Содержание к диссертации
Введение
1. ВВЕДЕНИЕ 5
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
2.1. Ферментные амперометрические биосенсоры 9
2.2. Способы иммобилизации ферментов 10
2.3. Амперометрические биосенсоры на основе клеток микроорганизмов 13
2.4. Способы иммобилизации клеток микроорганизмов 14
2.5. Детекция крахмала и олигосахаридов 18
2.5.1. Ферментные биосенсоры для детекции олиго- и полисахаридов 19
2.5.2. Микробные сенсоры для детекции крахмала и олигосахаридов 21
2.6. Биосенсоры для детекции низших спиртов 23
2.6.1. Биосенсоры на основе алкогольоксидазы 23
2.6.2. Микробные биосенсоры для детекции спиртов 27
2.7. Детекция нитроароматических соединений 28
2.7.1. Микроорганизмы-деструкторы нитроароматических соединений 28
2.7.2. Микробные сенсоры для определения нитроароматических соединений 32
3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
3.1. Способы иммобилизации ферментов 34
3.1.1. Иммобилизация с использованием глутарового альдегида 34
3.1.2. Иммобилизация ферментов на мембранах активированных бензохиноном 34
3.1.3. Иммобилизация ферментов в слое ДЭАЭ-декстрана на нитроцеллюлозной
мембране 35
3.2. Условия культивирования штаммов 35
3.3. Способы иммобилизации клеток 37
3.3.1. Адсорбция 37
3.3.2. Включение в гели 37
3.4. Формирование биосенсоров и условия измерения 38
3.5. Условия трансформации 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками R. erythropolis HLPM-1 39
3.6. Анализ реальных образцов. Пробоподготовка 40
3.7. Альтернативные методы 41
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 44
4.1. Биосенсоры для детекции крахмала 44
4.1.1. Биосенсор на основе совместно иммобилизованных глюкозооксидази и глюкоамилазы 44
4.1.2. Анализ крахмала с помощью глюкозооксидазного биосенсора и раствора глюкоамилазы 47
4.1.3. Анализ крахмала с помощью микробного сенсора на основе клеток Gluconobacter
oxydans subsp. industries B-1280 и раствора глюкоамилазы 51
4.2. Скрининг микроорганизмов для биосенсорной детекции олигосахаридов 54
4.3. Модели биосенсоров для детекции низших спиртов 56
4.3.1. Биосенсо'ры на основе алкогольоксидазы 56
4.3.1.1. Биосенсор на основе алкогольоксидазы, иммобилизованной на мембранах, активированных бензохиноном 56
4.3.1.2. Биосенсор на основе алкогольоксидазы, иммобилизованной в слое ДЭАЭ-декстрана 62
4.3.2. Биосенсор на основе клеток метилотрофных дрожжей Pichia angusta BKMY-2518 67
4.3.3. Применение алкогольоксидазного и микробного биосенсора для детекции спиртов
в реальных образцах 70
4.4. Модель биосенсора реакторного типа для детекции 2,4-динитрофенола 73
4.4.1. Трансформация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis в периодических условиях 73
4.4.2. Трансформация 2,4-динитрофенола иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis в непрерывных условиях (реактор идеального вытеснения) 78
4.4.3. Подбор способа иммобилизации клеток для формирования рецепторного элемента сенсора реакторного типа для определения 2,4-динитрофенола 79
4.4.4. Оптимизация параметров биосенсора для определения 2,4-динитрофенола. 84
4.4.5. Использование биосенсора реакторного типа в составе многоканального
биосенсорного анализатора 86
Заключение 89
ВЫВОДЫ 89
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 93
ПРИЛОЖЕНИЕ 108
- Способы иммобилизации ферментов
- Условия культивирования штаммов
- Биосенсор на основе совместно иммобилизованных глюкозооксидази и глюкоамилазы
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее десятилетие показана высокая эффективность применения биосенсорного анализа для решения ряда практических задач.
По статистическим данным основными областями наиболее успешного использования биосенсоров являются промышленная биотехнология, пищевая промышленность экология, клиническая диагностика. По данным объема рынка продаж за последние 8 лет его рост составил 2.5 раза для биосенсоров, применяемых в промышленной биотехнологии, и 5 раз для биосенсоров, используемых для решения экологических проблем.
Аналитические задачи, характерные для биотехнологии, в определенной части совпадают с аналитическими задачами для пищевой промышленности и экологического мониторинга. Ввиду общности проблем анализа в различных областях в данной работе рассмотрены вопросы создания микробных и ферментных биосенсоров, которые могли бы быть эффективно использованы для мониторинга в пищевой промышленности, биотехнологии и экологии. При этом в единый блок задач объединены достаточно удаленные, на первый взгляд, тематики биосенсорной детекции соединений, относящихся к различным классам. В диссертации представлены исследования, рассматривающие детекцию шпроароматических соединений, углеводов и первичных спиртов. Работа направлена на создание и изучение параметров амперометрических биосенсоров.
Отметим актуальность и связанность задач детекции некоторых важных для пищевой промышленности и биотехнологии соединений. В спиртопроизводстве для оптимального проведения технологического процесса необходимо иметь информацию о содержании крахмала в исходном сырье, содержании крахмала и Сахаров на стадиях разваривания и осахаривания крахмалосодержащего сырья, содержании Сахаров и спирта на стадии брожения и содержании спирта в отгоняемых водно-спиртовых парах. Применение биосенсоров на основе ферментов и клеток микроорганизмов для оценки содержания указанных компонентов оптимизирует процесс производства и снизит за счет этого стоимость конечного продукта. Обнаружение суммарного содержания органических соединений, включая спирты и углеводы, требуется для экологического мониторинга (оценка присутствия углеводов в сточных водах, основанная на измерении индекса БПК5 (биологическое потребление кислорода); оценка содержания метилового спирта в объектах, принадлежащих регионам газодобычи). В настоящее время для указанной цели используются трудоемкие аналитические методы (например, оценка БПК5), которые не позволяют получать оперативную информацию о присутствии поллютантов в сточных водах.
Актуальной проблемой экологического контроля является детекция поллютантов в сточных водах промышленных предприятий. К числу распространенных групп ксенобиотиков относятся нитроароматические соединения (2,4-динитрофенол, пикриновая кислота, 2,4,6-тринитротолуол и др.), которые присутствуют в стоках химических предприятий, производящих взрывчатые вещества, красители, пестициды. 2,4- Динитрофенол токсичен для живых организмов - его присутствие подавляет иммунную систему, вызывает нарушение процессов энергетического метаболизма клеток, вызывает Myrareiraoe и канцерогенное действия. Нитрофенолы, в частности, 2-4-ДНФ, могут быть определены спектрофотометрически и хроматографически. Эти методы являются высокочувствительными, но в то же время дороги и трудоемки, в связи с чем, актуальным является разработка биосенсорного подхода. Биосенсорная детекция токсичных нитроароматических соединений может быть использована для оценки состояния объектов окружающей среды на стадии экологического мониторинга, а также при использовании биотехнологических подходов ремедиации объектов окружающей среды.
Распространенным и надежным типом аналитических устройств являются биосенсоры, основанные на электрохимических преобразователях. В диссертации для разработок моделей биосенсоров использован преобразователь электрохимического типа — полярографический электрод, измеряющий содержание кислорода в среде и известный как кислородный электрод типа Кларка.
Клетки микроорганизмов обеспечивают широкие возможности по созданию биосенсорных аналитических устройств. В настоящей работе для создания биорецепторов были использованы штаммы бактерий и дрожжей, окисляющие с высокой скоростью сахара и низшие спирты.
Бактерии рода Gluconobacter, обладающие такими особенностями, как широкий спектр окисляемых субстратов, неполное окисление и накопление продуктов в среде, энергетически малоэффективная организация дыхательной цепи, могут успешно использоваться для создания биосенсоров для контроля ферментационных процессов, а также для экологического мониторинга.
Метилотрофные дрожжи Pichia angusta характеризуются наличием высокоактивных алкогольоксидазы и алкогольдегидрогеназы, что позволяет их использовать в создании биосенсоров для детекции низших спиртов. Выбранный для исследования штамм P. angusta ВКМ Y-2518 обладает высокой селективностью по отношению к этанолу и метанолу и практически не окисляет глюкозу (после индукции метанолом), что важно при анализе реальных образцов, содержащих смесь Сахаров и спиртов.
Использование в качестве рецепторного элемента клеток микроорганизмов, которые обладают специфическими ферментными системами деградации ксенобиотиков, является одним из наиболее распространенных подходов при создании биосенсорных анализаторов, предназначенных для экологического контроля. Бактерии Rhodococcus erythropolis HL РМ1, способные использовать 2,4-ДНФ и пикриновую кислоту в качестве единственного источника азота и углерода, были выбраны для создания рецепторного элемента биосенсора реакторного типа для детекции нитроароматических соединений.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось создание амперометрических микробных и ферментных биосенсоров для детекции глюкозы, крахмала, низших спиртов, а таюке разработка микробного биосенсора реакторного типа для детекции нитроароматических соединений (2,4-ДНФ).
Задачи исследования:
1. Разработка моделей биосенсоров для определения крахмала:
2. Разработка моделей биосенсоров для определения низших спиртов:
3. Разработка модели биосенсора реакторного типа на основе иммобилизованных клеток бактериального штамма Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 для детекции 2,4-ДНФ: Научная новизна.
1. Использован новый способ иммобилизации ферментов в слое ДЭАЭдекстрана, ковалентно связанного с нитроцеллюлозной мембраной посредством бензохинона, позволяющий получить биорецепторы, обладающие высокой чувствительностью и стабильностью.
2. Исследована трансформация 2,4-ДНФ бактериями R. erythropolis HL РМ-1.
Показано, что ферменты, участвующие в катаболизме 2,4-ДНФ, являются индуцибельными.
3. Создана модель микробного биосенсора реакторного типа для детекции 2,4- ДНФ и общего содержания нитроароматических соединений на основе бактериальных клеток R. erythropolis HL РМ-1 и кислородного электрода.
Практическая значимость. Предложена и разработана схема биосенсорного анализа крахмала с помощью микробного сенсора на основе бактерий G. oxydans subsp.
industries В-1280 и глюкоамилазы.
Созданные модели микробных и ферментных сенсоров для детекции крахмала, глюкозы, этанола могут быть использованы на предприятиях пищевой промышленности (контроль ферментационного получения спирта), для определения содержания состава пищевых продуктов (крахмал, глюкоза), содержания этанола в спиртных напитках.
Микробный сенсор на основе клеток R. erythropolis HL РМ-1 может быть использован на предприятиях химической промышленности, производящих пестициды, красители, взрывчатые вещества, где необходим быстрый и недорогой метод анализа содержания нитроароматических соединений в сточных водах.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Биосенсор на основе клеток штамма Gluconobacter oxydans subsp. industries BKM B-1280 позволяет определять содержание крахмала в пробе при добавлении в измерительную кювету раствора глюкоамилазы. Биосенсор применим для анализа крахмала в реальных образцах.
2. На основе нового способа иммобилизации алкогольоксидазы в слое ДЭАЭ-декстрана на мембранах, активированных бензохиноном возможно получение стабильных биорецепторов, применяемых для создания биосенсора для детекции этилового и метилового спиртов.
3. Биосенсор на основе штамма Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 и кислородного электрода позволяет определять общее содержание нитроароматических соединений в модельных образцах. Данный тип сенсора может быть использован либо самостоятельно, либо как элемент комплексной аналитической системы для детекции нитроароматических соединений.
Апробация работы. Работа была представлена на Всероссийской конференции "Сенсор 2000" (Санкт-Петербург, 2000 г.), Международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000 г), XIV Зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002 г.), VII Школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003 г.), П Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003 г.), II Международной научной конференции "Ксенобиотики и живые системы" (Минск, 2003 г.), The Ninth World Congress on Biosensors (Toronto, 2006), Российской школеконференции молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы, технологии" (Пущино, 2006), XV Международной конференции по крахмалу (Москва, 2007 г), III Международной молодежной школы-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2007 г). Присуждена премия им. Г.К. Скрябина (2005 г.).
По материалам диссертации опубликовано 10 статей (из них 5 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК).
Способы иммобилизации ферментов
Основным требованием, предъявляемым к методам иммобилизации, является сохранение максимальной активности биоматериала, сравнимой с активностью в растворе. Можно выделить три основных подхода в иммобилизации ферментов:
1) физическая адсорбция на твердой поверхности;
2) захват в полимерном геле;
3) ковалентное связывание с реакционноспособной нерастворимой подложкой. Адсорбция. Адсорбция на нерастворимом носителе - самый простой метод иммобилизации ферментов. Процедура иммобилизации состоит в смешивании при подходящих условиях фермента и носителя, инкубации и отделении нерастворимого компонента смеси от растворимого центрифугированием или фильтрованием (Вудворд, 1988). Способностью адсорбировать ферменты обладают такие вещества, как оксид алюминия, активированный уголь, глина, целлюлоза, каолинит, силикагель, пористое стекло, гидроксиапатит, ионообменные смолы (Остерман, 1985, Коваленко с соавт., 2002). Большим преимуществом адсорбции является то, что для нее обычно не требуется никаких реагентов, и необходима лишь минимальная активационная обработка или очистка. По сравнению с химическим связыванием адсорбция меньше разрушает ферменты. При адсорбции ферменты удерживаются водородными и множественными солевыми связями, ван-дер-ваальсовыми силами и, в подходящих условиях, за счет образования комплексов с переносом электрона (Остерман, 1985). Главный недостаток этого метода состоит в том, что фермент может связываться с носителем недостаточно прочно.
Захват в полимерном геле. При формировании геля в растворе, содержащем фермент, последний захватывается в образующийся гелевый носитель. Контролируя степень сшивки геля, этот метод можно использовать для любого фермента, поскольку в геле белковые молекулы удерживаются трехмерной решеткой. Наиболее часто используемыми носителями являются альгинатный гель (Cosnier et al., 2002), гели крахмала (Tanriseven et al., 2002), желатин (Romette et al., 1983), коллаген (Bertrand et al., 1981). Метод имеет два недостатка: 1) гель создает большие диффузионные барьеры для субстратов и образующихся продуктов, что приводит к замедлению реакции, особенно в случаях субстратов с большим молекулярным весом; 2) утечка фермента из геля через крупные поры приводит к непрерывному снижению ферментативной активности. Последняя проблема часто решается при помощи поперечной сшивки захваченного белка глутаровым альдегидом (Akyilmaz, Dinckaya, 1999).
Образование ковалентных связей. Метод иммобилизации ферментов с помощью ковалентного связывания основан на образовании химической связи между молекулами фермента и носителем. Для ковалентного связывания используют нуклеофильные функциональные группы боковых цепей аминокислот белка (амино-, карбоксильные, гидроксильные, фенольные, имидазольные и тиоловые группы). Ковалентные связи преимущественно образуются при умеренной температуре, невысокой ионной силе и рН, соответствующих физиологической области. Преимуществом ковалентного связывания является незначительность утечки фермента из матрицы. Наиболее часто для формирования биорецепторов в качестве сшивающего реагента используют глутаровый альдегид. Сшивка ферментов глутаровым альдегидом представляет собой реакцию между этим бифункциональным реагентом и свободными аминогруппами фермента. В качестве подложки для иммобилизации ферментов используют мембраны на основе шелка (Renneberg et al., 1983), нейлона (Hamid et al., 1990), нитроцеллюлозы (Ivanov et al., 2000), ацетилцеллюлозы (Wang et al., 2004), а также такие носители как пористое стекло (Emneus et al., 1986), волокна шелка (Zhang, 1998), полистирол, полипропилен (Reiss et al., 1998).
Условия культивирования штаммов
Были использованы штаммы микроорганизмов: Pichia angusta ВКМ Y-2518, Р. angusta ВКМ Y-1397, Arxula adeninovorans ВКМ Y-78(6), Gluconobacter oxydans subsp. industries BKM B-1280, G. oxydans subsp. melanogenes ВКМ B-1227 (получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов), Escherichia coli К-802 (предоставлен ВНТК Структурно-функционального анализа генетических систем микроорганизмов), Bacillus subtilis sp., Rhodococcus sp. R-20 (получены из коллекции ИБФМ), Rhodococcus erythropolis HL PM-1 (предоставлен Штутггартским Институтом микробиологии, Германия).
Штаммы G. oxydans выращивали на питательной среде, содержащей (г/л): сорбит -200, дрожжевой экстракт - 2. Клетки выращивали в течение 18 ч в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл ростовой среды при перемешивании на качалке (200 об/мин, 28С). Биомассу отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин и отмывали дважды калий-фосфатным буфером (30 мМ, рН 6.6).
Штамм P. angusta ВКМ Y-2518 поддерживали на сусло-агаре. Биомассу выращивали в течение 24 ч в колбах Эрленмейера объемом 750 мл (объем среды - 100 мл) при 28С на качалке (220 об/мин) на жидкой среде следующего состава (г/л): (NH4)2S04 - 2.5; MgS04 -0.2; К2НРО4 - 0.7; NaH2P04 - 3.0; дрожжевой экстракт - 0.5; 100 мкл раствора витаминов на 100 мл среды (тиамин и биотин — 5 мг в 10 мл метанола); 1 мл раствора микроэлементов на 100 мл среды (СаС12х2Н20 - 0.11; FeS04x7H20 - 0.017; ZnS04x6H20 - 0.009; MnS04x5H20 -0.00023; CuS04x5H20 - 0.0045); глицерин (1%, об/об). Затем, пересевали на среду того же состава, но в качестве источника углерода использовали метанол (1%, об/об). Клетки отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин и отмывали дважды калий-фосфатным буфером (30 мМ, рН 7.5). Штамм P. angusta ВКМ Y-1397 выращивали в аналогичных условиях, в качестве источника углерода использовали глицерин, индукцию метанолом не проводили. Биомассу отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин и отмывали дважды калий-фосфатным буфером (30 мМ, рН 7.5).
Штамм R. erythropolis HL РМ-1 обладает способностью к росту на 2,4-ДНФ либо пикриновой кислоте в качестве единственных источников углерода и энергии (Lenke, Knackmuss, 1992). Культуру поддерживали на минеральной агаризованной среде следующего состава (г/л): Na2HP04-12H20 - 10.860, КН2Р04 - 1.800, СаС12-2Н20 - 0.010, FeCl3 - 0.002, MgS04-7H20 - 0.020, 2,4-ДНФ - 0.092, янтарная кислота -2.360, агар - 1.5 %, (рН 7.0) (Lenke, Knackmuss, 1992). Для получения биомассы использовали питательную среду (г/л): аминопептид из гидролизата крови животных — 60.0, триптон — 50.0, экстракт кормовых дрожжей - 10.0, экстракт сои - 30.0. Клетки выращивали в течение 18 ч (что соответствовало окончанию экспоненциальной фазы роста) в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл ростовой среды при перемешивании на качалке (200 об/мин, 28С). Клетки отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 15 мин и дважды отмывали 30 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7.5.
Штамм A. adeninovomns ВКМ Y-78(6) выращивали при 37С в течение 24 ч на среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10, пептон - 5, дрожжевой экстракт - 0.5. Биомассу отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин и отмывали дважды калий-фосфатным буфером (30 мМ, рН 7.5)
Для выращивания штаммов Rhodococcus sp. R-20, В. subtilis sp. и E. coli K-802 использовали питательную среду (г/л): аминопептид из гидролизата крови животных - 60.0, триптон - 50.0, экстракт кормовых дрожжей - 10.0, экстракт сои - 30.0. Клетки выращивали при температуре 28С в течение 18 ч. Биомассу отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин и отмывали дважды калий-фосфатным буфером (30 мМ, рН 7.5).
Биосенсор на основе совместно иммобилизованных глюкозооксидази и глюкоамилазы
Биосенсора на основе совместно иммобилизованных ГОД и ГА. ГОД и ГА иммобилизовали тремя способами: 1) на нитроцеллюлозной мембране, активированной бензохиноном; 2) в слое ДЭАЭ-декстрана ковалентно связанного с нитроцеллюлозной мембраной посредством бензохинона; 3) с использованием глутарового альдегида (референтный метод).
Параметры калибровочных зависимостей при использовании различных способов иммобилизации ГОД и ГА приведены в Таблице 2. Диапазон детекции биосенсоров, полученных тремя различными способами иммобилизации ГОД и ГА, был одинаковым и составлял 0.05-1.00 г/л. Время одного измерения составляло 6-7 мин. Наибольшая чувствительность была получена при иммобилизации ГОД и ГА с использованием глутарового альдегида. Наибольшей стабильностью при хранении обладал биорецептор на основе АО, иммобилизованной в слое ДЭАЭ-декстрана.
В качестве оптимального метода была выбрана иммобилизация в слое ДЭАЭ-декстрана. Метод обеспечивает мягкие условия иммобилизации, позволяет поддерживать конформацию фермента в устойчивом для анализа состоянии, а также сохраняет стабильность биорецептора в течение длительного времени.
На рис. 3 показан вид ответов ГОД-ГА сенсора на введение глюкозы и крахмала. Сенсор был чувствителен к обоим субстратам: величина ответа на глюкозу (0.09 г/л) составляла 0.4 нА/с, на крахмал (0.125 г/л) - 0.2 нА/с, суммарный ответ на одновременное внесение глюкозы й крахмала составлял 0.5 нА/с.
