Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Физиолого-ьиохимическая характеристика процесса брожения и применяемых в нем микроорганизмов и материалов
1.1. Характеристика и особенности гидролиза полисахаридов целлюлозо- и 8
крахмалосодержащего сырья
1.1.1. Крахмалсодержащее сырье 8
1.1.2. Лигноцеллюлозное сырье и отходы сельскохозяйственного производства 13
1.2. Ферменты и ферментные комплексы для гидролиза природных полисахаридов
1.2.1. Амилазы 17
1.2.2. Целлюлазы 22
1.3. Характеристика микроорганизмов, используемых для сбраживания растительного сырья 27
1.3.1. Дрожжи 27
1.3.2. Бактерии, используемые для производства спирта 33
1.4. Особенности сбраживания растительного сырья 37
1.4.1. Классическая технология сбраживания 3 7
1.4.2. Химизм брожения 44
1.4.3. Новые направления в бродильных технологиях 47
Глава 2. Объект и методы исследования
2.1. Объект исследования 53
2.2. Реактивы, субстраты и материалы 53
2.3. Постановка эксперимента 55
2.4. Методы исследования 57
2.5. Математическая и статистическая обработка результатов 68
Глава 3. Изучение влияния способа предобработки крахмалистого сырья на эффективность его ферментативного гидролиза
3.1. Влияние продолжительности физико-механической обработки зернового
сырья на эффективность его измельчения и распределение частиц по размерам в 69
ультрадисперсной фракции
3.2. Влияние продолжительности механико-ферментативной обработки зернового сырья на эффективность его гидролиза мезофильными мультиэнзимными препаратами
3.3. Влияние продолжительности механико-ферментативного воздействия и условий обработки зернового сырья на эффективность его гидролиза 85 термостабильными мультиэнзимными препаратами
Глава 4. Изучение влияния способа предобработки лигноцеллюлозного субстрата на эффективность его ферментативного гидролиза
4.1. Влияние продолжительности физико-механической обработки лигноцеллюлозного сырья на эффективность его измельчения и распределение частиц по размерам в ультрадисперсной фракции
4.2. Влияние продолжительности механико-ферментативной обработки и способа предобработки лигноцеллюлозного сырья на эффективность его гидролиза мезофильными мультиэнзимными препаратами
Глава 5. Изучение процессов сбраживания осахаренного зернового и лигноцеллюлозного субстратов
5.1. Изучение динамики и эффективности сбраживания зернового субстрата 105
5.2. Изучение эффективности сбраживания лигноцеллюлозного субстрата 111
Заключение 117
Выводы 122
Список сокращений и условных обозначений 123
Список использованных источников 124
- Ферменты и ферментные комплексы для гидролиза природных полисахаридов
- Реактивы, субстраты и материалы
- Влияние продолжительности механико-ферментативной обработки зернового сырья на эффективность его гидролиза мезофильными мультиэнзимными препаратами
- Влияние продолжительности механико-ферментативной обработки и способа предобработки лигноцеллюлозного сырья на эффективность его гидролиза мезофильными мультиэнзимными препаратами
Ферменты и ферментные комплексы для гидролиза природных полисахаридов
Зерно культурных злаков имеет сходное строение и состоит из трех основных частей, различных по физиологическому назначению и химическому составу: зародыша, эндосперма и оболочек (плодовой и семенной) (Ferreira М. S., Samson М. F., Bonicel J. [et al.] Relationship between endosperm cells redox homeostasis and glutenin polymers assembly in developing durum wheat grain II Plant Physiol. Biochem. 2012. Vol. 61. P. 36-45). Зерно ячменя покрыто сверху цветочными пленками, поэтому его относят к пленчатым культурам, а рожь и пшеницу - к голозерным (Hands P., Kourmpetli S., Sharpies D. [et al.] Analysis of grain characters in temperate grasses reveals distinctive patterns of endosperm organization associated with grain shape II J. Exp. Bot. 2012. Vol. 63(17). P. 6253-6266).
Для спиртового производства наиболее важным компонентом является эндосперм, поскольку в нем сосредоточена основная масса крахмала зерна (Montano-Leyva В., Ghizzi D. da Silva G., Gastaldi E. [et al.] Biocomposites from wheat proteins and fibers: structure I mechanical properties relationships II Industrial Crops and Products. 2013. Vol. 43. P. 545-555). Ткани эндосперма построены преимущественно из тонкостенных клеток, поэтому содержание клетчатки, гемицеллюлоз и зольных элементов в них минимально. Другие части зерновки - оболочка и зародыш, напротив, состоят из повышенного количества некрахмалистых полисахаридов, липидов и белков (Borght A. van der, Goesaert Н., Veraverbeke W. S. [et al.] Fractionation of wheat and wheat flour into starch and gluten: overview of the main processes and the factors involved II J. of Cereal Science. 2005. Vol. 41, Iss. 3. P. 221-237; Singh S., Gupta A. K., Kaur N. Influence of drought and sowing time on protein composition, antinutrients, and mineral contents of wheat II Scientific World J. 2012. P. 451). Эти соединения при производстве спирта служат балластными веществами, так как не повышают его выход из единицы сырья, а, напротив, могут ухудшить качественные и количественные параметры этанола (Крикунова Л. Н., Максимова Е. М. Повышение эффективности производства этанола из ржи разделением фракции полисахаридов // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2001.№ 4. С. 20-22).
При переработке зерна по традиционной технологии зерновки со всеми анатомическими частями поступают в технологический процесс, включающий стадии измельчения, водно-тепловой обработки замеса, приготовления и сбраживания сусла, выделения из бражки этилового спирта (Степанов В. П., Римарева Л. В., Иванова В. В. [и др.] Метод переработки крахмалсодержащего сырья при получении концентрированного зернового сусла // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2007. № 3. С. 16-17; Talebnia F., Karakashev D., Angelidak I. Production of bioethanol from wheat straw: An overview on pretreatment, hydrolysis and fermentation II Bioresource Technology. 2010. Vol. 101, Iss. 13. P. 4744-4753). При переработке зерна ржи наиболее технологически сложно добиться конверсии гемицеллюлоз, выступающих одновременно запасными углеводами зерновки и опорной тканью (Revanappa S. В., Salimath Р. V. Structural characterization of hemicellulose A from wheat (Triticum aestivum) varieties differing in their chapati-making quality II Carbohydrate Polymers. 2010. Vol. 79, Iss. 3. P.655-659). Большая их часть при классической переработке остается незатронутой, и лишь около 25 % могут быть прогидролизированы под действием целлюлолитических ферментов с образованием водорастворимых веществ, повышающих вязкость растворов (Жуков С. В. Разработка технологических решений по совершенствованию сортовых помолов ржи : .дис... канд. техн. наук. М., 2008. 189 с; Peng F., Peng P., Xu F. [et al.] Fractional purification and bioconversion of hemicelluloses II Biotechnology Advances. 2012. Vol. 30, Iss. 4. P. 879-903). Однако в настоящее время эти препараты вследствие высокой стоимости спиртовыми заводами практически не используются (Васильева Н. Я., Цурикова Н. В., Широкова Т. Ю. [и др.] Сбраживание крахмалосодержащего сырья с применением ферментного препарата Целловиридин Г2х // Хранение и переработка сельхозсырья. 2001. № 4. С. 46-47; Калинина О. А., Гусева Т. П., Колдин Э. Н. Оптимизация переработки зерна ржи в спиртовом производстве // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2004. № 1. С. 18-20). Важная особенность ржи и ячменя - наличие в их составе от 2,5 до 7,4 % (на сухое вещество зерна) гумми-веществ (слизей), способных изменять реологические характеристики сусла при набухании в воде. За счет присутствия в ржаных слизях разветвленной арабаноксилановой фракции происходит возникновение стойких комплексов слизей с белковыми веществами (Sarossy Z., Tenkanen М., Pitkanen L. [et al.] Extraction and chemical characterization of rye arabinoxylan and the effect of P-glucan on the mechanical and barrier properties of cast arabinoxylan films II Food Hydrocolloids. 2013. Vol. 30, Iss. 1. P. 206-216). Слизи препятствуют набуханию крахмала и снижают воздействие на него ферментов (Dorfer J., Weber D., Dieckmann H. [et al.] Effects of High Pressure Disintegration on Solubility and Molecular Properties of Rye Water Solubles IILWT - Food Science and Technology. 1997. Vol. 30, Iss. 6. P. 620-623). Значительные трудности при переработке ржаного и ячменного материалов в спиртовом производстве связаны с высоким содержанием в них гумми-веществ (почти в 2 раза больше, чем в пшенице) и их способностью к образованию нерастворимых комплексов с белковыми веществами (Rakha A., Aman P., Andersson R. Characterisation of dietary fibre components in rye products II Food Chemistry. 2010. Vol. 119, Iss. 3. P. 859-867; Aman P., Bengtsson S. Periodate oxidation and degradation studies on the major water-soluble arabinoxylan in rye grain II Carbohydrate Polymers. 1991. Vol. 15, Iss. 4. P. 405-414).
В спиртовом производстве низкую эффективность имеет применение пленчатых культур. Дробление неочищенной зерновки происходит неравномерно из-за высокой механической прочности оболочек, а образующаяся шелуха препятствует сбраживанию сусла. Данная проблема исследуется уже много лет (Иванова Е. Г., Киселева Л. В., Ленец Н. Г. [и др.] Влияние гемицеллюлаз на гидролиз некрахмальных полисахаридов // Пиво и напитки. 2002. № 2. С. 19-22; Nilsson М., Saulnier L., Andersson R. [et al.] Water unextractable polysaccharides from three milling fractions of rye grain II Carbohydrate Polymers. 1996. Vol. 30, Iss. 4. P. 229-237; Edwards M. A., Osborne B. G., Henry R. J. Investigation of the effect of conditioning on the fracture of hard and soft wheat grain by the single-kernel characterization system: A comparison with roller milling II J. of Cereal Science. 2007. Vol. 46, Iss. 1. P. 64-74). Так, известен способ их подработки, который сводится к разрушению и удалению оболочек зерна и состоит из шелушения или дробления зерна и последующей сортировки его по величине и отсева оболочек. Однако до сих пор на спиртовых заводах такая подработка практически не применяется, а переработка пленчатых культур осуществляется совместно с голозерными (20-30 % от общей массы сырья) (Бутковский В. А., Мерко А. И., Мельников Е. М. Технологии зерноперерабатывающих производств. М. Интерграф сервис, 1999. 472 с). Однако, как указывалось ранее, применение ферментных препаратов целлюлолитического действия, способных расщеплять некрахмалистые полисахариды зерна, в частности целлюлозу, позволяет полностью перерабатывать пленчатые культуры (Коимов Г. С. Химия и технология пищевых продуктов: в 2 т. Т.1: Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов. М. : Агропромиздат, 1998. 188 с; Васильева Н. Я. Сбраживание крахмало-содержащего сырья с применением ферментного препарата Целловиридин Г2х С. 46-47; Яковлев А. Н., Корнеева О. С, Востриков С. В. [и др.] Интенсификация переработки ржи на этанол с использованием мультиэнзимного комплекса // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2009. № 4. С. 12-14; Зоров И. Н., Синицын А. П., Кондратьева Е. Г. Оценка эффективности кормовых ферментных препаратов при разрушении некрахмальных полисахаридов зерновых субстратов // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42, № 6. С. 705-709).
Особая роль в спиртовом производстве отводится белкам, т.к. аминокислоты, как продукты их гидролиза, являются источником азотного питания для дрожжевых клеток. При водно-тепловой обработке зерна из белков сырья солюбилизируется от 20 до 50 % азотистых веществ, в зависимости от их количественного и качественного состава (Востриков СВ., Саутина Н. В. Влияние степени измельчения пшеницы на распределение белка и сбраживаемых углеводов // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2005. № 1. С. 36; Manu В. Т., Prasada Rao U. J. S. Influence of size distribution of proteins, thiol and disulfide content in whole wheat flour on rheological and chapati texture of Indian wheat varieties II Food Chemistry. 2008. Vol. 110, Iss. 1. P. 88-95; Blanchard C, Laboure H., Verel A. [et al.] Study of the impact of wheat flour type, flour particle size and protein content in a cake-ike dough: Proton mobility and rheological properties assessment II J. of Cereal Science. 2012. Vol. 56, Iss. 3. P. 691-698). Но основная часть белковых веществ зерна в процессе спиртового брожения не участвует, а выводится в дальнейшем в составе послеспиртовой барды (Востриков СВ., Саутина Н. В. Влияние степени измельчения пшеницы на распределение белка и сбраживаемых углеводов // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2005. № 1. С. 36).
Реактивы, субстраты и материалы
Объемные проценты спирта (которые называются градусами) и весовые вычисляют по относительной плотности дистиллята при 20 С.
Определение Сахаров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Хеншен А., Хупе К. П., Лотшпайх Ф. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М. : Мир, 1988. 688 с; Гото М., Джинно К., Исси Д. [и др.] Введение в микромасштабную высокоэффективную жидкостную хроматографию. М. : Мир, 1991. 240 с; Сычев К. С, Курганов А. А. Практическое руководство по жидкостной хроматографии. М. : Техносфера, 2010. 272 с; Сычев С. Н., Гаврилина В. А. Высокоэффективная жидкостная хроматография : аналитика, физическая химия, распознавание многокомпонентных систем. М. : Лань, 2013. 255 с) является разновидностью колоночной хроматографии. Графический результат хроматографического процесса выражается в виде хроматограммы, которая представляет собой зависимость отклика детектора хроматографа (уровень сигнала в милливольтах) от времени при прохождении элюата через ячейку детектора. Хроматограмма состоит из ряда пиков, каждый из которых при полном разделении соответствует одному компоненту анализируемой пробы. Площадь или высота пика должна быть пропорциональна концентрации компонента в элюате.
Важнейшей характеристикой хроматограммы является время пребывания исследуемого вещества в хроматографе, зависящее от длины колонки и характеристик ее сорбента. На практике его определяют от момента ввода пробы в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала детектора. Каждое вещество при одних и тех же хроматографических условиях имеет свое время удерживания.
В проведенных экспериментах для исследований методом ВЭЖХ применен хроматограф «LC 20 Prominence» («Shimadzu», Япония). Исследования проводились на 2 типах колонок -SupelcoSil Pb (предназначена для разделения близких по свойствам соединений, растворимых в воде, с последующим анализом на рефрактометрическом детекторе RJD 10А) и SupelcoGel LC-NH2 (предназначена для разделения простых кислот и Сахаров, растворимых в смеси вода-ацетонитрил, анализ проводился последовательно на спектрофотометрическом детекторе SPD-20А и рефрактометрическом детекторе RTD 10А). В основе количественного анализа лежит зависимость высоты пика h или его площади S от количества вещества. Для узких пиков предпочтительнее измерение /г, для широких и размытых — S. Пробы анализировались с использованием программы обработки LC Solution v.2.0.1. по калибровочным стандартам. Для калибровки применены реактивы степенью чистоты не ниже ОСЧ.
Количественное определение Сахаров по реакции с пикриновой кислотой (по Крезелиусу-Зейферту) (Kadimaliev D. A., Revin V. V., Shutova V. V. Use of the fungus Panus Tigrinus in the manufacture of pressed materials from cotton plant waste II Appl. Biochem. Microbiol. 2004. Vol. 40, Iss. 1. P. 49-52). При взаимодействии редуцирующих Сахаров с пикриновой кислотой они окисляются до соответствующих кислот, а пикриновая кислота восстанавливается в пикраминовую, обладающую красной или буровато-красной окраской. Метод пригоден для количественного определения глюкозы, галактозы, арабинозы, фруктозы, рамнозы, ксилозы, мальтозы, лактозы и крахмала. Используется при определении активности целлюлаз и ряда проб с продолжительностью помола до 25 мин. Ошибка может превышать 10-20%.
Содержание редуцирующих веществ рассчитывали по калибровочной кривой, составленной по стандартным растворам глюкозы, которые готовили из исходного раствора, содержащего 300 мг глюкозы в 100 мл дистиллированной воды. Для получения калибровочной кривой исходный раствор разбавляли, получая растворы с содержанием глюкозы 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,5 мг в 1 мл. Для определения концентрации глюкозы к 1 мл испытуемого раствора прибавляли 2 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1 мл 20% раствора МагСОз, после чего пробирку переносили на 30 мин в кипящую водяную баню. Раствор охлаждали до комнатной температуры и доводили дистиллированной водой до 10 мл. Оптическую плотность определяли при 455 нм.
Определение Сахаров глюкозоксидазно-пероксидазным методом (набор «Глюкоза-ФС»). (По инструкции к набору). При окислении b-D-глюкозы кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы (ГО) образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы (ПО) перекись водорода окисляет 4-аминоантипирин (4-ААП) в присутствии фенольных соединений в окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемом образце и измеряется фотометрически при длине волны 460-540 нм.
Приготовление рабочего раствора. Таблетку ферментов-хромогенов растворяли в 100 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивая, без встряхивая. Допускается наличие мелких нерастворенных частиц.
Постановка опыта. В 10 мл дистиллированной воды готовили пять разведений с разной концентрацией глюкозы, а именно: 0,5, 1, 1,5, 2, 5 мг/мл. В семь пробирок наливали по 10 мл приготовленного рабочего раствора. В первые пять пробирок микропипеткой добавляли по 50 мкл приготовленных образцов глюкозы, в шестую - 50 мкл глюкозы из стандартного набора, В седьмую - 50 мкл дистиллированной воды.
Пробы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 15 мин при 37 С или 25-30 мин при 18-25 С при комнатной температуре. Через 5-10 мин после начала инкубации пробирки с пробами интенсивно встряхивали вручную. По окончании инкубации измеряли оптическую плотность опытной и калибровочной проб против холостой пробы в кюветах с длиной оптического пути 5 или 10 мм при длине волны 500 (490-540) нм. Окраска проб стабильна более 4 ч. после окончания инкубации.
Определение глюкозы глюкозоксидазно-пероксидазным методом (Короткова О. Г., Рожкова А. М., Матыс В. Ю. [и др.] Применение комплексного ферментного препарата с увеличенной активностью эндоглюканазы для переработки целлюлозосодержащей биомассы // Хранение и переработка сельхозсырья. 2011. №. 4. С. 29). Реагент I представляет собой раствор субстратов пероксидазы в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,0. Реагент II представляет собой раствор глюкозооксидазы и пероксидазы со стабилизаторами. Реагент III готовится смешением реагента I и реагента II в соотношении 40:1. Для проведения анализа к 1 мл реагента III добавляют 100 мкл пробы, инкубируют при температуре 40 С в течение 15 мин, и измеряют оптическую плотность при 490 нм. Концентрацию глюкозы рассчитывают по заранее построенному по известным концентрациям глюкозы калибровочному графику.
Метод определения целлюлозы в опилках (Оболенская А. В., Щеголев В. П., Аким Г. Л. [и др.] Практические работы по химии древесины и целлюлозы. М. : Лесная пром-сть, 1965. 412 с, Костюкевич Н. Г. Химия древесины : учебное пособие. СПб. : СПбГЛТА, 2010. 90 с). Навеску субстрата массой 200 мг заливали 6 мл уксусно-азотного реактива (150 мл 80 % уксусной кислоты и 15 мл концентрированной азотной кислоты). Сначала добавляли 1 мл уксусно-азотного реактива, перемешивали, затем добавляли еще 5 мл и перемешивали. Пробирку с навеской помещали на 30 мин в кипящую водяную баню, уровень воды в которой соответствовал уровню жидкости в пробирке. Затем центрифугировали 5 мин при 8000 об"1, декантировали и супернатант отбрасывали. К осадку добавляли 10 мл дистиллированной воды. Вновь центрифугировали 5 мин при 8 000 об"1, декантировали и супернатант отбрасывали. Добавляли в пробирку 10 мл дистиллированной воды, перемешивали и профильтровывали через предварительно высушенный при 105 С до постоянной массы бумажный фильтр, затем клетчатку промывали дистиллированной водой и 0,2 н спиртовым раствором КОН. Фильтры с целлюлозой высушивали при 105 С.
Метод определения лигнина (Костюкевич Н. Г. Химия древесины : учебное пособие. СПб. : СПбГЛТА, 2010. 90 с). Содержание лигнина в лигноцеллюлозных субстратах определяли весовым методом в следующей модификации. Исходные опилки и опилки, подвергнутые различным типам воздействий, измельчали на ножевой мельнице до размеров 2-7 мм. Затем экстрагировали смесью бензола и спирта (2:1 по объему) в течение 3-4 суток, а затем в течение 1 суток - спиртом. После этого растворитель сливали, а опилки промывали водой и высушивали при 60С. Подготовленные таким образом опилки измельчали на шаровой мельнице в течение 30 мин. Экстракцию лигнина осуществляли смесью диоксана и воды (9:1 по объему) в присутствии 0,1 % НС1 конц. в течение 28 ч при 85С. Очистку полученного препарата проводили путем многостадийного переосаждения. Для этого экстракт упаривали досуха, а осадок растворяли в 90 % СНзСООН. Раствор по каплям и при энергичном перемешивании вливали в сосуд с дистиллированной водой. Лигнин осаждался в виде хлопьевидного осадка, который отделяли центрифугированием, высушивали и растворяли в смеси дихлорэтана и этанола (2 : 1 по объему), осаждали, вливая по каплям при постоянном перемешивании в эфир, центрифугировали, высушивали и взвешивали на аналитических весах.
Влияние продолжительности механико-ферментативной обработки зернового сырья на эффективность его гидролиза мезофильными мультиэнзимными препаратами
Как видно из полученных данных, использование штамма Ethanol Red позволяет добиться большего выхода спирта с единицы массы сырья, при этом сбраживание пшеницы приводит к большему выходу спирта по сравнению с ячменем и рожью. Полученное соотношение по выходу продукта согласуется с результатами других ученых, исследовавших данные виды сырья (Зуева Н. В., Востриков С. В. Исследование процессов получения и сбраживания спиртового сусла с различным углеводным составом // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2008. № 3. С. 10-13).
Таким образом, показано, что при сбраживании сусла из ультрадиспергированной пшеницы основным потребляемым моносахаридом является глюкоза. При внесении неактивированных дрожжей активация проходит в течение 120-180 мин и сопровождается снижением рН, увеличением потребления глюкозы и кислорода в сусле и резким ростом биомассы. Максимальное накопление спирта дрожжами S. cerevisiae характерно для проб с высокой эффективностью гидролиза сырья.
На следующем этапе исследования использовали предварительно обработанное по оптимизированной схеме ультрадисперсное лигноцеллюлозное сырье. В опытах, описанных в главе 4, показали, что для эффективного ферментативного гидролиза лигноцеллюлозное сырье нуждается в дополнительной обработке физическими факторами воздействия. При этом, полученное после гидролиза сусло является более «бедным» по содержанию глюкозы по сравнению с суслом из крахмалистого сырья. На нем дрожжи медленнее активируются по причине ингибирования растворимыми соединениями и недостатка свободной глюкозы.
Основу сусла из ультрадиспергированной древесины сосны, как показано в п. 4.2, составляет глюкоза при незначительной концентрации недоосахаренной целлобиозы и ряда более длиноцепочечных целлюлоолигосахаров. В гидролизате пентозансодержащего сырья, такого как древесина березы, половина выделенных моносахаридов приходится на пентозы, которые потребляются не всеми штаммами дрожжей (Querol A., Fleet Gr. Н. Yeasts in Food and Beverages. Berlin : Springer-Verlag, 2006. 430 p; Wisselink H. W., Toirkens M. J., Rosario Franco Berriel M. del [et al.] Engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic alcoholic fermentation of L-arabinose II Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73. P. 4881-4891), в том числе и выбранными . В нашем следующем эксперименте изучали влияние дисперсности сырья и высвобождения из него простых Сахаров на накопление этилового спирта. Для сбраживания в качестве основного продуцента выбраны изученные ранее дрожжи S. cerevisiae Angel, что позволит нам выявить корреляцию между сбраживанием различных субстратов. Дрожжи S. cerevisiae расы Angel вносили в объеме 0,1 % по отношению к массе сусла. Дрожжи предварительно не активировали. Сусло модифицировалось нитратом калия, который вносили в количестве 0,01 % от массы субстрата (Востриков С. В., Яковлев А. Н., Бушин М. А. Влияние сбалансированного состава зернового сусла на процесс биосинтеза дрожжевой биомассы // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2006. № 2. С. 32-33). По данным, представленным в таблице 5.3, наблюдаем медленное потребление дрожжами Сахаров, в частности глюкозы.
Динамику процесса можно связать с замедленным обменом между основными компонентами бражки без перемешивания и низкой скоростью метаболических процессов дрожжей на «бедном» субстрате. Это приводит к недостаточному начальному накоплению биомассы, поскольку дрожжи недополучают питательные вещества и ингибируются производными смол и лигнина. Остаточное содержание глюкозы к 72 часу культивирования позволяет пролонгировать брожение, однако оно позволит накопить незначительное количество спирта, т.е. неэффективно с технологической точки зрения.
На следующей стадии эксперимента исследовали сбраживание сусла, полученного из предварительно обработанных субстратов. С учетом анализа динамики потребления глюкозы и опираясь на проведенные ранее исследования, полагаем, что пробы с грубым измельчением будут характеризоваться более низким накоплением спирта. Это подтверждается данными, представленными в таблице 5.4.
Наиболее низкий выход спирта наблюдается в контрольном варианте. Это можно связать с изначально более низким содержанием Сахаров. Из представленных результатов можно заключить, что основное влияние на эффективность накопления спирта аналогично предыдущим опытам оказало измельчение сырья, в то время как тепловая обработка принципиальным образом не повлияла на его выход.
Поскольку раса Ethanol Red в ряде экспериментов с крахмалистым сырьем показала больший выход спирта по сравнению с расой Angel, в последующих экспериментах использовали коммерческий штамм первой расы. Как и в предыдущих экспериментах, дрожжи предварительно не активировались. Согласно исследованиям, проанализированным в п. 4.2, наибольшим выходом глюкозы характеризовались опилки, подвергнутые УЗ-обработке перед ферментативным гидролизом. Для постановки эксперимента по сбраживанию использовали опилки, обработанные на установке УЗГ2-4М в течение 10 и 20 мин. Наибольшая концентрация глюкозы к 24му часу гидролиза в них, согласно таблице 4.5, составляет 35,47±0,44 мг/мл. Как видно из таблицы 5.5, наибольшее накопление спирта произошло при сбраживании пробы с максимальной продолжительностью помола и обработанной УЗ, однако разница в содержании спирта при сбраживании опилок 30 и 60 минутного помола незначительна. Сбраживание сусла с большой концентрацией свободных Сахаров позволяет ускорить активацию дрожжей, приводя к более быстрому образованию пузырьков газа и появлению запаха этанола в бражке. УЗ-воздействие высокой интенсивности на замес перед гидролизом позволяет повысить накопление этанола на 30%.
Влияние продолжительности механико-ферментативной обработки и способа предобработки лигноцеллюлозного сырья на эффективность его гидролиза мезофильными мультиэнзимными препаратами
Следующей стадией экспериментов выступило сравнение между собой различных субстратов, показавших высокий выход Сахаров при невысоком времени механического воздействия. При сравнении эффективности сбраживания опилок и соломы, были использованы 3 расы дрожжей S. cerevisiae. В проведенных ранее экспериментах наиболее эффективным показал себя штамм Ethanol Red. Кроме того, в эксперименте применены дрожжи Safdistil С-70 и Angel. Активированные дрожжи Ethanol Red вносились в сусло, полученное при использовании фермента Целлюлад в количестве 5 мг белка на 1 г помола, которое сбраживалось в анаэробных условиях при 30 С в течение 60 и 72 ч. Как видно из данных, приведенных в таблице 5.6, большее количество спирта накапливается при сбраживании образцов с более высоким уровнем высвобожденной глюкозы. Наибольшее количество спирта выявлено в пробе из ржаной соломы 20 мин помола.
В следующем эксперименте изучали внесение солей, способных выступить в качестве источников азотного питания (таблица К.1). При регидратации дрожжей по времени, затраченному до образования пузырьков газа, было установлено, что раса Ethanol Red более восприимчива к присутствию в сусле нитрата аммония. В проводимом эксперименте соли вносились после гидролиза, поскольку они могут повлиять на динамику ферментативного гидролиза за счет взаимодействия с аллостерическим центром энзима. Данные показывают, что происходит увеличение накопления спирта на 8-11 % при незначительном потреблении PC по сравнению с контрольным вариантом. Наибольшее образование спирта, аналогично контрольному опыту, происходит в сусле из максимально измельченной УДЧ ржаной соломы при внесении нитрата аммония. Дальнейшие эксперименты проводили на этом сусле. Поскольку изменили субстрат, в следующем эксперименте провели повторное сравнение рас дрожжей. Эффективность накопления этилового спирта представлена в таблице К.2. Проведенный эксперимент показал, что дрожжи Safdistil С-70 чувствительны к ароматическим соединениям, экстрагируемым из древесины при сбраживании. По визуальным проявлениям процессы брожения оканчиваются в течение 36-42 ч, в то время как дрожжи расы Angel продолжают брожение 52-60 ч аналогично дрожжам Ethanol Red. Большее количество остаточных PC характеризует тот факт, что дрожжи расы Safdistil С-70 потребляют меньший спектр гексоз по сравнению с другими штаммами. Несмотря на большее потребление PC дрожжами расы Angel, накопление этилового спирта происходит медленнее. Это можно объяснить менее эффективным метаболизмом данного штамма и большими затратами на синтез биомассы. Несмотря на положительную динамику накопления спирта, установлено, что дрожжи Ethanol Red эффективнее сбраживают гидролизат ржаной соломы.
Таким образом, из 3 рассмотренных в ходе эксперимента штаммов наиболее эффективным является S. cerevisiae расы Ethanol Red, позволяющий успешно сбраживать гидролизаты УДЧ древесины сосны и ржаной соломы. Для повышения эффективности биоконверсии сырья в этанол можно применять соли, к которым данный штамм проявляет наибольшую метаболическую близость, и увеличивать внесение ферментативных препаратов.
Опираясь на данные, полученные в ходе изучения зависимости концентрацией простых Сахаров в сусле и эффективностью его сбраживания, приходим к выводу, что с точки зрения накопления спирта крахмалистое сырье (особенно пшеница) является более выгодным по сравнению с лигноцеллюлозным. При этом накопление спирта в анаэробных условиях зависит как от содержания простых моносахаридов в сусле, так и от чувствительности дрожжей к ингибирующим факторам, в частности к спирту.
В результате проведенных исследований были разработаны подходы к получению этанола, позволяющие исключить энергозатратные стадии предварительной подготовки сырья к сбраживанию.
Для пояснения рассмотрим вначале схему производства этилового спирта из крахмалистого сырья. Несмотря на ряд принципиальных различий, схему производства можно свести к следующим этапам - подготовке сырья и вспомогательных материалов к брожению, культивированию микроорганизмов и последующему сбраживанию спиртового сусла. Процессы брожения завершаются отделением биомассы продуцента этанола и отгонкой продукта в ректификационном аппарате. Главные отличия в технологиях заключаются в способе подготовки сырья. В России традиционно используется схемы с развариванием сырья - длительным этапом выдержки грубоизмельченного сырья в специальной емкости при постоянной температуре 100 С (Ковалевский К. А. Технология бродильных производств : учеб. пособие. Киев : ИНКОС, 2006. 367 с). Этот этап сопровождается большими затратами энергоносителей на нагрев сырья, удлиняет время подготовки сырья, приводит к потери части сбраживаемых веществ за счет процессов мелаидинообразования и карамелизации Сахаров и повышает материалоемкость технологической схемы на оборудование (Римарева Л. В. и др., 2005). Кроме того, существует несколько способов подготовки сырья без разваривания, базирующихся на грубом сухом помоле сырья и внесении повышенного количества высокоактивных амилаз при температуре 65 С (Wu X., Zhao R., Bean S. R. [et al.] Factors imparting ethanol production from grain sorghum in the dry-grind process II Cereal Chem. 2007. Vol. 84. P. 130-136; Зуева H. В., Востриков С. В. Исследование процессов получения и сбраживания спиртового сусла с различным углеводным составом // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2008. № 3. С. 10-13).
На основании собственных исследований предлагается модифицированная технологическая схема производства (рисунок 6.1). По сравнению с классической схемой, изменяется подготовка сырья. После базовой подготовки сырья к измельчению (сортировки, очистки от примесей) зерно предполагается измельчать двухстадийным способом. На первоначальном этапе измельчения зерно измельчается при помощи вальцовых или промышленных ножевых мельниц до размеров не более 0,7 мм. Помол фракционируют (возможно отделение белковой фракции и зерновых оболочек, поскольку они медленно измельчаются за счет особенностей структуры (Жуков С. В. Разработка технологических решений по совершенствованию сортовых помолов ржи : .дис... канд. техн. наук. М., 2008. 189 с)). Оставшуюся фракцию измельчают на промышленных шаровых мельницах различной конструкции. Конечный помол должен содержать не менее 15% частиц не более 10 мкм при условии начальной крахмалистости не менее 45%.
