Введение к работе
Актуальность проблемы. Присутствие микроорганизмов в нефтяных пластах было установлено около 100 лет назад. Опубликован ряд обзорных материалов по нефтяной микробиологии с подробным описанием микроорганизмов основных физиологических групп (Розанова, Кузнецов, 1974; Magot et al., 2000; Назина, Беляев, 2004). Из нефтяных пластов выделены анаэробные микроорганизмы, восстанавливающие сульфат, тиосульфат, Fe(3+) и элементную серу, бродильные бактерии, ацетогены и метаногены (Magot et al., 2000; Stetter et al., 1993; Takahata et al., 2000; Orphan et al., 2000, 2003; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). Аэробные бактерии, обитающие в нефтяных пластах, считаются контаминантами, поступившими в пласт с поверхности земли при бурении или с нагнетаемой водой. Для выяснения биоразнообразия и активности микроорганизмов нефтяных пластов были использованы микробиологические, радиоизотопные, молекулярно-биологические и биогеохимические методы. В большинстве работ эти методы применялись раздельно, что не позволяло расшифровать структуру микробного сообщества в целом и оценить его геохимическую деятельность.
Имеется обширная' информация о микроорганизмах нефтяных пластов с температурой 20-45С. Процессы метаногенеза и состав микробных сообществ высокотемпературных нефтяных пластов оставались мало изученными.
Первые чистые культуры метаногенов из нефтяных пластов были выделены С.С. Беляевым и соавторами (1986; Belyaev et al., 1983; Образцова и соавт., 1987; Давыдова-Чарахчьян и соавт., 1992; Davidova et al., 1997). Метаногены, окисляющие водород с одновременным восстановлением углекислоты в метан, являются обычными обитателями нефтяных пластов с температурой от 20 до 80С. Термофильные метаногены, выделенные из нефтяных пластов, были представлены водород-использующими организмами видов Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter thermoaggregans и Methanococcus thermolithotrophicus (Давыдова-Чарахчьян и соавт., 1992а; Ng et al., 1989; Nilsen, Torsvik, 1996). Органотрофные метаногены, использующие ацетат, метанол и метилированные амины, часто растущие также и на Н2+С02, пока изолированы из нефтяных пластов, температура которых не превышает 50С (Magot et al., 2000; Назина, Беляев, 2004). Тем не менее, образование метана из NaH14C03 и из MCH3-C00Na, зарегистрировано радиоизотопными методами в пластах с температурой 60-80С, что указывает на существование термофильных прокариот, осуществляющих эти процессы в нефтяных пластах (Belyaev, Borzenkov, 1993; Розанова и
соавт., 1995, 1997; Nazina et al., 1995; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003).
Методы молекулярной экологии, основанные на анализе генов 16S
рРНК, начали использоваться для изучения разнообразия
микроорганизмов нефтяных пластов сравнительно недавно. Подобные
исследования проведены на высокотемпературных нефтяных
месторождениях Калифорнии (Orphan et al., 2000, 2003), Западной Сибири
(Bonch-Osmolovskaya et al., 2003) и Китая (Li et al., 2006). В пластовой воде
были обнаружены гены 16S рРНК известных термофильных
(Thermococcus, Thermotoga, Petrotoga, Thermoanaerobacter;
Methanothermobacter, Methanococcus и Methanoculleus) и мезофильных микроорганизмов, а также некультивируемых архей и бактерий. В нефтяных пластах Калифорнии был обнаружен ген 16S рРНК нового, вероятно, ацетокластического метаногена, формирующего отдельную ветвь внутри порядка Methanosarcinales. Однако чистые культуры термофильных ацетокластических метаногенов пока не выделены.
Анализ имеющихся публикаций свидетельствует о том, что применение лишь одного из методов не достаточно для описания микробного сообщества нефтяных пластов. Проведение комплексных исследований микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов актуально как с теоретической точки зрения, так и для решения практических задач по созданию биотехнологий повышения нефтеизвлечения и получения метана из остаточной нефти.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выяснение филогенетической структуры, численности и активности микробного сообщества высокотемпературных нефтяных пластов (на примере нефтяного месторождения Даган) с использованием микробиологических, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов.
Для достижения цели было, необходимо решить следующие задачи.
-
Определить численность микроорганизмов основных метаболических групп и оценить скорости процессов сульфатредукции и метаногенеза в пластовых водах нефтяного месторождения Даган.
-
Выяснить филогенетическое разнообразие микроорганизмов в накопительных культурах метаногенов и в микробном сообществе пластовой воды молекулярно-биологическим методом анализа генов 16S рРНК.
-
Выделить чистые культуры метаногенов из нефтяного пласта и определить их физиолого-биохимические признаки и таксономическое положение.
-
Исследовать взаимоотношения микроорганизмов при разрушении ацетата с образованием метана.
Научная новизна работы. Впервые применен комплексный подход к описанию микробного сообщества высокотемпературного нефтяного месторождения. С использованием радиоизотопных методов дана количественная оценка скоростей сульфатредукции и метаногенеза. Методом анализа генов 16S рРНК пластовой воды. показано, что анаэробные микроорганизмы нефтяного пласта были представлены в основном термофильными бактериями и археями с бродильным типом метаболизма, сульфатредуцирующими, метанобразующими и синтрофными микроорганизмами. На основании результатов изучения филогенетического разнообразия микроорганизмов в накопительных метаногенных культурах и в сообществе пластовой воды установлено, что разрушение ацетата с выходом метана осуществляет синтрофная ассоциация микроорганизмов Methanothermobacter-Thermoanaerobacter. Из ассоциации выделены чистые культуры метаногенов {Methanothermobacter thermautotrophicus) и анаэробных органотрофных бактерий (Thermoanaerobacter ethanolicus), не способные расти на ацетате по отдельности. Разрушение ацетата с образованием метана становилось возможным при совместном росте бактерий рода Thermoanaerobacter, окисляющих ацетат до Н2 и СОг, и Нг-использующих метаногенов рода Methanothermobacter. Участие бактерий родов Thermoanaerobacter-Caldanaerobacter в терминальных процессах разрушения органического вещества нефти совместно с метаногенами расширяет представления об их роли в функционировании микробного сообщества высокотемпературных нефтяных пластов.
Научно-практическая значимость работы. Результаты изучения микроорганизмов нефтяного пласта подтверждают возможность применения биотехнологии увеличения нефтеизвлечения, основанной на внесении кислорода воздуха и минеральных солей азота и фосфора, для активации микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов. Установленные закономерности функционирования термофильного микробного сообщества могут быть использованы для создания новых биотехнологий получения метана из остаточной нефти в пласте.
Соискателем усовершенствован метод отбора и фиксации пластовой воды для проведения молекулярно-биологических исследований и оптимизированы условия выделения ДНК с последующей амплификацией генов 16S рРНК. Созданы праймеры для детекции представителей родов Methanothermobacter, Sphingomonas и Pseudomonas в накопительных культурах и природных образцах.
Исследования выполнялись в 2002-2007 гг. при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 01-04-49250, 02-04-39002, 05-04-39029, 06-04-58722-3, 06-04-49128), Китайской национальной нефтяной компании
(КНР, контракт № DFT04-122-IM-18-20RU), Американского фонда гражданских исследований и развития (гранты CRDF, RBO-1364-MO и RBO-1364-MO-02) и Миннауки РФ (Ведущие научные школы, руководитель академик РАН М.В. Иванов, грант № 02.445.11.7409).
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 3-м Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005); на объединенном международном симпозиуме по микробиологии подземных экосистем (ISSM 2005) и биогеохимии окружающей среды (1SEB XVII) (Джексон Холл, США, 2005); на 11-ом международном симпозиуме по микробной экологии (ISME-11, Австрия, Вена, 2006) и на 2-ой Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, включая 6 статей и 5 тезисов докладов.
Место проведения работы. Работа проводилась в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (лаборатория нефтяной микробиологии) под руководством д.б.н. Т.Н. Назиной и в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (лаборатория структурно-функциональной геномики, ЦКП «Геном») под руководством к.б.н. А.Б. Полтарауса.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. Т.Н. Назиной, профессору, д.б.н. С.С. Беляеву, к.б.н. А.Б. Полтараусу и к.б.н. Т.П. Туровой за полезные советы, помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Автор приносит благодарность всем участникам работы, а также коллегам и друзьям за содействие и поддержку.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 183 страницах машинописного текста и включают 31 рисунок и 29 таблиц. Диссертация состоит их разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», включающая главы «Объекты и методы исследования», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит 74 отечественных и 179 зарубежных наименований.
Похожие диссертации на Филогенетическое разнообразие и активность микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов
