; Reynolds, Wolf, 1999; Hutchinson et al., 2001; Merkl et al., 2005; Kechavarzi et al., 2007; Wang et al., 2012; Karthikeyan et al., 2012). Растительно-микробные ассоциации и симбиозы, обладающие гибким метаболизмом и уникальными ферментными системами, имеют большие преимущества при выживании в неблагоприятных условиях окружающей среды, обусловленные не только повышенной толерантностью к ксенобиотикам, но и способностью к активному удалению токсикантов из сферы обитания.
Преимущества фиторемедиации как экономически выгодной, экологически безопасной и эстетически привлекательной биотехнологии восстановления загрязненных территорий in situ показаны многими исследователями (Chaudhry et al., 2005; Pilon-Smits, 2005; Gerhardt et al., 2009), но ее научные основы до сих пор изучены недостаточно. В частности, не понятно, почему одни виды растений стимулируют элиминацию углеводородов из почвы, а другие – нет; как растения в своей корневой зоне формируют микробное сообщество, активно разрушающее загрязнитель; какова роль в деградации поллютанта микроорганизмов, тесно ассоциированных с корневой зоной растений; как инокуляция растений стимулирующими их рост микроорганизмами-деструкторами способствует очистке почвы; участвуют ли непосредственно растения в ризосферной деградации углеводородов. Кроме того, особенностью фиторемедиации является ее сайт-специфичность, т.е. использование растений в одних почвенно-климатических условиях не гарантирует их успешного применения в других. Поэтому расширение спектра растительных видов-фиторемедиантов и выяснение закономерностей самого процесса являются основой успешного распространения и применения этой экологической биотехнологии. Предпринятые нами научные исследования растительно-микробных ассоциаций в условиях углеводородного загрязнения основаны на убежденности в перспективности фиторемедиации, направлены на выяснение ее механизмов и могут послужить фундаментом для решения новых задач в биотехнологии.
Цель работы: охарактеризовать адаптационный и деструктивный потенциал партнеров растительно-микробных ассоциаций в отношении нефтяных углеводородов и разработать способ фиторемедиации загрязненных почв.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
Исследовать эколого-функциональные реакции ассоциированных с растениями ризосферных микробных сообществ на загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами.
-
Провести скрининг микроорганизмов, выделенных из корневой зоны растений, по проявлению способности к деградации нефтяных углеводородов, в том числе полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Охарактеризовать деструктивную активность отобранных штаммов.
-
Изучить пути микробной деградации фенантрена у штамма ризосферной бактерии Ensifer meliloti P221
-
Изучить физиологические и биохимические реакции растений на стресс, связанный с присутствием в среде углеводородов, оценивая воздействие загрязнителя на рост, развитие и фотосинтетический аппарат растений, изменение корневой экссудации, эндогенной и экзогенной ферментативной активности.
-
Определить возможность участия растения в ризосферной деградации углеводородов посредством изучения ферментативной активности корней и корневых экссудатов по отношению к ПАУ и их производным.
-
Исследовать выделенные штаммы микроорганизмов на наличие признаков, характерных для стимулирующих рост растений ризобактерий (PGPR): азотфиксацию, синтез фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), продукцию фермента 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат-деаминазы (АЦК-деаминазы) и колонизацию корней. Оценить влияние углеводородов на проявление этих свойств.
-
В вегетационных опытах охарактеризовать влияние бактеризации отобранными штаммами на рост, развитие и корневую экссудацию растения, оценить приживаемость инокулянта в его корневой зоне.
-
На основе созданных растительно-микробных ассоциаций разработать и апробировать способ фиторемедиации загрязненного углеводородами грунта.
Научная новизна
Впервые выявлена и охарактеризована деструктивная активность в отношении углеводородов у типичных представителей ассоциативной микрофлоры корневой зоны растений – азоспирилл. На примере штамма Azospirillum brasilense SR80 показано разрушение сырой нефти.
Впервые для представителей рода Ensifer на примере штамма E. meliloti P221 показана биодеградация фенантрена по пути окисления центрального ароматического кольца с образованием 9,10-дигидро-9,10-дигидроксифенантрена и 9,10-фенантренхинона.
Впервые на примере трехкольцевого ПАУ фенантрена и сорго веничного (Sorghum bicolor) проведено исследование влияния углеводородов на корневую экссудацию растения. Показано, что присутствие в грунте фенантрена в концентрации 0,01 г/кг стимулировало экссудацию корнями свободных сахаров (мальтозы), не оказывая существенного влияния на количество выделяемых карбоновых кислот, аминокислот и снижая выделение белковых соединений. В концентрации 0,1 г/кг фенантрен значительно ингибировал развитие корневой системы растения, что приводило к отчетливому сокращению количества выделяемых карбоновых кислот, свободных сахаров и аминокислот, а также белков. В исследованных концентрациях фенантрен не оказывал влияния на качественный состав корневых экссудатов и на интенсивность их выделения.
Впервые показано окисление ПАУ и их микробных метаболитов корневыми экссудатами и экстрактами корней растений, что доказывает участие растительных оксидоредуктаз в ризосферной деградации углеводородов ароматического ряда и указывает на возможность сопряженного растительно-микробного метаболизма загрязнителей в ризосфере.
Получены оригинальные данные о влиянии углеводородных поллютантов (сырой нефти и ПАУ) на проявление ассоциативных свойств ризобактерий (хемотаксис, колонизацию корней) и стимулирующую рост растений активность, связанную с синтезом фитогормона ИУК.
Получены приоритетные данные о влиянии PGPR-деструктора углеводородов на корневую экссудацию растения, его рост и развитие в зависимости от присутствия в среде углеводородного загрязнителя.
Установлено, что сорго веничное селективно поддерживает популяцию штамма-интродуцента E. meliloti P221 как в стерилизованном, так и в открытом грунте, загрязненном углеводородами.
Практическая значимость
Создана коллекция ризосферных штаммов-деструкторов углеводородов, включая ПАУ, которые служат объектами для изучения микробного метаболизма этих соединений, а также используются для отработки приемов биорекультивации и фиторемедиации загрязненного грунта.
Охарактеризован штамм бактерий E. meliloti P221, обладающий способностью к деградации ПАУ и проявляющий стимулирующую рост растений активность; разработан способ его использования для улучшения роста растений, применяемых в фиторемедиации загрязненного углеводородами грунта, и интенсификации очистки (Патент РФ № 2406758).
Охарактеризован штамм бактерий Mycobacterium sp. N7, обладающий способностью подвергать деградации углеводороды и проявляющий устойчивость к тяжелым металлам, который представляется перспективным для использования в биоремедиации комплексного загрязнения грунта углеводородами и тяжелыми металлами.
Обосновано использование растительно-микробных ассоциаций на основе следующих растений для очистки почвы: от нефтешлама – рожь озимая (Secale cereale), райграс пастбищный (Lolium perenne) и люцерна посевная (Medicago sativa) и дизельного топлива – рожь озимая (Secale cereale), кукуруза обыкновенная (Zea mays) и сорго веничное (Sorghum bicolor). Указанные растительные виды обладают устойчивостью к углеводородному загрязнению среды, способностью формировать и поддерживать в своей ризосфере эффективные микробные популяции и снижать концентрацию поллютанта в почве.
Отработаны приемы фиторемедации, обеспечивающие максимальную эффективность очистки почвы от углеводородов. Разработан и апробирован способ фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами (Патент РФ № 2403102).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Эколого-функциональные реакции ассоциированных с растениями ризосферных микробных сообществ на загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами проявляются в увеличении общей численности почвенных микроорганизмов, в том числе деструкторов, и поддержании большей устойчивости физиологической структуры микробоценоза ризосферы растений по сравнению с почвой без растительности.
-
Создана коллекция ризосферных микроорганизмов-деструкторов углеводородов, среди которых перспективными для использования в технологиях био- и фиторемедиации являются: штамм Mycobacterium sp. N7, способный подвергать деградации углеводороды и проявляющий устойчивость к тяжелым металлам, штаммы A. brasilense SR80 и E. meliloti P221, наряду со способностью к деградации углеводородов проявляющие стимулирующую рост растений активность.
-
Деградация фенантрена ризосферным штаммом E. meliloti P221 происходит по двум параллельным путям: (а) через расщепление терминального ароматического кольца (предположительно по связи С3-С4) с образованием бензокумарина и 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты; (б) через окисление центрального ароматического кольца по связи С9-С10 с образованием 9,10-дигидро-9,10-дигидроксифенантрена и 9,10-фенантренхинона.
-
Углеводородное загрязнение грунта как легкими нефтепродуктами (дизельное топливо), так и тяжелыми нефтяными фракциями (нефтешлам) или ПАУ (на примере фенантрена) оказывает выраженный токсический эффект на физиологические и биохимические параметры растения. Чувствительность растений к токсичности загрязненного углеводородами грунта носит видоспецифичный характер и зависит от типа загрязнителя.
-
Пероксидазы, являющиеся доминирующими окислительными системами, как в тканях, так и в корневых выделениях растений, способны принимать участие в ризосферной деградации ПАУ и их микробных метаболитов.
-
Выявлены растительные виды, селективно поддерживающие популяцию микроорганизмов-деструкторов в своей ризосфере. Основные компоненты корневых экссудатов растений, карбоновые кислоты и углеводы, в зависимости от их вида и концентрации оказывают как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие на интенсивность микробной деградации углеводородов.
-
Влияние микроорганизмов на рост и развитие растений видоспецифично, в значительной степени определяется способностью бактерий синтезировать фитогормон ИУК и зависит от присутствия углеводородного поллютанта, которое не препятствует формированию растительно-микробных ассоциаций.
-
Использование растений целесообразно для очистки почвы от тяжелых нефтяных углеводородов и таких персистентных загрязнителей, как ПАУ. Инокуляция растений PGPR-деструкторами углеводородов улучшает рост растительности и ремедиацию загрязненного грунта.
-
В основе разработанного и апробированного способа фиторемедиации лежит использование растительно-микробных ассоциаций, созданных на основе люцерны посевной, сорго веничного или райграса пастбищного и исследованных штаммов PGPR-деструкторов углеводородов.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на научных мероприятиях различного уровня: 7th International Conference on Contaminated soil (Leipzig, Germany, 2000); ISEB 2001 Meeting “Phytoremediation” (Leipzig, Germany, 2001); Конференция «Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды» (Пущино, 2001); 12th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Prague, Czech Republic, 2002); 3rd International Conference “Oil Pollution: Prevention, Characterization, Clean Technology” (Gdansk, Poland, 2002); International Symposium “Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants” (Saratov, Russia, 2003); Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 117-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Саратов, 2004); 1st Baltic Sea Region Symposium and Postgraduate Course “Agro-Biotechnology Focused on Root-Microbe Systems” (Kaunas, Lithuania, 2005); 13th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Madrid, Spain, 2005); IX международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2005); II международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь-Казань-Пермь, 2005); Всероссийская конференция «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, 2005); Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); International Symposium on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB 2006 (Leipzig, Germany, 2006); Международная научная конференция «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006); I-III региональные конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2002, 2004, 2006); International Conference on Sustainable Agriculture for Food, Bio-energy and Livelihood Security (Jabalpur (M.P.), India, 2007); 3rd International Conference “Enzymes in the Environment: Ecology, Activity, Applications” (Viterbo, Italy, 2007); 4th Symposium on Biosorption and Bioremediation (Prague, Czech Rebublic, 2007); International Conference “Rhizosphere 2” (Montpelier, France, 2007); Всероссийская конференция с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); 14th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Messina, Italy, 2008); Meeting of the Specialist Groups “Desert Ecology” and “Experimental Ecology” of the Society of Ecology (Gf) in Cooperation with German Society of Limnology (DGL) “Plant Life in an Extreme and Changing Environment” (Tharandt, Germany, 2008); I, II, IV и V Московские Международные Конгрессы «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2007, 2009); II и IV Саратовские салоны изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2006, 2009); 15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2011); IV Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); Всероссийский симпозиум «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 65 работ: 27 статей, в том числе 16 – в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК, 36 тезисов сообщений, получено 2 патента РФ.
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на 382 страницах машинописного текста, содержит 65 рисунков, 56 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, заключения, основных выводов, списка литературы, который включает 526 источников, в том числе 438 зарубежных, и 7 страниц приложений.
Работа выполнена в лаборатории экологической биотехнологии (ЛЭБ) ИБФРМ РАН в соответствии с плановой тематикой при непосредственном участии или под руководством автора. Часть исследований, связанная с получением корневых экссудатов, проводилась в сотрудничестве с д-ром Л. Виттенмайером в Институте почвоведения и питания растений при сельскохозяйственном факультете университета Мартина Лютера Галле-Виттенберг (Institut fr Bodenkunde und Pflanzenernhrung Professur Physiologie und Ernhrung der Pflanzen Martin-Luther-Universitt Halle-Wittenberg) г. Галле, Германия. Отдельные эксперименты по фиторемедиации были проведены в сотрудничестве с д-ром Е. Хюбнером и д-ром П. Кушком в Центре исследования окружающей среды (UFZ Centre for Environmental Research Leipzig-Halle) г. Лейпциг, Германия. Исследования метаболизма фенантрена штаммом E. meliloti P221 проводились совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, г. Пущино-на-Оке. Исследования были частично поддержаны грантами Немецкой службы академических обменов (DAAD A/00/06/80, 2000 г.; DAAD Leonhard-Euler-Stipendienprogramm 2003/2004 гг.), Президента РФ № НШ-1529.2003.4, Международного научно-технического центра (ISTC #3419.2, 2008 г.), государственным контрактом № 02.512.11.2210 с Роснаукой в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (2008-2009 гг.).
Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту – заведующей ЛЭБ ИБФРМ РАН д.б.н., профессору О.В. Турковской за многолетнюю помощь и всестороннюю поддержку работы, большую благодарность с.н.с. ЛЭБ к.б.н. Л.В. Панченко за понимание, помощь и поддержку в работе. Искренняя благодарность также сотрудникам ЛЭБ: к.б.н. Е.В. Дубровской, к.б.н. С.Н. Голубеву, к.б.н. А.Д. Бондаренковой за участие в проведении вегетационных опытов, к.х.н. О.Е. Макарову, к.б.н. М.П. Чернышовой и к.б.н. Е.В. Любунь за содействие в проведении химико-аналитических исследований, к.б.н. Н.Н. Поздняковой за помощь при изучении ферментативной активности; сотрудникам лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН д.б.н., профессору Л.Ю. Матора и к.б.н. Г.Л. Бурыгину за помощь в иммунохимической идентификации ре-изолятов, вед. научн. сотруднику лаборатории биохимии д.б.н. Л.П. Антонюк за консультативную поддержку исследований, а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН, способствовавшим успешному выполнению работы.
