Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Экологические особенности некоторых видов болезнетворных микроорганизмов в почве 7
1.1. Теоретические аспекты учения о взаимоотношениях организмов и их характеристика 18
1.2. Взаимоотношения микро- и макроорганизмов различных уровней иерархии 27
1.3. Условия формирования микробоценозов в почве 38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава II. Объекты и методы исследования 43
Глава III. Результаты исследования 52
3.1. Экологическая характеристика почв Байкальского региона 52
3.1.1. Структура микробного ценоза 52
3.1.2. Токсичность почв отдельных районов Бурятии 56
3.2. Эколого-биологическая характеристика микроорганизмов 58
3.2.1. Динамика численности роста бинарных культур в стерильной почве 58
3.2.2. Динамика численности роста бинарных культур в полевых условиях 60
3.3. Динамика численности роста патогенных и условно-патогенных представителей микробоценоза в условиях in vitro 62
3.4. Физиологические особенности выделенных микробных культур 68
3.5. Характеристика взаимоотношений патогенных, условно-патогенных микроорганизмов и представителей микробоценоза почв Бурятии 71
3.6. Антибиотикочувствительность исследованных микробных культур, выделенных из различных объектов внешней среды 75
3.7. Изучение биологических характеристик патогенных микробов в условиях естественной природной среды 83
3.8. Влияние химических соединений и температуры на рост микроорганизмов 128
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 132
ВЫВОДЫ 140
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 142
- Теоретические аспекты учения о взаимоотношениях организмов и их характеристика
- Экологическая характеристика почв Байкальского региона
- Физиологические особенности выделенных микробных культур
Введение к работе
Актуальность проблемы. Все большее научное и практическое значение приобретают вопросы экологических особенностей патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, резервирующихся в почвах региона в сапрофитической фазе существования. С ними тесно связана проблема химического и биологического загрязнения окружающей среды. Важными вопросами здесь становятся изучение экологии как самих почвенных фитопатогенов, так и антагонистической микрофлоры, подавляющей их жизнедеятельность. Немаловажное значение имеет место в изучении вопросов экологии патогенных и условно-патогенных микроорганизмов конкретного региона физиологическая характеристика оценки биологических свойств почв, в которых раскрываются условия формирования микробоценозов, структура микробного ценоза, также токсичность почв отдельных районов Бурятии.
Микробные ассоциации, включаясь в нормальный ценоз, создают «микробный пейзаж» (Радчук Н. А., 1991). Особого внимания заслуживает один из типов взаимоотношений - антагонизм у микробов. Изучение этого явления представляет обширную область исследований, как для выяснения его биологической сущности, так и целью практического использования в медицине и в ветеринарии.
Активность и возможности антагонистических микробов в Байкальском регионе исследованы еще очень слабо. Изучение вопросов экологических особенностей патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в почвах Байкальского региона и типов взаимоотношений имеют медицинские и ветеринарные аспекты.
Цели и задачи исследования. Выявить экологические особенности патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в почвах
Байкальского региона и изучить отдельные механизмы их взаимоотношений.
В задачи исследования входило:
1. Определить экологическую характеристику почв Байкальского
региона.
2. Установить эколого-биологические особенности
микроорганизмов.
3. Изучить особенности типов взаимоотношений в условиях
бинарных и монокультур в почвах региона.
4. Определить биологические характеристики патогенных микробов
в условиях естественной природной среды.
5. Выявить отношение патогенных микробов к химическим
соединениям и к температуре.
Научная новизна. В условиях Байкальского региона изучена физиологическая характеристика биологических свойств почв и их влияние на экологические особенности патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Определена характеристика взаимоотношений патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и представителей микробоценоза почв Бурятии. Выявлены токсические свойства определенных типов почв. Определены параметры существования патогенных и условно-патогенных микробов в почвах Забайкалья.
Практическая ценность. Полученные экспериментальные данные по физиологической характеристике биологических свойств почв и типов взаимоотношений в микробоценозе позволяют прийти к научно-обоснованному практическому подходу их рационального возделывания. Данные по выявлению механизмов взаимоотношений в микроценозе обосновывают научный подход в разработке биологических препаратов из местного сырья (пробиотиков), имеющих прикладное значение в медицине и в ветеринарии и обеспечивают экологическую безопасность. Материалы
исследований используются при проведении лекционно-практических занятий на кафедре микробиологии, вирусологии и ВСЭ.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции «Народы Центральной Азии в XXI веке» (Улан-Удэ - Улан-Батор, 2002), VI научно-практической конференции «Перспективные направления научных исследований молодых ученых и специалистов Урала и Сибири» (Троицк, 2002), региональной научно-практической конференции «Структура и функционирование экосистем Байкальской Сибири» (Улан-Удэ, 2003), конференции молодых ученых и аспирантов «Проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса Байкальского региона» (Улан-Удэ, 2003), международной конференции «Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных», посвященной 90-летию профессора В.Р. Филиппова (Улан-Удэ, 2003), международной научной практической конференции «Устойчивое землепользование в экстремальных условиях» (Улан-Удэ, 2003), всероссийской конференции студентов и молодых ученых аграрных вузов России (Якутск, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (2 главы), заключения, выводов и списка литературы. Работа включает 48 таблиц, 18 рисунков. Список литературы включает 206 источников.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Теоретические аспекты учения о взаимоотношениях организмов и их характеристика
В природных субстратах, подобных почвам и водоемам, микробы растут и метаболируют иным путем, чем в чистых культурах. В чистых культурах микробы свободны от ассоциативных или конкурентных явлений других микроорганизмов. В смешанных популяциях естественных субстратов между микробами возникают сложные экологические взаимоотношения. Взаимоотношения между микробами в смешанных популяциях первоначально рассматривались с точки зрения борьбы за питательные вещества. Многочисленные патогенные микробы такие как, возбудители туберкулеза, проказы, дифтерии, пневмонии, холеры и другие, постоянно попадают в почву огромных количествах, но затем погибают.
Быстрое исчезновение болезнетворных бактерий в почве может зависеть от таких факторов, как: неблагоприятные внешние условия; отсутствие подходящих питательных веществ; разрушение простейшими и другими животными; разрушение различными сапрофитами и грибам, которые являются их антагонистами; образование антагонистами токсических или антибиотических веществ, разрушающих патогенные формы; повышенное содержание бактериофагов, приводящих к лизису некоторых бактерий (О.И. Бершова, 1940);
Де Бари впервые подчеркнул в 1879 году значение антагонистических взаимоотношений микроорганизмов; когда два микроба растут на одном субстрате, раньше или позже один из них вытесняет или даже убивает другого. Это явление было названо «антибиозом» (З.А.Ваксман, 1947). Симбиотические или антагонистические взаимоотношения между микроорганизмами показывают, приводит ли данная ассоциация к взаимным выгодам микроорганизмов или же к подавлению одного из них другим. Русский исследователь А.Д. Павловский в 1877 году использовал для предохранения животных от сибирской язвы других «сородичей» грозных бацилл - пневмококков. Продолжением явилось наблюдения ученых врачей В.А. Манассейна и А.Г. Полотебнова (1868 - 1872). В.А. Манассейн описал антагонизм зеленой плесени пенициллиум по отношению к бактериям. А.Г. Полотебнов использовал пенициллиум для лечения гнойных ран и различных кожных заболеваний. Несколько позже русский ученый М.Г. Тартаковский (1904) доказал избирательное действие зеленой плесени на возбудителя холеры (А.С. Самсонова, 1985).
Мысль о практическом использовании явлений антагонизма принадлежит великому русскому ученому И.И. Мечникову. Он доказал, что молочнокислые бактерии подавляют развитие вредных гнилостных микробов, обитающих в кишечнике животных и человека.
Установлено, что антагонистические взаимоотношения возникают в основном между микробами разных систематических групп -актиномицетами и бактериями, плесневыми грибами и бактериями, спорообразующими и неспоровыми бактериями.
Антагонизм (антибиоз), или интерференция - это отрицательные конкурентные взаимоотношения между видами паразитоценоза. Частными случаями конкуренции являются: конкуренция в узком смысле слова; антагонизм, или аллеопатическое ингибирование, непосредственная борьба между представителями разных видов, или агрессия.
Антагонистические взаимоотношения, или антибиоз (Г. Уорд, 1899), некоторые биологи, чаще микробиологи, называют интерференцией. Эти взаимоотношения могут выражаться - в задержке размножения, роста и развития, потере вирулентных свойств или даже патогенности одним или несколькими конкурирующими видами. Эта форма взаимоотношений широко распространена в паразитоценозах. Известный микробиолог З.А. Ваксман (1952) различает пять форм антагонизма: антагонизм между видами; подавляющая, бактерицидная и литическая формы антагонизма, также бактерицидная, бактериостатическая, фунгицидная и фунгиостатическая форма антагонизма; прямой, косвенный и настоящий антагонизм; односторонний или двусторонний антагонизм; антагонизм между штаммами одного и того же вида и антагонизм между штаммами различных видов.
Взаимное влияние при антагонизме чаще осуществляется путем выделения одним из сочленов или некоторыми из них в окружающую среду органических ингибиторов, которые тормозят рост или препятствуют размножению других видов. Токсические вещества, выделяемые антагонистами, включают в себя самые разнообразные соединения, начиная от простых органических кислот и спиртов и кончая сложными телами белковой или полипептидной природы.
Особую группу образуют микробы-антагонисты, выделяющие сильнодействующие яды. Одни из них продуцируются клеткой микроба в окружающую среду и по химической природе представляют белки. Это так называемые экзотоксины. Другие остаются в клетке и выходят из нее только после ее гибели. Это эндотоксины, они относятся к сложным сахарам.
Влияние может совершаться так же путем объединения или обогащения окружающего субстрата в благоприятную или неблагоприятную сторону, быстрым исчерпыванием пищевых средств, образованием пигментов. Например, циркулируя в крови, токсические вещества, выделяемые антагонистами, могут оказывать влияние на своих противников на значительном расстоянии, создавая пространственный антагонизм. Антагонисты могут менять рН среды в сторону, неприемлемую для противника, или же менять температуру среды. Не исключается так же физическое влияние путем изменения электрического потенциала, электропроводимости и электромагнитных излучений (СВ. Павлович, 1975).
Многие химические вещества, выделяемые антагонистами, названы антибиотиками, по их способности подавлять жизнь других веществ. В настоящее время антибиотики исчисляются десятками и широко применяются с лечебной целью в медицине и ветеринарии.
Описанные многими авторами ингибиторные вещества различались по своей термоустойчивости, по способности диффундировать в агар и проникать через бактериальные фильтры. Большинство этих веществ было активно и против самих штаммов-продуцентов.
Штаммы, обладающие способностью продуцировать бактериоцины (Jacob, 1953), называются бактериоциногенными. От других антибиотиков бактериоцины отличаются узким спектром антибактериального действия. Они специфически подавляют бактерии того же или филогенетически родственных видов. Феномен бактериоциногении характеризуется еще одной важной особенностью: синтез бактериоцина является процессом, летальным для продуцирующей его клетки. (Jacob и соавт, 1952; Jacob, 1954; Ivanovics & Alfoldi,1957; Ozeki и соавт, 1959).
Так, колицины, продуцируемые кишечной палочкой, подавляют развитие энтеробактерий, относящихся к родам Эшерихия, Шигелла, Сальмонелла; пестицины (бактериоцины чумного микроба) оказывают ингибиторное действие не только на P. pestis, но и на бактерии псевдотуберкулеза; пиоцины активны против бактерий Ps. Pyocyanea; вибриоцины - против холерного вибриона. Для грамположительных микробов характерен более широкий круг специфичности. Например, стафилококкцины, помимо стафилококков, могут убивать листерелл (некоторые штаммы) дифтерийных коринебактерий. Относительно широким спектром действия отличаются моноцины, мегацины, энтероцины. Tomlinson (цит. no Parker, Simmons, 1959) установил, что более половины штаммов Staphylococcus aureus ингибировали рост коринебактерий. Зоны торможения роста, формируемые этими штаммами, были узкими, с четко ограниченным краем. Зоны задержки роста, образованные другими штаммами стафилококков, были более широкими, с нечетко выраженным, расплывчатым краем. На основании этих данных можно было предположить, что различные штаммы стафилококков продуцируют разные ингибиторные вещества. Затем стало известно, что штаммы S. aureus продуцируют, по крайней мере, два типа бактериоцинов.
Выделение бактериоциноподобных веществ (моноцинов) некоторыми штаммами Listeria monocytogenes после воздействия ультрофиолетовых лучей описано Sword и Pickett (1961). Моноцины активны не только против штаммов листерий, но и против некоторых штаммов стафилококков, Bac.megaterium, Вас. subtilis, Вас. cereus. Они термолобильны (разрушаются при 48-50). Осаждаются сульфатом аммония при 50% насыщения. Характерной чертой моноцинов является их резистентность к трипсину и L-химотрипсину.
Экологическая характеристика почв Байкальского региона
При трансформации целинных лугово-черноземных почв в пахотные меняется пул и структура микробного ценоза, увеличивается размах годовых колебаний численности микроорганизмов. Это обусловлено тем, что наряду с изменением физических условий при обработке, улучшением структуры порового пространства, степени обводненности и аэрации в пахотной почве усиливается континентальность почвенного климата - расширяется амплитуда суточных, месячных и годовых колебаний температуры и влажности (Дугаров В. И., Куликов А. И., 1980).
Широкое распространение актиномицетов в лугово-черноземных мерзлотных почвах даже при ограниченном видовом составе является особенностью данных почв и объясняется высокой приспособленностью этих видов микроорганизмов к жесткому климату почв. Уровень содержания микроскопических грибов в микробном ценозе пахотных почв снижается - 0.3% от общего числа. Видовой состав грибов однообразен. Часто встречаются грибы со стерильными гифами. Образование спор и органов размножения в них очень замедленно (Нимаева С.Ш., 1990).
Специфика экологических условий черноземов с нестабильным гидротермическим режимом, низким содержанием органического вещества и биофильных элементов отражается на количественном составе микробного ценоза в его групповом соотношении, в свою очередь определяя потенциальные возможности образования и накопления элементов почвенного плодородия и интенсивность биологического круговорота вещества в целом. Наиболее отличительной чертой исследуемых черноземов является соотношение основных групп в микробном ценозе. В черноземах преобладают актиномицеты, бактерии имеют меньший удельный вес. Преобладающее развитие актиномицетов в данных черноземах является следствием аридности почвенного климата, высокой концентрации почвенного раствора, ограниченности доступных органических соединений в почвах, развитие бактерий и грибов заторможено (Нимаева С.Ш., 1992). Доминирующее развитие актиномицетов (62,2%) в микробном ценозе предопределяет особенность и интенсивность биохимической трансформации всех органических и минеральных соединений в данных черноземах.
Бактерии в микробном ценозе составляют 37,8%. Ограничивающим фактором развития является низкая влажность почв. Подавляющая часть бактерий представлена неспороносными формами. В составе спорообразующих доминирующими видами являются Вас. megateriunr л Вас. mesentericus (40-70% от общего количества спорообразующих). Широкое распространение в черноземных почвах имеет Вас. subtilis. Распространение указанных видов характеризует высокую степень минерализационных процессов в данных почвах.
В грибной флоре черноземных почв Бурятии доминируют представители рода Penicillium (40 - 50% от общего количества грибов). Общая численность в 1 г почвы и удельный вес грибов в микробном ценозе незначительны.
Малый удельный вес бактерий в микрофлоре - результат ксерофитности почвенных условий и, вероятно, антагонистических воздействий широко распространенных актиномицетов. Интенсивное развитие последних вызвано их способностью адаптироваться к низкой влажности окружающей среды и высокой физиологической активностью. В сентябре 2002 года исследовалась микробиологическая активность почв: мерзлотная лугово-черноземная (пашня), мерзлотная луговая (пашня), мерзлотная серая лесная (целина, пашня, лес) и чернозем мучнисто-карбонатный глубокопромерзающий (пашня).
Максимальная численность бактерий, ассимилирующих органические формы азота, выявлена в мерзлотной луговой почве (пашня). Количество бактерий здесь составляет 6,6 млн/г сухой почвы. Наименьший показатель численности бактерий (2,9 млн.) обнаружен в мерзлотной серой лесной почве (целина). Сравнительно равным содержанием бактерий характеризуются мерзлотная лугово-черноземная почва (пашня) и мерзлотная серая лесная почва (пашня). Здесь численность составляет 4,0 млн. и 3,9 млн. соответственно.
По данным наших исследований количество актиномицетов в мерзлотной лугово-черноземной почве (пашня) и мерзлотной луговой почве (пашня) равнялось 7,3 млн/1 г сухой почвы в каждой. Наименьшее содержание актиномицетов (1,8 млн.) обнаружено в мерзлотной серой лесной почве (целина). Несколько выше было содержание актиномицетов в мерзлотной серой лесной почве (пашня). Количество их равнялось 5,3 млн (рис. 1).
Малый удельный вес бактерий в микрофлоре - результат воздейстий широко распространенных актиномицетов. Интенсивное развитие последних вызвано их способностью адаптироваться к низкой влажности окружающей среды и высокой физиологической активностью. Количество актиномицетов превосходит численность бактерий, что является отличительной особенностью криоридных почв (Нимаева С.Ш., 1992).
Физиологические особенности выделенных микробных культур
По результатам постановки биохимических тестов (табл. 5) провели анализ ферментативных свойств. Из сводных данных таблицы № 6 видно, что с отрицательным результатом большинство (более 50%) из количества исследованных культур заканчивались тесты на фенилаланиндезаминазу - 84% (21 культура), на орнитиндекарбоксилазу -64% (16 культур), на аргининдекарбоксилазу - 88% (22 культуры), с дульцитом - 60% (15 культур), с маннитом - 56% (14 культур), с раффинозой - 72% (18 культур), с сахарозой - 64% (16 культур), на выявление сероводорода - 48% (12 культур).
Результаты опытов на ферментацию углеводов с образованием кислоты с глюкозой - 80% (20 культур), с мальтозой - 92% (23 культуры), с лактозой - 48% (12 культур), с образованием каталазы - 56% (14 культур) были положительными.
Пробы на сбраживание дульцита - 16% (3 культуры), мальтозы -4% (1 культура), маннита - 8% (2 культуры), а также опыты на выявление сероводорода составляли 8% ( 2 культуры) случаях были сомнительными (табл. 6).
В природных условиях обитания, в сложных микробных сообществах, антагонисты при наличии благоприятных условий продуцируют антибиотические вещества в субстрат и оказывают на своих сожителей определенное действие. Сожительствующие формы микробов либо подавляются этими антибиотиками и прекращают или замедляют свой рост, либо адаптируются к нему и обитают совместно с антагонистами.
Характерной особенностью антагонистов, образующих антибиотические вещества, является специфика взаимодействия. Суть ее состоит в том, что микробы - антагонисты своими антибиотиками не подавляют роста культур собственного вида, они действуют только на организмы, принадлежащие к другим видам.
Изучение явления антагонизма между микроорганизмами представляет обширную область исследований как для выяснения его биологической сущности, так и с целью практического использования наиболее активных к ним патогенных микробов.
В наших исследованиях мы использовали несколько методик определения антагонизма микроорганизмов: штриховой, метод бумажных дисков и метод лунок.
Полученные данные свидетельствовали о присутствии антагонистических отношений между некоторыми микроорганизмами.
Высоким антагонистическим действием по отношению к патогенным бактериям обладали штаммы культур рода Bacillus, это штаммы В. cereus, В. subtilis Л2 (Мирзоева В. А., 1959). Кишечная палочка является угнетаемой культурой для таких антагонистов как В. cereus, В. pseudoanthracis и В. subtilis Л2. В свою очередь, В. pseudoanthracis не размножалась под действием В. megaterium 89 и В. cereus. Установлено, что St. aureus задерживала свой рост под влиянием кишечной палочки 25922 и S. typhimurium 79. Для St. albus авляется антагонистом Е. coli 25922. S. typhimurium 79 угнетаема при совместном росте с В. megaterium 89, В. subtilis и В. subtilis Л2. Исследования показали, что штамм для В. mycoides 79 антагонист В. subtilis. St. albus подавляет размножение В. cereus. На штамм культуры L. monocytogenes 1219 антагонистически действует В. subtilis, В. myxodens, В. subtilis Л2, Str. milleri. Рост вакцинных штаммов В. anthracis шт. 55 и СТИ ингибировали В. subtilis Л2 и В. subtilis, а также Diploccocus septicus и S. dublin, соответственно. St. aureus антагонист для В. megaterium 89 (табл. 7).
Таким образом, 5,4% из всех исследуемых культур являлись антагонистами. Наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладали споровые культуры рода Bacillus, относящиеся к типичным сапрофитам. Было отмечено явление антагонизма и среди патогенных микроорганизмов, но оно было меньше выражено. В свою очередь, колонии культур синергистов росли такими же без изменений как и в монокультурах.
Установлено что, у патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в условиях длительного хранения сохраняются эволюционно закрепленные признаки явления антагонизма, что может иметь практическую значимость в использовании этих признаков при конструировании ассоциированных вакцин и как корректоров в вопросах дисбиоза.
