Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Взаимоотношения в системе «микроорга низмы - лактоферрин организма человека» 9
1.1. Роль лактоферрина в гомеостазе организма человека 9
1.2. Антимикробное действие лактоферрина 12
1.3. Адаптация микроорганизмов к действию лактоферрина 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Характеристика культур микроорганизмов 37
2.2. Выделение и идентификация микроорганизмов 38
2.3. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов . 40
2.3.1. Определение протеолитической активности 40 микроорганизмов
2.3.2. Определение факторов персистенции микроорганизмов . 41
2.4. Методы воспроизведения экспериментальной инфекции 43
2.4.1. Метод воспроизведения стафилококковой экспериментальной инфекции 43
2.4.2. Метод воспроизведения интратрахеального заражения
крыс 45
2.5. Методы гистологической обработки материала 46
2.6. Приготовление копрофильтратов и определение в них 46 концентрации лактоферрина
2.7. Статистическая обработка результатов 47
Глава 3. Разработка метода определения анти-лактоферриновой активности микроорганизмов 48
Глава 4. Характеристика антилактоферриновой активности микроорганизмов 58
4.1. Распространенность и выраженность антилактоферриновой активности микроорганизмов 58
4.2. Связь антилактоферриновой активности микроорганизмов с другими биологическими характеристиками 66
Глава 5. Изучение биологической роли антилак тоферриновой активности микроорганимов 70
5.1. Роль антилактоферриновой активности микроорганизмов в развитии экспериментального инфекционного процесса 70
5.2. Морфо-функциональная характеристика тканей макроорганизма при экспериментальной инфекции 81
5.3. Использование показателя антилактоферриновой активности микроорганизмов в клинико-лабораторной практике 92
Заключение 96
Выводы 104
Список литературы 106
Приложения
- Роль лактоферрина в гомеостазе организма человека
- Характеристика культур микроорганизмов
- Разработка метода определения анти-лактоферриновой активности микроорганизмов
- Распространенность и выраженность антилактоферриновой активности микроорганизмов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Лактоферрин - железосвязывающий гликопротеин из семейства транс-ферринов, участвующий в ряде гомеостатических функций организма человека. С начальных этапов изучения лактоферрина не было сомнений в том, что он играет определенную роль в неспецифической защите организма, оказывая как бактериостатическое, так и бактерицидное действие на микроорганизмы. Антимикробное действие лактоферрин оказывает на грамположительные и гра-мотрицательные бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, вирусы. Подробно описаны механизмы антимикробного действия лактоферрина: способность конкурировать с микроорганизмами за ионы железа в среде [182], взаимодействие с клеточной стенкой микроорганизмов, которое приводит к нарушению транспортной функции мембраны [147, 175], протеолитическое расщепление некоторых факторов вирулентности микроорганизмов [132, 203, 133], образование активных производных - лактоферрицинов и лактоферрампина [74, 157]; стимуляция фагоцитоза [181].
В настоящее время известно, что микроорганизмы способны подавлять многие факторы естественной резистентности организма хозяина, такие как ли-зоцим, комплемент, гистоноподобные белки, катионный белок тромбоцитов [10]. Наличие факторов персистенции обеспечивает бактериям длительное нахождение в макроорганизме. Разработка методических приемов микробиологического тестирования персистентного потенциала бактерий позволяет повысить качество диагностики и терапии инфекционных заболеваний.
В то же время, вопрос об адаптации микроорганизмов к антимикробному действию лактоферрина остается в значительной степени не изученным.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось определение способности микроорганизмов к инактивации лактоферрина и оценка биологической роли этого признака.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Разработать метод определения антилактоферриновой активности
микроорганизмов.
2. Определить распространенность и выраженность антилактоферри
новой активности у микроорганизмов различных групп.
3. Оценить биологическую роль антилактоферриновой активности
микроорганизмов.
Научная новизна
Разработан метод определения антилактоферриновой активности (АЛфА) микроорганизмов, основанный на определении остаточного количества лактоферрина в инкубационной смеси с помощью иммуноферментного анализа (патент РФ на изобретение № 2245923). Данный метод позволяет количественно определять АЛфА у широкого круга микроорганизмов, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, сокращает время исследования.
С помощью разработанного метода определена антилактоферриновая активность у стафилококков, стрептококков, энтеробактерий, франциселл, дрож-жеподобных грибов, выделенных из различных биотопов организма человека в норме и при инфекционных заболеваниях. Более половины (60-80%) исследуемых культур микроорганизмов обладали способностью инактивировать лакто-феррин. Установлено, что выраженность и распространенность АЛфА зависит от источника выделения микроорганизмов и формы инфекционного процесса. Высокие значения АЛфА бактерий были выявлены у культур, изолированных
из биотопов с высоким содержанием лактоферрина (репродуктивный тракт), а также при хронических воспалительных заболеваниях и от бактерионосителей.
На модели экспериментальной стафилококковой инфекции определена роль антилактоферринового признака бактерий в феномене их персистенции - длительного переживания возбудителя в организме хозяина. При инфицировании лабораторных животных изогенными клонами Staphylococcus aureus, отличающимися по АЛфА, отмечены более длительные сроки бактериовыделения стафилококков, обладающих данной активностью. Отмечено, что клон с АЛфА вызывает деструктивные изменения в почечной ткани мышей. Определены особенности взаимодействия клонов кишечной палочки, обладающих разным уровнем АЛфА, с клетками организма хозяина. Показано, что микроорганизмы с антилактоферриновой активностью подавляют регенераторные потенции тканей макроорганизма, вызывают деструктивные изменения, что характеризует антилактоферриновый признак как «малый» фактор патогенности.
Выявлено, что система «лактоферрин хозяина - антилактоферриновая активность микроорганизмов» имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования бактерионосительства. Высокий уровень АЛфА сальмонелл и сниженная концентрация лактоферрина в кишечнике в разгар заболевания обуславливают развитие реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства (патент РФ № 2242756).
Научно-практическая ценность
Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах патогенных и условно-патогенных бактерий, способствуют расшифровке патогенеза инфекционных заболеваний, что используется в процессе преподавания раздела «Инфекция и иммунитет» курса медицинской микробиологии Оренбургской государственной медицинской академии.
Практическое значение исследований определяется разработкой метода изучения одного из факторов персистенции микроорганизмов - антилактоферриновой активности. Исследование у культур микроорганизмов персистентного
7 потенциала позволяет прогнозировать переход болезни в хроническую форму, а
также возникновение бактерионосительства.
Разработанный метод также может быть использован для прогнозирования течения инфекционного процесса (в частности, прогнозирования реконва-лесцентного сальмонеллезного бактерионосительства), оценки эффективности терапии гнойно-воспалительных заболеваний.
Полученные материалы использованы в методических рекомендациях МЗ РФ «Прогнозирование тяжести течения и местное лечение острых ограниченных гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры» (Оренбург, 2004).
Положения, выносимые на защиту
Антилактоферриновая активность микроорганизмов широко распространена среди бактерий и грибов различных групп, определяя их адаптацию к многофакторному антимикробному действию лактоферрина.
Антилактоферриновая активность микроорганизмов является одним из факторов персистенции бактерий, способствующим выживанию в организме хозяина.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на:
региональной конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2001; 2003; 2005);
I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003);
IV Всероссийской конференции по персистенции микроорганизмов
5 (Оренбург, 2003);
f - Всероссийской конференции «Здоровое питание населения России»
(- (Москва, 2003);
- научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы
гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург,
2004);
і - научно-практической конференции по медицинской микологии (VII
I Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2004);
- VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005).
Диссертационное исследование является фрагментом научно-
исследовательской работы, проводимой в рамках программы фундаментальных
исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект
«Разработка новых подходов к диагностике и терапии дисбиозов и ассоцииро
ванной с ними инфекционно-воспалительной патологии»), проекта «Антилак-
тоферриновая активность микроорганизмов» (грант РФФИ № 04-04-96162) и
темы «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела
человека» (№ гос. регистрации 01.2.00 104756).
?. Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе: 3 публикации в рецензируемых научных журналах, 2 патента РФ на изобретение, пособие для врачей МЗ РФ.
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложения. Указатель литературы содержит 262 источника литературы, из которых 62 отечественных
) и 200 зарубежных. Текст иллюстрирован 12 таблицами и 24 рисунками. Дис-
) сертация содержит 6 приложений.
(.
Роль лактоферрина в гомеостазе организма человека
Лактоферрин (ЛФ) - железосвязывающий гликопротеин из семейства трансферринов. Впервые лактоферрин был обнаружен в коровьем молоке в 1939 году Sorensen и Sorensen [227], изолирован Crokes и описан как «красный белок» молока коров. Из молока человека лактоферрин был выделен в 1960 году. На данный момент известно, что ЛФ содержится в большинстве экзокрин-ных секретов, а также во вторичных гранулах зрелых нейтрофилов.
Лактоферрин обнаруживают и в тканях животных. К настоящему времени изолирован и исследован лактоферрин молока различных млекопитающих: коров [221], коз, кобыл [222], обезьян, мышей [180], кроликов, свиноматок
ЛФ представляет собой мономерный гликопротеин с молекулярной массой 75 700 ± 500 Да, относится к (3-глобулинам [62]. В его составе около 692 аминокислотных остатков [42]. Лактоферрин по своему строению сходен с другими белками семейства трансферрина. ЛФ содержит 3% гексоз и 1% гексоза-мина, особенно богат маннозой; относится к щелочным белкам, его изоэлек-трическая точка составляет 8,7 [25].
Этот гликопротеин состоит из двух шаровидных долей, N и С. Доли делятся на два домена, N1 и N2, а также С1 и С2. Железосвязывающий сайт расположен между доменами в каждой доле [223]. Молекула лактоферрина связывает два Fe3+ и два Си2+ иона с высоким сродством, причем сродство данного белка к железу в 260 раз выше, чем сродство трансферрина [129]. В центрах связывания, расположенных в каждой из двух долей, железо координационно связано с двумя остатками тирозина, одним - гистидина и одним -аспарагиновой кислоты [25]. Лактоферрин также способен связывать ионы других металлов.
Железосвязывающая способность обуславливает участие ЛФ в обмене железа в организме человека [8]. ЛФ является регулятором концентрации свободных ионов железа в крови и секретах [42]. Показано участие ЛФ в регуляции абсорбции железа в желудочно-кишечном тракте новорожденных в качестве ограничительного фактора абсорбции [97]. Эксперименты in vitro показали, что лактоферрин способен отдавать железо энтероцитам. Участие лактоферрина в абсорбции железа в кишечнике было подтверждено после обнаружения специфических рецепторов к гликопротеину на поверхности щеточной мембраны энтероцитов [107, 217].
До недавнего времени считалось, что ЛФ синтезируется только клетками железистого эпителия, поскольку он регулярно выявлялся в секретах и не был обнаружен в сыворотке. Однако сейчас доказано, что ЛФ содержится и в клетках гемопоэтической ткани (в костном мозге, селезенке, лимфатических узлах) на стадии промиелоцитов и его количество увеличивается в нейтрофильных лейкоцитах по мере их созревания.
Лактоферрин обнаружен в тимусе, секретируется многими эпителиальными клетками, содержится в молоке [32], слюне, бронхиальном секрете [16, 234], слезной жидкости, ликворе, желчи, соке поджелудочной железы, синовиальной жидкости, моче, сперме, цервикальной слизи и других биологических жидкостях организма [23, 186]. Особенно много лактоферрина в женском молоке. Его концентрация зависит от срока лактации [12]. Гистохимически лактоферрин обнаружен во вторичных гранулах зрелых нейтрофилов.
Показано, что концентрация лактоферрина в сыворотке крови возрастает при инфекционных заболеваниях [22, 118, 146], значительно увеличивается уровень лактоферрина в очаге воспаления [137, 164, 214, 245, 255], в опухолевых тканях [28, 51,218]. Таблица 1. Концентрация лактоферрина в тканях организма человека Среда Концентрация Автор Сыворотка крови мужчинженщин (2,02+0,3) хЮ3 нг/мл (0,62±0,10)х103нг/мл1112+191 нг/мл(0,44+0,10)х103 нг/мл993±55 нг/мл Меркулов А. Г.. и др., 989 Конышева Т. В. и др., 1998Сухарев А. Е. и др., 1990 Конышева Т. В. и др., 1998Сухарев А. Е. и др., 1990 Плазма крови 0,1-0,4 х103 нг/мл Henric S., 1984 Вагинальная слизь- накануне менструа-ций- после менструаций 1,0x106 нг/мл3,87-11,4 нг/мкг белка62,9-218,0 нг/мкг белка Герман Г. П. и др., 1983 S. Myron et al., 1987 S. Myron et al., 1987 Спинномозговая жидкость (0,005±0,002)х103 нг/мл Конышева Т. В. и др., 1998 Моча 60 нг/мл Конышева Т. В. и др., 1998 Мокрота 0,8-2,5 х106 нг/мл Biserte et al., 1963 Зрелое женское молоко 1-3 xl О6 нг/мл Вельтищев Ю. Е., 1991 Коровье молоко 20-200x103 нг/мл Вельтищев Ю. Е., 1991 Молозиво 7,0-15,0х106 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983 Слезная жидкость 1х105 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983 Носовой секрет 1х105 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983 Содержимое панкреатических кист 1x105 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983 Слюна 1x104 нг/мл Герман Г. П. и др., 1983 Околоплодные воды рожениц (4,25±0,50)х103 нг/мл Конышева Т. В. и др., 1998 Копрофильтрат 180±45,0 нг/мл Чайникова И. Н. и др., 2000 Функции ЛФ в организме человека многообразны [18, 169, 173]. Помимо участия в обмене железа, данный гликопротеин регулирует гемопоэз по принципу обратной связи, мономерная форма ЛФ может влиять на гранулоцитопоэз подавляя выброс моноцитами простагландинов группы Е [86]. Противовоспалительная активность лактоферрина обусловлена способностью блокировать образование СЗ-конвертазы, что приводит к ингибированию классического пути активации системы комплемента. Вследствие этого снижается образование анафилатоксинов СЗа и С5а и уменьшается воспалительная реакция [156]. Получены данные, что железоненасыщенный лактоферрин ингибирует выброс гистамина [242].
В эксперименте in vivo показано, что лактоферрин и его производное — лактоферрицин способны ингибировать развитие метастаз у экспериментальных животных [95, 131].
Установлено, что лактоферрин способствует росту эпителиальных клеток кишечника, и возможно, играет роль в созревании кишечника у новорожденных [179]. Ряд биологических свойств ЛФ позволяют отнести его к факторам неспецифической защиты организма.
ЛФ способен оказывать бактерицидное и бактериостатическое действие на микроорганизмы. Впервые антибактериальное действие лактоферрина продемонстрировали Masson и Heremans [182]. В настоящее время известно о широком антимикробном спектре лактоферрина (табл. 2).
Первоначально считалось, что в основе антимикробной (микробостатиче-ской) функции белка лежит способность ненасыщенного железом лактоферрина (аполактоферрин) связывать и транспортировать катионы металлов переменной валентности. Создавая и поддерживая дефицитную по катионам железа и других металлов среду, ЛФ является одним из ведущих молекулярных механизмов, сдерживающих размножение и рост бактерий и низших грибов на по 13 верхности эпителиальных клеток и в условиях фаголизосом нейтрофильных гранулоцитов [182]. Насыщенный железом лактоферрин (гололактоферрин) не способен ингибировать рост микроорганизмов [110].
В последующем было обнаружено, что ЛФ может связываться с поверх I ностью бактерии, нарушая транспортную функцию клеточной мембраны. Ан тимикробная активность лактоферрина в отношении Е. coli обусловлена непо-средственным контактом между белком и микробной оболочкой [147]. ЛФ способен связываться с поверхностными структурами бактериальной клетки, доказательством чему служит рост культуры Е. coli при избытке или дефиците железа. Показано, что у Е. coli имеются два связываемых лактоферрином сайта липополисахарида, один из которых имеет высокое сродство, а другой - низкое к лактоферрину человека [175]. Shin К. с соавторами (1998) установили, что лактоферрин и его производные подавляют рост и развитие штаммов энтероге-моррагических кишечных палочек, взаимодействуя с поверхностью бактериальной клетки [69].
В тоже время, ЛФ может связываться с поринами мембраны бактерий [204]. Установлено, что бактерицидная активность ЛФ обусловлена его способностью связываться с поринами, от которых зависит устойчивость и проницаемость клеточной мембраны. Гликопротеин связывается с белками ОтрС и PhoE и, соответственно, со штаммами Е. coli, содержащими эти порины. При этом рост микроорганизмов, содержащих PhoE, полностью подавляется. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) лактоферрина составила 2,4 мг/мл.
Характеристика культур микроорганизмов
Материалом для исследования послужили 368 штаммов микроорганизмов, из них 105 штаммов стафилококков, 8 штаммов стрептококков, 157 штаммов энтеробактерий, 38 штаммов франциселл, 60 штаммов дрожжеподобных грибов.
Исследовано 56 штаммов золотистых стафилококков, из них 25 выделено из экссудата при гнойно-воспалительных заболеваниях, 24 - из переднего отдела слизистой оболочки носа, 7 - из влагалища. 47 штаммов эпидермальных стафилококков включали 10 из переднего отдела слизистой оболочки носа, 14 штаммов были выделены при гнойно-воспалительных заболеваниях, 23 - из репродуктивного тракта женщин. 2 штамма S. xylosus были выделены со слизистой оболочки переднего отдела носовой полости.
Стрептококки были представлены двумя видами: S. constellatus (3 штамма) и S. parauberis (2 штамма), выделенными при гнойно-воспалительных заболеваниях. 3 штамма S. parauberis выделены из репродуктивного тракта женщин.
Группа энтеробактерий включала 45 штаммов Е. coli (12 штаммов из экссудата при гнойно-воспалительных заболеваниях, 23 - из кишечника, 10 из репродуктивного тракта женщин); штаммы К. pneumoniae, 15 из которых выде-ленны из кишечника, 3 штамма - из репродуктивного тракта женщин, 3 штамма - из экссудата при гнойно-воспалительных заболеваниях; 58 штаммов S. enteriidis и 21 штамм S. typhimurium были выделены при сальмонеллезе. 2 штамма Klebsiella oxytoca, 1 штамм Raoultella terrigena, 3 штамма Enterobacter aerogenes, 1 штамм Morganella morganii, 4 штамма Providencia rettgeri были выделены из экссудата при острых гнойно-воспалительных заболеваниях. 1 штамм Shigella flexneri был выделен от больного дизентерией.
8 штаммов грибов рода Rodotorula и 38 штаммов дрожжеподобных грибов рода Candida были выделены из кишечника при дисбактериозе I - II степени, дрожжеподобные грибы рода Candida также были выделены из репродук тивного тракта женщин (12 изолятов), из экссудата при хронических гнойно-воспалительных заболеваниях (2 штамма).
38 штаммов F. tularensis были выделены от отловленных грызунов, из гнезд грызунов в стогах сена или соломы и экскрементов, из воды открытых водоемов (супернатанты штаммов предоставлены лабораторией особо опасных бактериальных инфекций Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава России; работа с супернатантами проводилась в лаборатории особо опасных бактериальных инфекций ЦГСЭН в Оренбургской области).
Выделение штаммов микроорганизмов проводили следующим образом. Исследуемый материал тампоном (влагалищная слизь, носовой секрет) или микробиологической петлей (экссудат при гнойно-воспалительных заболеваниях) засевали на 5% кровяной агар на чашке Петри. Дно чашки расчерчивали на секторы, затем прокаленной в пламени спиртовки петлей проводили рассев параллельными штрихами по поверхности среды в каждом секторе [56]. Посевы инкубировали в термостате при 37С в течение 18-24 часов.
Для оценки показателя микробной обсемененности подсчитывали количество выросших в каждом секторе колоний (табл. 5). Описывали морфологию колоний - величина, форма, цвет, характер поверхности, расположение колонии на поверхности среды. Часть изученной колонии брали для приготовления мазка, окрашивали по Граму и микроскопировали. Если при микроскопии подтверждалась однородность колонии, то оставшуюся ее часть отсевали на скошенный агар для получения чистых культур микроорганизмов.
Микрофлору кишечника исследовали в соответствии с методическими рекомендациями «Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дис-бактериоза кишечника» (М., 1986) [39].
Забор фекалий проводили в стерильные пенициллиновые флаконы, срок с момента забора материала до момента исследований - не более двух часов. Навеску 1 г испражнений тщательно растирали в стерильной ступке с 9 мл стерильного буферного раствора. Из основного разведения делали ряд последую-щих разведений в буферном растворе с 10" до 10" , производили высев суспензии (0,05-0,1-1,0 мл) на соответствующие питательные среды. Все посевы ин кубировали в термостате при 37С. Количественное содержание всех видов микроорганизмов в 1 г фекалий определяли по числу выросших на соответствующей среде колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения:
N= nxkxd, где N - количество микроорганизмов в 1 г фекалий, КОЕ/г; п - число колоний, выросших на питательной среде; к - коэффициент посевной дозы (при посеве 1 мл к=1, при посеве 0,1 мл к=10, при посеве 0,05 мл к=20); d - степень разведения посевного материала.
Разработка метода определения анти-лактоферриновой активности микроорганизмов
Длительное переживание (персистенция) бактерий в организме хозяина достигается за счет инактивации клетками микроорганизмов гуморальных и клеточных факторов естественной резистентности хозяина (Бухарин О. В., 1999). Одним из защитных механизмов бактерий является способность к инактивации лактоферрина, обладающего бактериостатическим и бактерицидным действием в отношении широкого круга микроорганизмов. Данное свойство было определено как антилактоферриновая активность микроорганизмов.
Для выявления антилактоферриновой активности микроорганизмов был предложен метод (патент РФ № 2156807), основанный на фотометрическом определении оптической плотности чувствительной к лактоферрину индикаторной культуры Micrococcus luteus [44]. Для определения АЛфА известным способом суточные исследуемые культуры микроорганизмов выращивают в жидкой питательной среде. Выросшие культуры обрабатывают хлороформом, отделяют супернатант центрифугированием при 3 тыс. об/мин. Супернатанты смешивают с лактоферрином. Параллельно с опытными пробами готовят два контроля, при этом в контроль 1 вместо супернатанта исследуемых культур микроорганизмов добавляют жидкую питательную среду, а контроль 2 готовят из забуференного физиологического раствора и жидкой питательной среды. Опытные и контрольные пробы инкубируют, после инкубации добавляют тест-культуру Micrococcus luteus ГИСК № 211001, и проводят первое измерение оптической плотности в опыте и контролях непосредственно по достижении режима термостатирования (37С) и второе измерение через 18 -24 часа инкубации, затем рассчитывают антилактоферриновую активность по изменению оптических плотностей в опыте и контролях.
Однако данный метод имеет ряд недостатков, затрудняющих его использование в научной и клинической практике. Этот метод является качественным, не позволяет выразить уровень антилактоферриновой активности в абсолют ных величинах. Кроме того, инкубация супернатантов, а не живых культур микроорганизмов, с лактоферрином значительно снижает частоту выявления антилактоферриновой активности бактерий, поскольку в первом случае могут быть обнаружены только конститутивные ингибиторы лактоферрина. Для экспрессии многих белков требуется культивирование живых микроорганизмов в среде, содержащей субстрат или индуктор.
Другим ограничением данного метода является использование живой тест-культуры М. luteus, что не позволяет определить АЛфА у штаммов микроорганизмов, продуцирующих лизоцим [11], гистоноподобные белки, перекись водорода и другие антагонистически активные вещества многих микроорганизмов (бифидобактерий, лактобацилл, стрептококков, синегнойной палочки [2]. Кроме того, метаболиты исследуемых микроорганизмов могут стимулировать рост индикаторной культуры, что приводит к ложноположительным результатам [45]. Обработка культур микроорганизмов хлороформом приводит к высвобождению некоторых бактериальных пигментов [2], что искажает результаты определения АЛфА.
В связи с этим, нами была изучена возможность использования иммуно-ферментного анализа для определения остаточных концентраций лактоферрина с целью разработки более чувствительного и точного метода количественной оценки антилактоферриновой активности бактерий, который позволит выявлять данный признак у более широкого круга микроорганизмов.
В качестве источника лактоферрина использовали пул донорских сывороток крови, полученных от здоровых доноров. Выбор данного источника определялся необходимостью создания в ходе эксперимента условий, приближенных к действующим в организме хозяина.
Для определения концентрации лактоферрина в опытных и контрольных пробах и расчета АЛфА мы применяли иммуноферментный анализ (ИФА), который позволяет точно определять концентрацию лактоферрина, поскольку в ИФА уникальная специфичность иммунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки [53].
Задачей первого этапа исследований явилось определение концентрации лактоферрина для тестирования микроорганизмов на наличие антилактоферриновой активности. Нами предложена концентрация лактоферрина 100 нг/мл. Выбор данной концентрации связан с диапазоном определяемых концентраций лактоферрина в используемом наборе реагентов (0-120 нг/мл). Известно, что наиболее воспроизводимые и стабильные результаты могут быть получены при использовании средних (60-100 нг/мл) концентраций лактоферрина [53].
Разработанный нами метод с применением иммуноферментного анализа был использован для определения способности микроорганизмов различных групп инактивировать лактоферрин (рис. 3).
Антилактоферриновую активность микроорганизмов определяли у 20 штаммов S. aureus, выделенных от бактерионосителей со слизистой оболочки переднего отдела носа. Первая серия опытов проводилась с живыми культурами микроорганизмов, во второй серии опытов использовали супернатант исследуемых культур.
Исследуемые культуры микроорганизмов выращивали на плотной питательной среде (мясопептонный агар, НПО «Питательные среды», Махачкала) при 37С в течение 18-24 ч. Из выросшей агаровой культуры готовили взвесь микроорганизмов (10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича) в жидкой питательной среде.
Готовили раствор лактоферрина с концентрацией 200 нг/мл на забуфе-ренном физиологическом растворе (Sigma, Р4417; состав: 0,01М фосфатный буфер, 0.0027М КС1, 0.137М NaCl, рН 7,4 при 25С).
Взвесь исследуемых культур микроорганизмов объемом 150 мкл вносили в лунки стерильного полистиролового планшета (Labsystems, Финляндия) и смешивали с 150 мкл приготовленного раствора лактоферрина (конечная концентрация лактоферрина 100 нг/мл). Параллельно с опытной готовили контрольную пробу: в лунки планшета вносили 150 мкл раствора лактоферрина и 150 мкл стерильного физиологического раствора. Пробы инкубировали при 37С в течение 24 часов. После инкубации содержимое лунок переносили в пластиковые пробирки, центрифугировали при 3000-8000 об/мин в течение 20 минут на холоде, отбирали 50 мкл супернатанта в опытной и контрольной пробах.
Распространенность и выраженность антилактоферриновой активности микроорганизмов
Распространенность и выраженность АЛфА микроорганизмов определяли у 105 штаммов стафилококков, 8 штаммов стрептококков, 157 штаммов энте-робактерий, 38 штаммов франциселл, 60 штаммов дрожжеподобных грибов.
Как видно из таблицы 8, антилактоферриновая активность широко распространена среди грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
У стафилококков распространенность изучаемого признака варьировала от 50 до 64%, наиболее часто АЛфА встречалась у эпидермального стафилококка. От 67 до 80% штаммов стрептококков обладали антилактоферриновой активностью. В группе энтеробактерий частота встречаемости АЛфА была связана с видовой принадлежностью. Наименьшая распространенность АЛфА была у Е. aerogenes (33%). Более половины штаммов кишечной палочки, S. typhi-murium, S. enteritidis и К. pneumoniae обладали антилактоферриновой активностью (60-71%). Все штаммы S. flexneri, К. oxytoca и R. terrigena обладали способностью инактивировать лактоферрин. У одной изученной культуры М. mor-ganii антилактоферриновая активность не была выявлена.
61% штаммов возбудителя туляремии, F. tularensis, обладали антилактоферриновой активностью. Дрожжеподобные грибы родов Candida и Rhodotorula характеризовались высокими показателями распространенности АЛфА — данный признак был обнаружен у 75% штаммов.
Как видно из таблицы, средний уровень антилактоферриновой активности отличался у различных видов микроорганизмов. Значения АЛфА золотистого и эпидермального стафилококков составили 10 нг/мл. У S. xylosus выраженность признака составила 0,3 нг/мл. Культуры стрептококков различались по способности инактивировать лактоферрин: для S. parauberis были характерны высокие значения признака (16,8±8,7 нг/мл), штаммы S. constellatus обладали низкой АЛфА (3,6±3,0 нг/мл).
Представители семейства Enterobacteriaceae различались по уровню антилактоферриновой активности. Среднее значение признака у штаммов кишечной палочки составило 8,7±1,9 нг/мл. У клебсиелл показатели АЛфА находились на уровне 6-7 нг/мл. Уровень АЛфА R. terrigena составил 10,9 нг/мл. Штаммы S. typhimurium и S. enteritidis инактивировали 9,5±1,4 и 8,2±0,7 нг/мл лактоферри-на соответственно. Максимальный уровень АЛфА был зарегистрирован у культур P. rettgeri (11,3±4,5 нг/мл).
Значение изучаемого признака у возбудителя туляремии составило в среднем 9,3±1,3 нг/мл.
Достаточно высоких показателей достигла АЛфА у дрожжеподобных грибов. Средний уровень признака С. albicans был равен 9,1±1,2 нг/мл, тогда как у грибов рода Rhodotorula уровень антилактоферриновой активности был выше (13,3±4,4 нг/мл).
Таким образом, подавляющее большинство микроорганизмов (от 50 до 100% штаммов) обладали способностью инактивировать лактоферрин. Средние значения антилактоферриновой активности микроорганизмов варьировали от 0,3 нг/мл до 13,3 нг/мл.
Задачей следующего этапа исследований было изучение особенностей распространенности и выраженности АЛфА у бактерий, выделенных из различных биотопов организма человека и при разных формах инфекционного процесса.
Распространенность АЛфА у штаммов Е. coli, К. pneumoniae и S. aureus, выделенных из влагалища, составила 90,0±9,5, 100 и 85,7±13,2% соответственно (рис. 4). Частота встречаемости признака у фекальных штаммов Е. coli и К. pneumoniae была ниже по сравнению с вагинальными штаммами - 43,5±10,3 и 60,0±12,6% соответственно (р 0,01). 65,2±9,9% штаммов S. aureus, выделенных со слизистой оболочки носовой полости, инактивировали лактоферрин.
Уровень АЛфА энтеробактерий, выделенных из влагалища, был в 3-4 раза выше, чем у тех же видов микроорганизмов, выделенных из кишечника (р 0,01), составив 17,0±3,8 и 4,5±1,7 нг/мл соответственно у Е. coli; 15,7±1,2 и 5,9±1,3 нг/мл соответственно у К. pneumoniae. Дрожжеподобные грибы, выделенные из кишечника, инактивировали 7,1+1,1 нг/мл лактоферрина, в то время как выделенные из влагалища - 11,3+2,8 нг/мл. Штаммы золотистого стафилококка, выделенные со слизистой носовой полости, обладали АЛфА 8,4±1,0 нг/мл, что было ниже, чем АЛфА влагалищных штаммов (10,0±1,0 нг/мл).
Распространенность изучаемого признака у штаммов микроорганизмов -возбудителей острых гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ) находилась на низком уровне, составив 33,3±19,2% у Е. coli, 31,3+11,6% у S. aureus, 33,3±19,2% у S. epidermidis (рис. 5). При хронических ГВЗ 66,7±19,2% штаммов кишечной палочки, 66,7±15,7% штаммов золотистого и 75,0±15,3% штаммов эпидермального стафилококков инактивировали лактоферрин.
Похожие диссертации на Антилактоферриновая активность микроорганизмов
