Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами (обзор литературы) 10
1.1 Формы и факторы взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами 10
1.2 Бактериальные механизмы связывания железа 20
Глава 2. Материалы и методы исследования 26
2.1. Характеристика исследуемого материала 26
2.2. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов 28
2.2.1. Определение факторов патогенности микроорганизмов 28
2.2.2. Определение факторов персистенции микроорганизмов 32
2.3. Модель оценки взаимодействия бактерий с эритроцитами in vitro 34
2.4.Метод воспроизведения экспериментальной генерализованной стафилококковой инфекции 36
2.5. Методы гистологической обработки крови для электронной микроскопии 38
2.6. Методы спектральной характеристики гемоглобина 39
2.7. Методы статистической обработки результатов 40
Глава 3. Распространенность и выраженность гемолитической и антигемоглобиновой активности микроорганизмов, выделенных из различных биотопов больных и здоровых лиц 41
3.1. Таксономическое разнообразие микроорганизмов, выделенных из очагов гнойно-воспалительных заболеваний 41
3.2. Таксономическое разнообразие микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек носа и миндалин от здоровых людей и больных анемией смешанной этиологии 44
3.3 Распространенность и выраженность факторов патогенности
микроорганизмов, выделенных от больных и здоровых лиц 47
3.4. Распространенность и выраженность антигемоглобиновой активности таксонов микроорганизмов, выделенных из различных биотопов больных и здоровых лиц 50
3.5. Связь гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов с другими факторами патогенности 58
Глава 4. Изучение биологической роли гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов 63
4.1. Роль гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов при их взаимодействии с эритроцитами in vitro и на модели экспериментальной инфекции 63
4.2. Динамика экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей клонов штамма S. epidermidis при экспериментальной генерализованной инфекции 74
4.3. Изменения спектральной характеристики гемоглобина под действием исследуемых клонов с разными уровнями экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей штамма S.
epidermidis 82
Глава 5. Микробиологические критерии прогнозирования развития анемии при инфекционных заболеваниях 97
Заключение 103
Выводы 114
Список литературы 117
Приложения 136
- Формы и факторы взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами
- Методы изучения биологических свойств микроорганизмов
- Таксономическое разнообразие микроорганизмов, выделенных из очагов гнойно-воспалительных заболеваний
- Роль гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов при их взаимодействии с эритроцитами in vitro и на модели экспериментальной инфекции
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время изучение новых факторов патогенности микроорганизмов остается актуальным как в биологии, так и в медицине. Большое внимание уделяют роли микроорганизмов в развитии анемии при инфекционных заболеваниях [93,51]. В связи с этим, необходимо изучить механизмы взаимодействия бактерий с эритроцитами при проникновении патогена в кровь (сепсис, бактериемия) [94]. Описано взаимодействие с эритроцитами стафилококков [32], стрептококков [130], менингококков [44,84], энтеробактерий [23,24], лептоспир [1,2] и других микроорганизмов.
Выделяют несколько форм взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами: адгезия, гемолиз и изменение молекулы гемоглобина. Эритроциты имеют на своей поверхности гликофорин - вещество, идентичное гликокалису эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для адгезинов микробов [3].
Многие патогенные бактерии вырабатывают экзоферменты и экзотоксины, которые способны повреждать плазматическую мембрану эритроцитов с помощью ферментативного гидролиза или в результате формирования пор [173]. Особое Место в ряду факторов патогенности бактерий занимают внеклеточно секретируемые молекулы с мембраноповреждающей способностью, получившие общее название «гемолизины». Микроорганизмы, синтезирующие данные молекулы обладают гемолитической активностью, в результате чего происходит лизис эритроцитов с последующим освобождением гемоглобина [183].
Гемолитическая активность (гемолизины) многих микроорганизмов рассматривается на этапе взаимодействия с мембраной эритроцитов, а ее роль в изменении молекулы гемоглобина, с целью обмена железа, изучена недостаточно. Есть данные, что только менингококки и холерные вибрионы
5 выделяют гемолизины, которые являются железорегулирующими белками (Fe-Pb) [54,107].
Известно, что способность усвоения железа является для большинства патогенных бактерий необходимым фактором сохранения жизнеспособности в организме хозяина - одна из функций, определяющих их патогенность [43]. В организме хозяина железо существует в виде комплексов с гемоглобином, гемином и ферритином. Патогенные бактерии, попадая в организм хозяина, должны активно обеспечивать себя ионами железа [67]. Сорбируя из среды железо, бактерии приобретают способность лучше противостоять неблагоприятным факторам, а также получают преимущества в конкурентной борьбе [80].
Под действием патогенов метаболизм железа нарушается и многие инфекционные заболевания часто сопровождаются развитием анемии. В расшифровке анемии микробной этиологии необходимо изучить роль факторов патогенности бактерий при взаимодействии с эритроцитами и непосредственно с гемоглобином.
Вместе с тем, особенности механизмов взаимодействия бактерий с эритроцитами изучены недостаточно.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилось изучение роли гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов при взаимодействии с эритроцитами.
Для реализации этой цели были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
Разработать методы количественного определения гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов.
Изучить распространенность и выраженность гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов с учетом их биологии и экологии.
Оценить роль гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов во взаимодействии с
эритроцитами при экспериментальной инфекции и в клинико-лабораторных исследованиях.
4. Разработать метод прогнозирования развития анемии при
гнойно-воспалительных заболеваниях с учетом гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Обнаружен новый признак у микроорганизмов - антигемоглобиновая активность. Разработан метод выявления данного признака, основанный на определении остаточного гемоглобина в субстрате после взаимодействия с бактериальной культурой (патент РФ на изобретение № 2262705 от 20 октября 2005). Выявлено, что частота и уровень экспрессии антигемоглобиновой активности связаны с видовой принадлежностью микроорганизмов и особенностями их экологии. Впервые установлена связь между изменением концентрации гемоглобина крови и уровнем экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов. Впервые установлен феномен внутриэритроцитарного расположения бактерий. В электронно-микроскопическом исследовании доказано, что стафилококки с высоким уровнем гемолитической и антигемоглобиновой активности способны локализоваться, размножаться внутри эритроцитов, разрушая гемоглобин, тогда как стафилококки с низким уровнем выраженности данных свойств проникали, но подвергались внутри эритроцитов деструктивным изменениям.
По спектральному анализу молекулы гемоглобина показана связь между уровнем антигемоглобиновой активности микроорганизмов и глубиной конформационных изменений как в белковой, так и в гемовой частях гемоглобина.
Предложен методический ключ для изучения взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами, позволяющий открыть новые подходы к оценке роли факторов патогенности бактерий в механизмах развития анемии при инфекционных заболеваниях. Использование нового методического подхода позволило разработать метод прогнозирования развития анемии при
7 гнойно-воспалительных заболеваниях (заявка на изобретение № 2005129824/15(033449)).
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Полученные данные расширяют теоретические представления о патогенных свойствах микроорганизмов при взаимодействии с эритроцитами.
Практическое значение исследований определяется разработкой методов оценки взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами. Предложенные методические приемы: фотометрические методы количественного определения гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов могут быть использованы в научно-исследовательских лабораториях для изучения механизмов взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами, а также в практике здравоохранения (Акт внедрения №1085 от 17 февраля 2006 г. - Оренбургская Муниципальная городская клиническая больница №5 и №1032 от 20 февраля 2006 г. - Областная детская клиническая больница).
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Обнаружена антигемоглобиновая активность микроорганизмов. Штаммы бактерий с высоким уровнем экспрессии гемолитической и антигемоглобиновой активностей вызывают снижение концентрации гемоглобина в крови у экспериментальных животных и у больных гнойно-воспалительными заболеваниями.
Патогенные микроорганизмы с гемолитической и антигемоглобиновой активностями способны проникать внутрь эритроцитов, изменяя структуру и функцию гемоглобина.
На основе оценки особенностей взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами предложен методический подход к прогнозированию развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы доложены и обсуждены на: Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2003; 2004); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); Конференции по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004); Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2005); II межрегиональной межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы биологии и медицины» (Ижевск, 2005); Российской научной конференции «Педиатрия: из XIX в XXI век» (Санкт-Петербург, 2005); XIX научном совещании гистологов «Актуальные проблемы учения о тканях» (Санкт-Петербург, 2006).
Диссертационное исследование является фрагментом научно-исследовательской работы, проводимой в рамках программ Президиума Российской академии наук «Научные основы сохранения биоразнообразия России, 2003 - 2005» и «Фундаментальные науки - медицине, 2003-2005».
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 публикации в рецензируемых научных журналах, получен патент РФ на изобретение «Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов» № 2262705 от 20 октября 2005 года, оформлена заявка на изобретение № 2005129824/15 (033449) «Способ прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях».
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ.
Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложение. Указатель литературы содержит 142 отечественных и 42 зарубежных источника литературы. Текст иллюстрирован 10 таблицами и 24 рисунками.
9 Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук в рамках темы открытого плана НИР ИКиВС УрО РАН «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека» (№ гос.регистрации 01.2.00 104756).
Формы и факторы взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами
Адгезия рассматривается как первый этап взаимодействия бактерий и эритроцитов [31,38, 85]. Адгезия - общебиологическое явление, известное как свойство микроорганизмов фиксироваться и размножаться, колонизуя поверхности различной природы [31]. Выделяют факторы адгезии к эритроцитам как у представителей грамположительной флоры, так и у грамотрицательных бактерий. Адгезины патогенных бактерий белковой природы и функционируют на первом этапе инфекционного процесса. С помощью адгезинов осуществляется выбор ткани, чувствительной к дальнейшему поражению токсином и другими факторами патогенности [52].
В основе специфического взаимодействия адгезинов микроорганизмов с эритроцитами лежит механизм биологического узнавания. Отправным моментом в биологическом узнавании является принцип комплементарности. Для образования комплекса соответствие должно быть достаточно точным [6]. Факторы адгезии разных видов микроорганизмов неоднородны по морфологическим, биохимическим, антигенным и функциональным свойствам [79,85]. Staphylococcus aureus процесс адгезии осуществляет при помощи гемагглютинина, рецептором для которого является фибронектин [56]. У Streptococcus pyogenes процесс адгезии на поверхности эритроцитов человека обеспечивают липотейхоевые кислоты. Это многофазный процесс, в котором участвуют и другие компоненты клеточной стенки стрептококка: М-протеины, липопротеаза [126,151].
Описан выраженный тропизм к эритроцитам у Neisseria meningitidis. Начальный этап взаимодействия менингококков с эритроцитами осуществляется за счет фимбрий (пилей) [69,136]. Белок Pil Е является основным компонентом пилей как фактор адгезии на эритроцитах. Процесс адгезии двусторонний, где участвуют не только пили менингококка, но и рецепторы эритроцитов. Первая неспецифическая стадия адгезии менингококка осуществляется с помощью физико-химических факторов, удерживающих его на поверхности эритроцитов. Далее при специфической адгезии распознавание рецепторов и прикрепление к ним выполняют адгезины-фимбрии, находящиеся на поверхности клеток, и белки наружной мембраны, которые выполняют важную роль в этом процессе [108]. У N.gonorrhoeae установлен факт адгезии к эритроцитам человека с помощью пилей и белков внешней мембраны [174].
Адгезины грамотрицательных палочковидных бактерий - особые органеллы, с помощью которых осуществляется фиксация биообъекта на поверхности среды обитания [53,58]. Примером высокоспецифического взаимодействия адгезинов с эритроцитами служат адгезины Escherichia coli, которые характеризуются высоким уровнем избирательности [57,91]. Адгезинами кишечной палочки являются фимбрий белковой природы. Функционально выявлены две основные группы адгезинов Е. coli: а) маннозочувствительные фимбрий, гемагглютинационная способность которых ингибировалась а-маннозой или а-метил-а-маннозидом; б) маннозоустойчивые фимбрий, реакция которых с эритроцитами морской свинки и человека не тормозилась в присутствии а-маннозы [31]. Установлено, что Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis и Pseudomonas aeruginosa прикрепляются к эритроцитам с помощью пилей и жгутиков белковой природы. У грамположительных палочек: Bacillus cereus, Clostridium perfringens, а также у Leptospira interrogans в качестве адгезинов выступают белки наружной мембраны. Интенсивность процесса адгезии зависит от многих факторов и условий: от типа имеющихся фимбрий, рН среды. Состояние адгезии, с одной стороны, определяется компонентами клеточной стенки микробов, а с другой местными тканевыми факторами (слизистым секретом, наличием фагоцитов и их хемотаксической активностью). Микробы-ассоцианты могут усиливать процессы адгезии. Так, бактерии-ассоцианты: S.aureus, P.aeruginosa, грамотрицательные энтеробактерии, - усиливали адгезию грибов Candida к эпителиальным клеткам ротовой полости и дыхательных путей [105,128]. В биотопах тела человека, где различные микроорганизмы находятся преимущественно в ассоциациях, адгезия может изменяться в условиях межмикробных взаимодействий. Например, лактобациллы могут снижать адгезию S.aureus, непатогенных кишечных палочек, причем не остается без изменений и адгезия самих лактобацилл [28,38].
Методы изучения биологических свойств микроорганизмов
Материалом для исследований послужили 349 штаммов микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, родов: Staphylococcus, Bacillus, Pseudomonas. Из них изучено 91 клинических штаммов Staphylococcus, 11 штаммов Enterobacteriaceae, 3 штамма Bacillus subtilis, 2 штамма Pseudomonas aeruginosa и 2 штамма Streptococcus haemolyticus, выделенных от больных с различными формами гнойно-воспалительных заболеваний (флегмона, абсцесс, фурункул, перитонит, сепсис) (57 детей в возрасте 1 год -17 лет); ПО штаммов Staphylococcus, выделенных со слизистой оболочки миндалин и носовой полости от клинически здоровых людей (30 детей в возрасте 6-17лет) и 130 штаммов Staphylococcus, выделенных со слизистой оболочки миндалин и носовой полости от больных анемией смешанной этиологии (30 детей в возрасте 1год -17 лет).
Выделение и идентификацию исследуемых штаммов микроорганизмов проводили по классическим методикам [119].
Для исследования брали мазок из очага локализованной гнойно-воспалительной инфекции, а также со слизистых оболочек миндалин и носовой полости. Схема бактериологической диагностики представлена на рисунке 1. Забор проводили стерильным ватным тампоном, смоченным в стерильном физиологическом растворе. Сразу же осуществляли посев на 5% кровяной агар в чашке Петри. Посевной материал втирали прокатыванием тампона по поверхности среды у края чашки. Дно чашки расчерчивали на секторы, затем прокаленной в пламени спиртовки петлей проводили рассев параллельными штрихами по поверхности среды в каждом секторе [132]. Исследуемый материал доставляли в лабораторию в течение 1 часа от момента забора. Посевы инкубировали в термостате при t=37 С в течение 24 часов.
Описывали морфологию колоний - величина, форма, цвет, характер поверхности, расположение колонии на поверхности среды. Часть изученной колонии брали для приготовления мазка, окрашивали по Граму и микроскопировали. Если при микроскопии подтверждалась однородность состава колонии, то оставшуюся ее часть отсевали на скошенный агар для получения чистых культур микроорганизмов.
Идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и биохимических свойств. Вид энтеробактерий и стафилококков определяли по биохимическим свойствам с использованием тест-систем: «ЭНТЕРО тест 24», «СТАФИ тест 16» фирмы Lachema (Чехия).
Описывали морфологию колоний - величина, форма, цвет, характер поверхности, расположение колонии на поверхности среды. Часть изученной колонии брали для приготовления мазка, окрашивали по Граму и микроскопировали. Если при микроскопии подтверждалась однородность состава колонии, то оставшуюся ее часть отсевали на скошенный агар для получения чистых культур микроорганизмов.
Идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и биохимических свойств. Вид энтеробактерий и стафилококков определяли по биохимическим свойствам с использованием тест-систем: «ЭНТЕРО тест 24», «СТАФИ тест 16» фирмы Lachema (Чехия).
У выделенных штаммов микроорганизмов изучали факторы патогенности: плазмокоагулазную, лецитовителлазную, гемолитическую, антигемоглобиновую активности.
Реакция на наличие у микроорганизма фермента плазмокоагулазы определялась путем посева суточной агаровой культуры в 0,5 мл разведенной 1:5 цитратной плазмы. Результаты реакции регистрировали через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации проб в термостате при температуре 37С. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка свидетельствовало о наличии у изучаемого штамма плазмокоагулазной активности.
Лецитовителлазная активность (способность разрушать лецитовителлин яичного желтка) обнаруживалась при посеве испытуемых микроорганизмов на 20% желточно-солевой агар по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком.
Гемолитическую активность (способность вызывать гемолиз эритроцитов) оценивали при помощи разработанного фотометрического
Таксономическое разнообразие микроорганизмов, выделенных из очагов гнойно-воспалительных заболеваний
Всего выделено со слизистых оболочек носа и миндалин у здоровых лиц ПО штаммов, из биотопа слизистых оболочек носа и миндалин у больных анемией смешанной этиологии - 130 штаммов. Микробиоценозы слизистых оболочек носа и миндалин здоровых лиц и больных анемией смешанной этиологии представлены в таблице 3. Как видно из таблицы 3, микрофлора носовой полости и миндалин у здоровых людей представлена только родом Staphylococcus, тогда как микрофлора слизистых оболочек носа больных анемией смешанной этиологии представлена не только родом Staphylococcus (86,7±2,6%), а также родом Bacillus (8,5±3,0%) и родом Klebsiella (4,8±2,3%).
В группе обследованных больных с анемией смешанной этиологии из микробиоценоза слизистых оболочек миндалин в 2,4 - 2,1 раза чаще выделялся патогенный вид S.aureus, чем из биотопа слизистых оболочек миндалин и носа здоровых лиц, что составляло 41,6±7,1% против 17,2±4,7% и 19,5±5,8% соответственно. Среди условно-патогенных представителей рода Staphylococcus чаще встречались S. epidermidis и S.saprophyticus. В группе здоровых лиц из микробиоценоза миндалин в 1,8 раза чаще выделялся S. epidermidis, чем из биотопа носовой полости больных анемией смешанной этиологии (34,4±5,9% против 19,5±4,3% соответственно). S.saprophyticus в 3,4 раза чаще встречался в микробиоценозе носовой полости здоровых лиц, чем в биотопе слизистых оболочек носа больных анемией, что составляло 32,6±6,9% против 9,7±3,2% соответственно и в 7,9 раза чаще выделялся, чем в микробиоценозе миндалин больных анемией смешанной этиологии (32,6±6,9% против 4,1±2,8% соответственно). Другие условно-патогенные виды стафилококков встречались в наименьшем процентном соотношении. Среди представителей родов Bacillus и Klebsiella, выделенных из исследуемых микробиоценозов в группе больных анемией смешанной
При исследовании факторов патогенности и персистенции у выделенных штаммов из различных биотопов тела человека были получены следующие результаты (рис.6).
Наиболее часто плазмокоагулазной активностью обладали штаммы, выделенные из групп больных с ГВЗ и больных анемией смешанной этиологией (39,0±4,7% и 30±4,2% соответственно) по сравнению со штаммами от здоровых лиц (19,1±3,7%).
В 2 раза чаще выделялись штаммы с лецитовителлазной активностью от больных с ГВЗ (45,3±4,9%), чем от больных анемией смешанной этиологии (25,6±4,0%) и от здоровых лиц (20,9±3,8%).
При исследовании гемолитической активности у выделенных штаммов оказалось, что высоким уровнем ГА ( 70% гемолиза) обладали штаммы, выделенные от двух групп обследованных больных: больные ГВЗ -68,7±4,5%, больные анемией смешанной этиологии - 71,8±4,2%. В 2 раза реже выделялись штаммы с высоким уровнем ГА от здоровых лиц.
При изучении антилизоцимной активности у исследуемых штаммов оказалось, что в 2 раза чаще выделялись штаммы с высоким уровнем АЛА от больных с ГВЗ (50,4±4,8%) и от больных анемией смешанной этиологии (46,2±4,6%), чем от здоровых лиц (23,3±4,0%).
Среди изученных нами факторов патогенности, особое место занимает гемолитическая активность микроорганизмов. Данная активность у многих бактерий рассматривается на этапе взаимодействия с мембраной эритроцитов, а ее роль в изменении молекулы гемоглобина, с целью обмена железа, изучена недостаточно. Было обнаружено новое свойство бактерий -антигемоглобиновая активность. Оказалось, что высоким уровнем АнтиНЬА ( 3г/л) обладали 73,4±4,3% выделенных штаммов от больных ГВЗ и 61,5±4,5% от больных анемией смешанной этиологии. Штаммы, выделенные от здоровых людей, с высоким уровнем АнтиНЬА встречались в 34,3±5,5% случаев.
В дальнейшем, представляло интерес, подробно изучить спектр распространения и уровня выраженности антигемоглобиновой активности у разных видов микроорганизмов. Результаты исследований представлены ниже.
Роль гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов при их взаимодействии с эритроцитами in vitro и на модели экспериментальной инфекции
Взаимодействие возбудителя с эритроцитами осуществляется посредством факторов патогенности. Одним из основных факторов патогенности микроорганизмов является гемолитическая активность [165]. В результате ее мембраноповреждающей способности происходит лизис эритроцитов с последующим освобождением гемоглобина [61]. Для реализации и усиления патогенных свойств микроорганизмам необходимо определенное количество железа, которое они должны утилизировать в организме хозяина при развитии инфекционного процесса [59,142]. В гемоглобине концентрация железа составляет 0,335% [13]. Сорбируя из среды железо, бактерии приобретают способность лучше противостоять неблагоприятным факторам, а также получают преимущества в конкурентной борьбе [80]. У микроорганизмов обнаружен признак -антигемоглобиновая активность (АнтиНЬА), под действием которого происходит изменение структуры молекулы гемоглобина (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Ханина Е.А. Патент на изобретение № 2262705 от 20 октября 2005). Но роль данных признаков в инфекционном процессе до конца не выяснена.
Для решения поставленной задачи экспериментально изучили влияние факторов патогенности: гемолитической и антигемоглобиновой активностей стафилококков на эритроциты крови человека. Для этого были созданы условия in vitro, при которых происходило взаимодействие стафилококков с эритроцитами крови человека (рис. 3, глава 2). Был отобран штамм Staphylococcus epidermidis с высоким значением как ГА (83,5% гемолиза), так и АнтиНЬА (6,5 г/л) и не обладавший КоА, ЛецА.
При световой микроскопии, была обнаружена адгезия S.epidermidis. На поверхности и около эритроцитов были видны многочисленные кокки. В некоторых эритроцитах обнаруживались вакуоли, внутри которых локализовались бактерии. Было сделано предположение о внутриклеточном проникновении стафилококков.
В результате электронной микроскопии наблюдали скопление кокков между эритроцитами. При этом бактерии имели признаки цитотомии, что свидетельствовало об их делении (рис. 7). Сами эритроциты находились в состоянии пойкилоцитоза и анизоцитоза. Одновременно наблюдались «опустошенные» эритроциты, не имеющие ультраструктурных эквивалентов гемоглобина («тени» эритроцитов) (рис. 8).
Такое изменение формы и размера эритроцитов может свидетельствовать о начале развития анемии [92,141].
Вопрос о возможном проникновении стафилококков внутри эритроцитов оставался открытым.
Для его решения необходимо было воспроизвести экспериментальную генерализованную инфекцию на животных (in vivo) с использованием штаммов, обладающих ГА и АнтиНЬА. В качестве модели инфекционного процесса было выбрано экспериментальное внутривенное заражение стафилококком белых нелинейных мышей, массой 18-20 г. Выбор обусловлен тем, что данная модель носит черты истинно инфекционного процесса, для которого характерно циклическое развитие [120].
Для проведения экспериментальной инфекции, с использованием метода популяционного анализа [167], были получены изогенные клоны штамма Staphylococcus epidermidis, выделенного из очага гнойно-воспалительной инфекции. Один клон (№5) обладал высоким уровнем ГА (73,2% гемолиза) и высоким уровнем АнтиНЬА (10,6 г/л). Другой клон (№9) обладал низкими значениями как ГА (39,4% гемолиза), так и АнтиНЬА (0 г/л) (рисунок 4, глава 2). Для эксперимента выбрали S.epidermidis, который в отличие от патогенного вида стафилококка - S.aureus не обладал лецитовителлазной активностью. Данная активность также как и гемолитическая могла влиять на мембрану клеток.
Внутривенное инфицирование мышей двух групп проводили 0,1 мл взвеси суточной агаровой культуры S. epidermidis в концентрации 85 млн. КОЕ/мл.
После заражения проводили забор крови, затем обрабатывали ее для световой и электронной микроскопии по известным методикам. Уровень гемоглобина в крови определяли известным гемиглобинцианидным методом [72], делали посев зараженной крови на кровяной и желточно-солевой агар. В качестве контроля использовали кровь здоровых мышей.
По результатам световой микроскопии, после 48 часов заражения, наблюдали пойкилоцитоз и анизоцитоз эритроцитов. На поверхности эритроцитов и около них было видно большое количество кокков.
Электронно-микроскопические исследования крови мышей после 48 ч заражения показали возможность проникновения клона № 5 с высокими уровнями гемолитической и антигемоглобиновой активностями в цитоплазму эритроцитов. В основе проникновения штамма S.epidermidis в цитоплазму эритроцитов лежит механизм эндоцитоза. В доступной нам литературе, процесс эндоцитоза описывается только для эпителиальных клеток и нет данных для соматических клеток.
Похожие диссертации на Антигемоглобиновая активность микроорганизмов
