Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Проблема нефтяного загрязнения северных территорий
1.2 Роль психрофильных микроорганизмов в разложении нефти при низких температурах
1.3 Биологическая рекультивация загрязненных углеводородами объектов
1.3.1 Интродукция активных деструкторов углеводородов в загрязненные нефтью объекты
1.3.2 Биостимуляция разложения нефтяных углеводородов в почве
1.3.3 Взаимодействие растений и микроорганизмов в процессе ремедиации
Объекты и методы исследований
2.1 Характеристика биопрепаратов, использованных в процессе рекультивации
2.2. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах почв гравиметрическим методом
2.3 Определение агрохимических показателей почв
2.4 Определения фитотоксичности почв
2.5. Выделение культур окисляющих углеводороды микроорганизмов из природных сред
2.6.Методы выращивания и учета микроорганизмов
2.7. Определение длины гиф грибного мицелия методом мембранных фильтров
2.8. Определение антагонистического действия культур микроорганизмов по отношению к фитопатогенным грибам
2.9.Определение окислительной активности микроорганизмов – деструкторов нефти и нефтепродуктов
2.10. Выделение ДНК и определение нуклеотидной последовательности фрагментов гена 16S рРНК штаммов углеводород окисляющих бактерий
2.11. Приготовление модельных почвенных систем
2.12. Полевой опыт по биоремедиации подзолистой торфянистой почвы на участке нефтяного разлива
2.13. Полевой опыт по биоремедиации промышленных отвалов ОАО «Орскнефтеоргсинтез»
2.14. Статистическая обработка экспериментальных данных
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Выделение, описание и идентификация микроорганизмов – деструкторов
3.2. Определение окислительной активности культуры ИБ НД 1 и составляющих ее штаммов по отношению к нефти и дизельному топливу
3.3. Моделирование биорекультивации подзолистой торфянистой почвы при пониженной температуре в лабораторных условиях
3.4. Исследование антагонистической активности штаммов Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 по отношению к микроскопическим грибам
3.5. Биорекультивация почв в лабораторных условиях с применением микроорганизмов, выделяющих биологически активные вещества
3.5.1. Биорекультивация подзолистого грунта при пониженной температуре 64
3.5.2. Биорекультивация чернозема 73
3.6. Полевые испытания биотехнологии рекультивации загрязненных нефтью грунтов на основе консорциума микроорганизмов ИБ НД 1 83
3.6.1. Биологическая рекультивация почвы на месте нефтяного разлива на Мамонтовском месторождении 83
3.6.2. Биологическая рекультивация отработанной отбеливающей земли ОАО «Орскнефтеоргсинтез» 93
3.7. Производство опытных партий биопрепарата «Ленойл»- микостат 100
Заключение 106
Выводы 109
Список использованной литературы 110
- Биологическая рекультивация загрязненных углеводородами объектов
- Определение агрохимических показателей почв
- Определение окислительной активности культуры ИБ НД 1 и составляющих ее штаммов по отношению к нефти и дизельному топливу
- Биологическая рекультивация почвы на месте нефтяного разлива на Мамонтовском месторождении
Биологическая рекультивация загрязненных углеводородами объектов
Адаптированные к холоду углеводород окисляющие микроорганизмы могут разрушать нефтепродукты и ассимилировать продукты их разложения при температурах всего 0C (Whyte et al. 1997, 1998). У психрофильных микроорганизмов степень деструкции нефти при 4-6С может быть даже выше, чем при комнатной температуре. В опытах Пырченковой и др. (2006) степень деструкции нефти наиболее активными психрофильными штаммами в жидкой минеральной среде составляла от 15 до 26% при 24С и от 28 до 47% при 4-6С.
Целью многих исследований является поиск психрофильных микроорганизмов, способных активно разлагать углеводороды при низкой положительной температуре (Пырченкова и др., 2006; Андреева и др., 2007; Филонов и др., 2007; Рубцова и др., 2012).
Наиболее часто активный рост и деструкция углеводородов обнаруживается у представителей родов Rhodococcus и дрожжей. Из загрязненных углеводородами альпийских почв выделено 4 штамма, идентифицированные как Rhodococcus spp. и дрожжи Trichosporon dulcitum и Urediniomycetes spp. (Margesin et al., 2005). Штамм Urediniomycetes spp. был истинных психрофилом с оптимумом роста и утилизации фенола при 10C. Тогда как родококки и Trichosporon dulcitum были скорее психротолерантны, поскольку их оптимумы приходились на 20-30C, хотя были способны расти и активно утилизировать фенол даже при 1C. В более позднем исследовании (Margesin et al., 2013) способность быстро разрушать р-алканы, фенол, пирен и антрацен при температуре 1-20 C обнаружена у штаммов Rhodococcus erythropolis (strain BZ4), Rhodococcus cercidiphyllus (strain BZ22), Arthrobacter sulfureus (strain BZ73) and Pimelobacter simplex (strain BZ91).
Алканы подвергаются биоразложению со скоростью, превосходящей растворение углеводородов в водной фазе, что указывает на использование микроорганизмами и других механизмов поглощения углеводородов (Leahy , Colwell, 1990). Микроорганизмы обладают многими адаптивными механизмами для накопления и транспортировки углеводородов в клетку с целью их ферментативного катаболизма. Углеводороды могут переводиться в жидкую фазу из твердой по крайней мере тремя разными путями: образованием эмульсии из жидких поллютантов, образование мицелл и с помощью облегченного транспорта. Мицеллы представляют собой более мелкие образования по сравнению с каплями гидрофобных эмульсий, и в случае мицелл переход углеводородов в жидкую фазу может осуществляться очень быстро. Однако они будут уступать по своей биодоступности истинно растворимым веществам. Под облегченным транспортом подразумевают разнообразные процессы, такие как взаимодействие единичных молекул поллютанта и сурфактанта, мобилизацию загрязнителя на органической матрице и т.д. (Volkering et al., 1998)
Многие бактерии способны эмульгировать углеводороды посредством синтеза поверхностно-активных агентов, таких как биосурфактанты (Neu, 1996; Desai, Banat, 1997). Введение сурфактантов может оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на биодеструкцию углеводородов. Положительное влияние заключается в увеличении доступности углеводородов для биоокисления. Отрицательное влияние связано с тем, что сурфактанты мешают бактериям прикрепляться к поверхности углеводородных субстратов, уменьшая таким образом скорость их потребления.
Ананько с соавт. (2005) обнаружено, что в экстремальных условиях нарушается баланс между процессом эмульгирования нефти и системой нефтеокисления. Процессы нефтеокисления более устойчивы к понижению температуры, чем процессы эмульгирования субстрата. Половина изученных авторами штаммов-нефтедеструкторов была способна окислять нефть при +5С в присутствии твина-85. Но большинство этих штаммов не были способны сами обеспечить доступность гидрофобного субстрата при низких температурах.
Микроорганизмы могут так же поглощать нерастворимые углеводороды, прикрепляясь к каплям или твердым кусочкам субстрата (Volkering et al., 1998).Чтобы усилить адгезию к нерастворимым соединения бактерии могут увеличивать гидрофобность поверхности клеток, модифицируя компоненты клеточных стенок. Например, при адаптации штаммов Rhodococcus ruber и Rhodococcus opacus к нефтяным углеводородам в колоночном биореакторе повышалась устойчивость бактериальной популяции к углеводородам, сопровождаемая изменением поверхностных свойств клеток (гидрофобности, электрокинетического потенциала), а также содержания клеточных липидов (Серебренникова и др., 2014). Также микробные клетки могут синтезировать внеклеточные полимерные соединения в виде капсул, которые могут взаимодействовать с гидрофобными субстратами (Wolfaardt et al., 1998). Исследования, проведенные Рубцовой с соавт. (2012) показали, что адгезивная активность актинобактерий рода Rhodococcus к н-гексадекану зависит от температуры их культивирования. Предполагаемыми механизмами влияния ростовых условий на адгезию родококков к жидким углеводородам может быть изменение содержания клеточных липидов и зета-потенциала клеток. Whyte et al. (1999) были изучены физиологические механизмы адаптации психрофильного штамма Rhodococcus sp Q15 к деструкции твердых при низкой температуре алканов. Обнаружен синтез связанного с поверхностью клеток биосурфактанта, высокая гидрофобность клеточных стенок и полимерного внеклеточного вещества. Совокупность этих признаков обеспечивала высокую адгезию клеток к углеводородам. Результаты микроскопирования указывали, что этот организм ассимилирует и твердые и жидкие алкановые основания при низкой температуре, придерживаясь алкановой фазы.
Для психрофильных деструкторов углеводородов характерны и универсальные для всех живых организмов механизмы приспособления к жизни при низких температурах. Например, уменьшение степени насыщенности жирных кислот в составе клеточных мембран. Однако, они могут проявляться в меньшей степени или вообще нивелироваться при росте на углеводородах по сравнению с другими субстратами. (Whyte et al., 1999) в связи с тем, что эффект от добавления углеводородов противоположен эффекту, оказываемому низкой температурой, и имитирует изменения, наблюдаемые при росте бактерий в условиях высокой температуры. В этом случае обычно наблюдается увеличение степени насыщенности жирных кислот и превращение цис-изомеров в транс-изомеры. Эти изменения действуют как защитные механизмы против связанной с нефтепродуктами токсичности, делая мембрану менее проницаемую для углеводородов (Heipieper et al., 1992; Sikkema et al., 1995). Наличие в клетках бактерий плазмид может не только обеспечивать утилизацию клетками сложных ароматических углеводородов, но и в целом ускорять процесс утилизации нефти в загрязненной почве. Что было показано Ветровой с соавт. (2007, 2009) в модельных стерильных и нестерильных почвенных системах после интродукции их бесплазмидными микроорганизмами и штаммами, несущими различные плазмиды биодеградации нафталина.
Большое значение в экстремальных условиях приобретает способность разных видов взаимодействовать в процессе разложения нефти. Показано (Филонов и др., 2007), что естественная ассоциация из штаммов Rhodococcus sp. X5, Rhodococcus sp. S67, Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) и Pseudomonas putida BS3701 (pBS1141, pBS1142) более эффективно разрушала нефть при пониженной температуре, чем искусственно составленная в лаборатории ассоциация из штаммов Rhodococcus sp. S25, Rhodococcus sp. Х5, Rhodococcus sp. S67 и Pseudomonas sp. 142NF (pNF142).
Определение агрохимических показателей почв
Степень фитотоксичности загрязненной и рекультивируемой почвы оценивали биотестом с помощью семян тест-растений. Для исследования фитотоксических свойств почв в качестве тест- объектов использовали семена кресс салата (Lepidium sativum) сорта «Курлед» и томатов сорта «Аврора»..
Растертую до пастообразного состояния почву равномерно распределяли по дну чашек Петри. Семена равномерно раскладывали в количестве 30 штук на поверхность уплотненной почвенной пластинки в чашках Петри. После инкубации семян в течение 2-4 дней подсчитывали количество проросших семян и измеряли длнину проростков. Степень фитотоксичности грунта оценивали по числу взошедших семян (в %) и средней длине проростков (Гродзинский, 1991).
Из образцов почвы, загрязненной нефтью в результате промышленных аварий, методом накопительных культур выделяли микроорганизмы, способные использовать нефть в качестве единственного источника углерода. Для этого 1 г почвы помещали в колбы со 100 мл стерильной жидкой минеральной среды Раймонда, куда вносили стерильную нефть в количестве 3 мл. Инкубирование проводили в холодильной камере при температуре 12С при микроскопическом контроле роста микробного сообщества.
Чистые культуры выделяли на агаризованной среде Раймонда, на поверхность которой наносили 100 мкл дизельного топлива. Дифференциацию выросших колоний проводили по культурально-морфологическим признакам. Чистоту выделенных культур определяли общепринятыми методами – микроскопическим контролем и высевом на среду МПА.
С целью идентификации исследовали морфологические, физиологические и биохимические признаки чистых культур, используя общепринятые руководства (Методы общей бактериологии, 1984, Добровольская и др., 1990, The Prokaryotes, 1992, Определитель бактерий Берджи, 1997).
Учет численности физиологических групп микроорганизмов осуществляли методом разведений на следующих питательных средах: микроорганизмов, использующих минеральные формы азота – на крахмал-аммиачной среде, целлюлозоразушающих микроорганизмов – на среде Хетчинсона и Клейтона, микроскопических грибов – на среде Чапека – Докса, углеводородокисляющих бактерий – на средах Диановой-Ворошиловой и Цукамуры. Для выращивания азотфиксаторов применялась среда-40. Для комплексного анализа микрофлоры в почве и выявления аммонификаторов использовали среду МПА (Звягинцев, 1991, Практикум по микробиологии, 2005). Для поддержания и культивирования фитопатогенных грибов использовали агаризованные среды Чапека и агар картофельно-глюкозный, содержащий 20% картофеля, 2% глюкозы 1,5 агара в водопроводной воде, пересевая их один раз в месяц. Чашки с растущими грибами инкубировали при 28С в течение 10 суток, после чего хранили их в холодильнике до следующего пересева.
Идентификацию видов микроскопических грибов проводили по определителям (Литвинов, 1967, Милько, 1974, Пидопличко, 1972, Билай, 1977, Билай, 1988, Watanabe, 200, Алимова, 2005). Видовые названия микроскопических грибов уточняли по пополняемым спискам опубликованных видов в базе данных «Species fungorum» (www.speciesfungorum.org).
Для оценки степени близости комплексов микромицетов анализируемых почвенных образцов использовался коэффициент сходства Серенсена с учетом частоты встречаемости вида: S=2Cmin/(A+B), где А – сумма частот встречаемости микромицетов первого объекта, В - сумма частот встречаемости микромицетов второго объекта, Cmin – сумма минимальных частот встречаемости общих для первого и второго объектов видов микромицетов
Жидкие культуры бактерий для лабораторных модельных опытов выращивали в колбах объемом 250 мл в течении 4-5 суток на шейкере термостатируемом П-5.10-Э5960 (температура 28С, частота вращения 230 об/мин). Жидкие культуры бактерий для полевых испытаний выращивали в модифицированных лабораторных ферментерах АК-210 (СКБ БП, Пущино).
Навеску почвы 0,5 г растирали в ступке резиновым пестиком с небольшим количеством воды до ее гомогенности, помещали в колбу с 500 мл чистой воды, встряхивали на качалке в течение 5 мин и, не отстаивая, фильтровали пробы по 10 мл через мембранные фильтры с диаметром пор 2,5 мкм. Мембранные фильтры высушивали на воздухе и осветляли в эмерсионном масле. На приготовленных таким образом фильтрах измеряли длину гиф в поле зрения микроскопа с помощью окуляр-микрометра. Для каждого образца использовали по три мембранных фильтра, просматривая в каждом по 20 полей зрения. Значения усреднялись и рассчитывались на 1 г почвы.
В чашки Петри с картофельно-глюкозным агаром вносили суспензию спор тест-гриба в количестве 100 мкл. Концентрация гриба составляла не менее 5-10 спор в малом квадрате камеры Горяева. Поверх газона гриба в лунки диаметром 10 мм вносили по 100 мкл бактериальной суспензии и чашки инкубировали в течение 2-4 суток при 280С. Количественная оценка антагонистической активности культур представлена величинами диаметров зон ингибирования роста тест-грибов по результатам пяти повторностей.
Окислительную активность культур определяли по конечному продукту окисления нефтепродуктов, т.е. по выделению углекислого газа.
Культивирование микроорганизмов проводили в колбах объемом 500 мл. В качестве питательной среды использовали 250 мл среды Диановой-Ворошиловой для углеводородокисляющих бактерий с добавлением 1% (2,5 мл) источника углерода и 5 мл трехсуточной культуры с содержанием клеток 1,0108 КОЕ/мл. С помощью компрессора-дозатора со скоростью 520 мл/мин в герметично закрытые колбы подавали стерильный атмосферный воздух. Аэрируемый воздух, прошедший через колбу с микроорганизмами, окисляющим нефтепродукты, улавливали поглотителем углекислого газа, в качестве которого использовали 200 мл 0,1 н. NaOH. Из колб с поглотителем посуточно отбирали аликвоту 10 мл и оттитровывали 0,1 н. HCl. Окислительную активность определяли по количеству образованного углекислого газа, оттитрованного кислотой.
Определение окислительной активности культуры ИБ НД 1 и составляющих ее штаммов по отношению к нефти и дизельному топливу
Проведение эксперимента при температуре 15С и 5С уменьшало способность всех исследованных микроорганизмов к окислению нефтяных углеводородов. Наиболее заметно окислительная активность при температуре 15С и 5С снижалась у штамма Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 и биологического препарата Ленойл. Штамм Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 обладал более выраженными психротолерантными свойствами. Психротолерантность консорциума ИБ НД 1 проявлялось за счет более интенсивного размножения входящего в ее состав штамма Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2.
Количество микроорганизмов, накопленных в культуральной жидкости в результате размножения за счет утилизации углеводородов, было различно для разных вариантов опыта (табл. 3). Титр микроорганизмов в колбах с Ленойлом, исследуемой консорциумом и отдельными штаммами был сопоставим при комнатной температуре. При низкой температуре титр родококков был выше, чем у биопрепарата Ленойл, что согласуется с данными об их окислительной активности. Выше была численность и у штамма Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 не смотря на то, что при температуре 5С его окислительная активность была невысокой.
В лабораторном эксперименте дизельное топливо окислялось микроорганизмами, в целом, менее активно, чем товарная нефть (табл. 4). При температуре 20С и 25С большим потенциалом в этом отношении обладали бактерии штамма ИБ НД 1.1 Однако с понижением температуры их активность значительно падала и лучшие результаты были получены для штамма ИБ НД 1.2. По сравнению с биопрепаратом Ленойл консорциум и его компоненты более активно окисляли дизельное топливо. Численность окисляющих углеводороды микроорганизмов в разных вариантах опыта не вполне соответствовало их окислительной активности (табл. 5). Численность микроорганизмов биопрепарата Ленойл при температуре 15-25С была не ниже численности родококков и псевдомонад. При температуре 5С проявлявший более высокую окислительную активность штамм Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 достигал меньшей численности, чем менее активный штамм Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 Возможно, при пониженной температуре углеводороды подвергались неполному окислению штаммом ИБ НД 1.1 или полученные жирные кислоты включались в состав микробных липидов.
Таким образом, консорциум ИБ НД 1 по своей способности к окислению товарной нефти и дизельного топлива не уступает или превосходит коммерческий биопрепарат Ленойл. Входящие в ее состав штаммы микроорганизмов проявляют субстратную специфичность. Штамм Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2, по-видимому, психротолерантный и может быть использован для деструкции нефти в условиях низких температур.
Моделирование биорекультивации подзолистой торфянистой почвы при пониженной температуре в лабораторных условиях
Была проанализирована динамика остаточного содержания углеводородов в загрязненной нефтью подзолистой торфянистой почве после интродукции в нее изучаемых микроорганизмов при температуре 14С. Уменьшение содержания углеводородов зафиксировано как в вариантах опыта с внесением биологических препаратов, так и без их использования, по-видимому, за счет деятельности аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов (рис. 3). Положительный эффект проявлялся уже в первые 15 суток инкубации. Значимых отличий в остаточном содержании нефти между вариантами опыта с Ленойлом и консорциумом ИБ НД 1 при 8% и 16% загрязнении обнаружено не было. Наибольшая скорость удаления углеводородов из грунта, загрязненного нефтью в концентрации 8%, наблюдалась до 30 суток, а при 16% загрязнении – с 30 по 60 сутки. В незагрязненном грунте численность окисляющих углеводороды микроорганизмов колебалась от 2,2105 КОЕ/г до 8105 КОЕ/г, в загрязненном грунте составляла порядка 107 КОЕ/г (табл. 6). Однако средняя скорость разложения нефти в почве с участием биопрепаратов была выше, чем с участием аборигенной микробиоты. Это указывает на более высокий потенциал биологических препаратов по сравнению с аборигенными микроорганизмами. Численность аборигенных деструкторов углеводородов на 90 сутки незначительно снижалась, тогда как титр деструкторов углеводородов в вариантах с биопрепаратами оставался на прежнем уровне. Возможно, это связано с их лучшей обеспеченностью биогенными элементами, которые попадали в грунт вместе с культуральной жидкостью. Было показано, что в процессе культивирования грунта в нем менялось соотношение гетеротрофных и углеводород окисляющих микроорганизмов (табл. 7). На 60 сутки эксперимента численность гетеротрофных микроорганизмов в грунте была высокой и составляла порядка 109 КОЕ/г. Рис. 3. Остаточное содержание углеводородов в загрязненной подзолистой торфянистой почве
На 90 сутки она становилась ниже и приближалась к численности окисляющих углеводороды бактерий. Таким образом, нефтедеструкторы становились доминирующими в загрязненной и рекультивированной почве. Концентрация нефти и введение биопрепаратов существенного влияния на численность гетеротрофов не оказывали.
Грибы – ведущие деструкторы растительного опада. Они продуцируют широкий спектр экзоферментов и имеют развитую мицелиальную сеть в почвах, обладают высокой линейной скоростью роста, способны развиваться при низких температурах вплоть до отрицательных, благодаря чему оказывают большое влияние на формирование и функционирование наземных экосистем, в том числе почвенных экосистем Севера (Хабибуллина, 2009). Определение численности микроскопических грибов показало ее увеличение в вариантах опыта с загрязнением нефтью 8% и 16% по сравнению с незагрязненным контролем, где она составила (1,0±0,3)104 КОЕ/г через 60 суток и (5,3±0,4)103 КОЕ/г через 90 суток (табл. 8). Введение биологических препаратов в почву в аналогичных вариантах опыта, напротив, способствовало уменьшению численности микроскопических грибов по сравнению с загрязненным грунтом. Нефть в концентрации 4% не оказывала достоверного влияния на показатель численности микромицетов как в вариантах с биопрепаратами, так и без их применения. Наблюдаемые результаты, возможно, объясняются возникновением конкурентных взаимоотношений между активно размножающимися углеводород окисляющими микроорганизмами и доминирующими в вариантах с 8% и 16% загрязнении микроскопическими грибами.
Через три месяца инкубации в образцах почвогрунта был определен и проанализирован видовой состав микроскопических грибов как индикатор экологического состояния почв. Всего было выделено и идентифицировано 56 изолятов микроскопических грибов, относящихся к 9 родам (табл. 9).. Для незагрязненного грунта были характерны представители родов Chrysosporium, Cladosporium, Hyphoderma, Penicillium, Paecilomyces.
Биологическая рекультивация почвы на месте нефтяного разлива на Мамонтовском месторождении
Местом проведения работ была территория отвалов ОАО «Орскнефтеоргсинтез». Площадка, где складируются отвалы отработанной отбеливающей глины расположена в 2,5 км северо-западнее поселка Победа, на территории совхоза «Первомайский» Гайского района, между существующими накопителями технических жидкостей производственных отходов заводов «Синтетического спирта» (на севере) и «Орскнефтеоргсинтез» (на юго - востоке), представляет собой дополнительно отчужденные огражденные территории, площадью 6 га. Площадь, отведенная под неутилизируемые отходы, содержащие сырую нефть и нефтепродукты, составляет 13,5 га, а общая площадь промсвалки – 35,4 га. В климатическом отношении рассматриваемый район относится к степной зоне Южного Урала. Климат района континентальный, засушливый. Основными чертами являются: холодная зима, жаркое сухое лето, короткий весенний период с быстрым переходом от весны к лету.
Рекультивируемый субстрат (отбеливающая земля) до недавнего времени использовался на предприятии для контактной доочистки масел. Отработанная отбеливающая земля насыщена устойчивыми к химическому и биологическому разложению полициклическими ароматическими углеводородами и смолистыми соединениями. Загрязненная отбеливающая земля является техногенным субстратом, который не обладает полифункциональным комплексом микроорганизмов, характерных для почвенных экосистем, и не содержит необходимого для активного развития микроорганизмов набора питательных элементов. В связи с этим процесс ее самоочищения протекает крайне медленно и может исчисляться десятилетиями.
Технология биоремедиации отработанной отбеливающей земли, очевидно, должна включать в себя комплекс мероприятий, направленных на решение описанных выше проблем. На основе предварительных экспериментов для первого этапа рекультивации была предложена следующая схема. Двукратная с интервалом полтора месяца интродукция специализированных углеводородокисляющих микроорганизмов, которая сопровождается двукратным внесением в почву полного минерального удобрения (NPK) в количестве 40 г/м2 для поддержания жизнедеятельности интродуцированных микроорганизмов. Рыхление грунта после внесения в него микроорганизмов и удобрения для обеспечения доступа кислорода к загрязнителю. Отслеживание влажности субстрата и поддержание ее на уровне 60%. Длительность первого этапа рекультивации чаще всего составляет один вегетационный сезон. На следующий вегетационный сезон в грунт вносится органический компост и высеивается травосмесь.
Окисляющий углеводороды консорциум ИБ НД 1 и отдельно входящие в его состав бактериальные штаммы были испытаны в качестве микробиологической составляющей данной технологии. В качестве биопрепарата для сравнения был использован Ленойл, который уже в течение более чем 5 лет успешно используется для рекультивации отбеливающей земли в промышленных масштабах. Суспензии живых микроорганизмов вносились в грунт дважды: 26.06.2013 и 09.08.2013. Каждую делянку площадью 9 м2 обрабатывали 10 л суспензии биопрепарата или жидкой культуры микроорганизмов с титром 108 КОЕ/мл.
Первый из выбранных участков характеризовался невысоким содержанием углеводородов и их относительно равномерным распределением по поверхности участка. На контрольных участках без рекультивации разложение разложения нефтепродуктов почти не наблюдалось.
Мониторинг остаточного содержания углеводородов в рекультивированном грунте показал постепенное их удаление (табл. 31). С 10.07.13 по 13.11.13 на делянках, обработанных консорциумом ИБ НД 1, в среднем потеря углеводородов составила 23,7 г/кг. На делянках, обработанных Ленойлом, - 19,7 г/кг. Наблюдалась небольшая неравномерность в удалении углеводородов их отбеливающей земли по времени: скорость была выше после первой обработки и в осенние месяцы.
Несколько худшие результаты по сравнению с использованием консорциума ИБ НД 1 были получены после интродукции в грунт по отдельности штаммов Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2. В первом случае за 4 месяца было удалено 19,3 г/кг нефтепродуктов, во втором – 17,6 г/кг нефтепродуктов. Таким образом, консорциум ИБ НД 1 оказалась способной к разложению стойких ароматических углеводородов и смолистых соединений в открытом грунте. Причем, аналогично с результатами, полученными при биоокислении нефти в лабораторных условиях, консорциум из двух микроорганизмов Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 и Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 был более эффективен, чем каждый из штаммов его составляющих.
С помощью предложенной биотехнологии рекультивации на протяжении всего вегетационного сезона в грунте удалось поддерживать стабильную численность углеводород окисляющих микроорганизмов. Она была по крайней мере на два порядка выше, чем численность аборигенной микробиоты отвалов (табл. 32).
На первом менее загрязненном участке численность деструкторов углеводородов была чуть выше при первом отборе проб через 2 недели после интродукции, затем небольшая часть микроорганизмов погибла, однако численность окисляющих углеводороды микроорганизмов не падала ниже 105 КОЕ/г. Существенных отличий между вариантами с внесением разных культур и штаммов микроорганизмов не наблюдалось.
Положительные результаты от биорекультивации отработанной отбеливающей земли были так же получены на более загрязненном участке (табл. 33). Исходная концентрация нефтепродуктов на нем колебалась от 18% до 25%, деструкции углеводородов в складированных отвалах без рекультивации почти не наблюдалось. Распределение загрязнителя по площади было менее равномерным, чем на первом участке.
Для вариантов биотехнологии с применением разных микроорганизмов были зарегистрированы следующие показатели. Убыль нефтепродуктов за сезон на участках, обработанных консорциумом ИБ НД 1, составила 90 г/кг, штаммом Pseudomonas nitroreducens ИБ НД 1.1 - 56 г/кг, штаммом Rhodococcus sp. ИБ НД 1.2 – 55 г/кг, биопрепаратом Ленойл - 94 г/кг. Скорость удаления нефтепродуктов во всех рекультивированных делянках не изменялась значительно со временем и не замедлялась к концу сезона.
