Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Питательные потребности бактерий рода Bacillus 10
1.2. Факторы, влияющие на интенсивность процессов спорообразования и накопления биомассы бацилл
1.3. Критерии выбора композиционного состава питательных сред при культивировании бактерий рода Bacillus 22
1.4. Получение и применение гидролизатов в составе питательных сред 24
1.5. Питательные среды, применяемые для культивирования бактерий рода Bacillus при производстве вакцинных и пробиотических препаратов.. 30
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
2.1. Материалы и методы исследований 37
2.2. Результаты исследований 41
2.2.1. Выбор условий гидролиза соевой муки 41
2.2.2. Изучение физико-химических и ростовых свойств экспериментальных образцов гидролизатов соевой муки 46
2.2.3. Оптимизация состава питательных сред для глубинного культивирования бацилл 52
2.2.4. Стандартизация условий глубинного культивирования различных штаммов бацилл в питательных средах на основе гидролизата соевой
муки 61
2.2.4.1. Изучение влияния посевной дозы на основные показатели нативной культуры 61
з
2.2.4.2. Влияние температуры культивирования на рост и спорообра- 65 зование бацилл
2.2.4.3. Стандартизация условий перемешивания и аэрации при глубинном культивировании бацилл в биореакторах БИОР-0,1 и БИОР-0,25.. 66
2.2.4.4. Определение показателей, характеризующих стадию завершения культивирования бацилл в разработанных питательных средах 69
2.2.5. Оценка воспроизводимости технологии приготовления питательных сред на основе гидролизата соевой муки 75
2.2.6. Сравнительная характеристика показателей качества препаратов Биоспорин и Биод-5, приготовленных по усовершенствованной и существующим технологиям 81
3. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 83
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 85
5. ВЫВОДЫ 95
6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 96
7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 97
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 98
ПРИЛОЖЕНИЯ 112
- Питательные потребности бактерий рода Bacillus
- Материалы и методы исследований
- ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Введение к работе
Актуальность темы. Разработка и совершенствование технологий производства биопрепаратов является одной из важнейших задач отечественной медицины и ветеринарии. Это объясняется ростом заболеваемости людей и сельскохозяйственных животных инфекционными болезнями в условиях ухудшающейся эпидемической, эпизоотической и экологической обстановки, а также недостаточной эффективностью существующих лечебно-профилактических средств и их высокой стоимостью [19, 20, 26, 59].
В настоящее время из-за имеющихся экономических трудностей здравоохранение и ветеринарная служба России испытывают дефицит в современных, не дорогих лечебно-профилактических препаратах. В связи с этим актуальными являются исследования, направленные на создание эффективных медицинских и ветеринарных препаратов, а так же технологий их получения. Одним из направлений биотехнологии как у нас в стране, так и за рубежом, является разработка и усовершенствование технологий производства биопрепаратов на основе бактерий рода Bacillus.
Практика применения пробиотиков на основе B.subtilis и B.licheniformis при желудочно-кишечных болезнях человека и животных, а также объёмы их закупок за рубежом и их реализация показывают, что спрос на данные препараты значительно превышает предложение [91].
Немаловажное значение имеет усовершенствование технологии производства вакцин против сибирской язвы, особенно в условиях нарастающей угрозы биотерроризма [9, 61].
Сотрудниками Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ (ЦВТП БЗ) разработана технология глубинного культивирования пробиотика медицинского назначения «Биоспо-рин» на основе 2 штаммов бацилл B.subtilis 3 и B.licheniformis 31.
Кафедрой биотехнологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина (МГАВМиБ) на основе штаммов B.subtilis ТПИ 13 и B.licheniformis ТПИ 11 разработан про-биотик ветеринарного назначения «Биод-5», являющийся патентной собственностью Российской Федерации.
Указанные пробиотики обладают широким спектром антагонистического действия по отношению к патогенным и условно-патогеннным микроорганизмам, вызывающим желудочно-кишечные заболевания человека и животных. Это объясняется комплексным механизмом действия препаратов Биоспорин и Биод-5 за счёт сочетания в них композиции спор и вегетативных клеток бацилл, высокой антагонистической активностью бактерий-компонентов, которые синтезируют при росте и спорообразовании аминокислоты, антибиотики, ферменты, другие биологически активные вещества. Данные пробиотики отвечают современным требованиям, включая не только высокую антагонистическую активность по отношению к возбудителям острых кишечных инфекций, но и продолжительность гарантийного срока хранения препаратов при комнатной температуре, что свидетельствует об их перспективности и необходимости расширения производства. [6, 85, 115, ].
По данным Онищенко Г.Г. [61], Бакулова И.А. с соавт. [9], Belton F. [101] и др., технология производства вакцинных препаратов против сибирской язвы на основе штаммов СТИ-1 и 55-ВНИИВВиМ является традиционной для Российской Федерации и хорошо отработана, однако возрастающая потребность не только отечественной медицины и ветеринарии, но и зарубежных потребителей в вакцинах против сибирской язвы указывает на необходимость увеличения объема выпуска данных биопрепаратов.
Одним из направлений решения данного вопроса является стандартизация питательных основ и оптимизация компонентного состава питательных сред (ПС), применяемых для промышленного культивирования микроорганизмов, а также снижение их стоимости. [26, 113].
Стабильность культивирования бактерий рода Bacillus глубинным методом и свойства готовой формы биопрепарата зависят, наряду с качеством посевного материала и условий выращивания, от качества ПС, которое определяется физико-химическими, биологическими показателями и обусловливается стандартностью исходного сырья и технологией их приготовления [91, 116].
Следовательно, проблема разработки новых ПС с использованием дешёвого растительного сырья для увеличения производства и снижения стоимости пробиотических и вакцинных препаратов на основе бактерий рода Bacillus, является весьма актуальной для народного хозяйства РФ.
Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований - разработка технологии приготовления питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus при производстве пробиотических и вакцинных препаратов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать сбалансированный компонентный состав питательных сред на основе гидролизата соевой муки для глубинного способа выращивания бактерий рода Bacillus.
2. Определить условия гидролиза соевой муки и изучить физико-химические, биохимические и биологические показатели полученных гидро-лизатов.
3. Оптимизировать состав питательных сред для глубинного культивирования бацилл в биореакторах.
4. Оптимизировать параметры и режимы глубинного способа культивирования различных видов и штаммов бацилл в разработанных питательных средах.
5. Определить показатели, характеризующие стадию завершения культивирования бацилл в разработанных питательных средах.
6. Оценить биологическую активность готовых лекарственных форм препаратов Биоспорин и Биод-5, полученных из культур микроорганизмов, выращенных в разработанных питательных средах.
7. Обосновать экономическую целесообразность внедрения в производство новых питательных сред для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus.
Научная новизна.
1. Впервые разработан компонентный состав питательных сред В1 и В2 на основе гидролизата соевой муки для глубинного выращивания в биореакторах B.subtilis, B.licheniformis и B.anthracis. Разработанные среды являются стандартизированными и отвечают питательным потребностям указанных микроорганизмов при их росте и спорообразовании.
2. Определены условия солянокислотного гидролиза соевой муки, позволяющие получить гидролизаты с содержанием аминного азота не менее 4,0 г/л.
3. Оптимизированы параметры и режимы глубинного способа культивирования в питательных средах В1 и В2 культур вакцинных штаммов B.anthracis СТИ-1, B.anthracis 55-ВНИИВВиМ, а также культур пробиотических штаммов B.subtilis 3, B.subtilis ТПИ 13, B.licheniformis 31 и B.licheniformis ТПИ 11, обеспечивающие увеличение выхода биомассы бацилл в 1,7 раза, в сравнении с существующими технологиями.
4. При выращивании бацилл в биореакторах определены критерии оценки процесса завершённости накопления биомассы в средах В1 и В2 по водородному показателю, оптической плотности и терморезистентности клеток.
Практическая значимость.
1. Для биотехнологической промышленности предложены стандартные питательные среды В1 и В2, пригодные для культивирования трех видов бацилл: B.anthracis, B.subtilis и B.licheniformis.
2. Разработана и утверждена 18.07.2005 г. инструкция по приготовлению гидролизата соевой муки и питательных сред В1 и В2 для культивирования бактерий рода Bacillus.
3. Разработана и утверждена 04.08.2005 г. инструкция по оценке качества питательных сред В1 и В2.
4. Результаты исследований по созданию технологии приготовления питательных сред В1 и В2 включены в промышленные регламенты производства пробиотиков Биоспорин (утверждён 13.07.2002 г.) и Биод-5 (утверждён 14.01.2004 г.).
5. Разработаны сборники инструкций предприятия по оценке качества полуфабрикатов для приготовления препаратов Биоспорин и Биод-5, утвержденные 12.09.2005 г.
6. Результаты исследований по технологии приготовления питательных сред В1 и В2 для культивирования бактерий рода Bacillus используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии МГАВМиБ имени К.И. Скрябина при подготовке студентов по специальностям 111201 - Ветеринария, 110401 - Зоотехния, 012200 - Биофизика, специализации «Ветеринарная биофизика»; 012300 - Биохимия, специализации «Ветеринарная биохимия».
Личный вклад соискателя. Автору принадлежат организация и непосредственное осуществление исследований по разработке компонентного состава питательных сред В1 и В2, отработке режимов и параметров глубинного способа выращивания культур штаммов B.subtilis 3, B.subtilis ТІШ 13, B.licheniformis 31, B.licheniformis ТПИ 11, B.anthracis СТИ-1 и B.anthracis 55-ВНИИВВиМ, оценке качества гидролизатов соевой муки и разработанных питательных сред, анализ и теоретическое обобщение полученных данных, разработка научно-технической документации.
В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве со старшими научными сотрудниками ЦВТП БЗ, канд. биол. наук Лиморенко А.П. и канд. тех. наук Орловым Ю.Н., которым выражаю благодарность за помощь и поддержку.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты проведенных исследований были изложены в 6 научных отчетах и доложены на научно-практической конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (2003).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 статьи, в том числе 2 - в научных журналах и 2 - в сборниках научных конференций.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (128 источников, из которых 100 отечественных и 28 иностранных), приложения. Работа содержит 32 таблицы и 9 рисунков.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Теоретическое и экспериментальное обоснование компонентного состава питательных сред В1 и В2 для глубинного культивирования бактерий рода Bacillus.
2. Условия гидролиза соевой муки для приготовления питательных сред и оптимизация их состава.
3. Параметры и режимы глубинного способа культивирования различных видов и штаммов бацилл в разработанных питательных средах В1 и В2.
Питательные потребности бактерий рода Bacillus
Современная микробиология располагает достаточно большим арсеналом питательных сред. Их количество определяется, в первую очередь, большим числом культивируемых с их помощью микроорганизмов с разными питательными потребностями, а также целевым назначением выращивания, требованиями к получаемой на их основе продукции и т.д. Общеизвестно, что при глубинном способе культивирования бактерий в биореакторах для получения максимального выхода целевого продукта необходимо подобрать сбалансированный по питательным веществам компонентный состав питательной среды и создать оптимальные условия ведения процесса биосинтеза.
Наличие большого количества работ, посвященных вопросу питания бацилл, в частности B.subtilis, B.licheniformis, а также B.anthracis не всегда с достоверной точностью определяет количественные и качественные характеристики необходимых для развития и метаболизма клеток питательных веществ. Кроме того, многообразие веществ, необходимых для нормальной жизнедеятельности данных микроорганизмов, значительно усложняет выбор питательных субстратов и исходного сырья для их приготовления [24, 75, 81, 82, 102, 104,108].
Микроорганизмы B.subtilis и B.licheniformis могут развиваться на белковых и синтетических ПС с аммонийными солями или нитратами [84, 92, 107].
Основным источником азотного питания для многих бактерий рода Bacillus является белковое сырьё [9, 93, 108, 109, 110].
Суздалева В.В. с соавт. [88], изучая потребности аэробных спорообра-зующих бактерий в аминокислотах показали значительные различия в них для разных штаммов, в том числе и для B.subtilis и B.licheniformis. Так, для ряда штаммов B.subtilis, включая и используемые в препаратах Биоспорин и Биод-5, было установлено, что они не ауксотрофны в отношении какой-либо из 20 аминокислот, содержащихся в испытанных ПС. В тоже время, при использовании белковых субстратов в составе ПС происходит преимущественная утилизация определённых аминокислот.
Например, при культивировании B.subtilis №№ 110, 16 и 39 в течение 18 ч на ПС, содержащей депротеинезированную сыворотку крови, преимущественно используется аргинин, треонин и серии. Культуры B.licheniformis, в частности, штамма В18, требуют для своего развития обязательного присутствия в составе ПС таких аминокислот, как аланин, аргинин, глицин, гисти-дин и глутаминовая кислота [35, 44, 93, 114. 115].
Содержание в питательных средах общего (No6lIl) и аминного (NaM) азота, а также их соотношение для спорогенеза весьма значимы. Общим условием для спорообразующих бактерий является низкое (20-30 мг%) содержание азотистых веществ в среде [16, 32, 112].
Некоторые авторы утверждают, что бациллы начинают спорулировать при исчерпании азота в среде [15, 31, 35, 111].
Различные виды споровых бактерий неодинаково относятся к источникам азота: одни лучше усваивают аммонийный азот, другие хорошо потребляют азот нитратов, некоторые нуждаются в аминокислотах или пептидах. Изучение потребностей аэробных спорообразующих бактерий в аминокислотах показывает значительные различия в них для разных видов штаммов, в том числе и для B.subtilis, B.licheniformis, B.anthracis [10, 40, 46, 62, 83, 84].
Вопросам использования аминокислот бактериями рода Bacillus посвящен ряд исследований, в результате которых установлено, что для B.licheniformis незаменимыми аминокислотами являются аланин, аргинин, цистеин, глицин, гистидин, лизин [10].
Ряд авторов [10, 64, 84] изучали потребности в аминокислотах B.subtilis, используя приём исключения из набора аминокислот одной из них. Установлено, что изучаемые культуры B.subtilis не ауксотрофны в отношении какой-либо из отдельных аминокислот.
Некоторые бациллы хорошо растут на средах с аммонийными солями и нитратами, которые являются единственными источниками азота [65, 66].
К бактериям, восстанавливающим нитраты, относят многие штаммы B.licheniformis [29, 30].
Следует отметить, что использование в составе питательных сред чистых аминокислот затруднено в связи с их недоступностью в достаточном количестве, а также высокой стоимостью. Поэтому как в лабораторной практике, так и в микробиологической промышленности используют питательные среды, содержащие компоненты неопределённого состава (растительные питательные основы, экстракты, автолизаты и др.). Лучшим же источником азотного питания при этом является именно белковое сырье, в частности пептон, соя, казеин, горох и некоторое другое [18, 43, 49, 52, 56, 64, 83].
Самым распространенным белковым сырьём для обеспечения питательных потребностей бацилл является мясо крупного рогатого скота. Такие среды получили широкое распространение, в том числе при производстве пробиотиков и вакцин [3, 10, 18, 73, 84, 112].
Как правило, при ограниченном производстве биопрепаратов на основе бацилл с использованием поверхностного способа выращивания культур, уровень разработки новых питательных основ (ПО) и ПС остаётся без изменений в течение длительного времени. Вместе с тем, при производстве вакцины против сибирской язвы и пробиотиков на основе B.subtilis и B.licheniformis в промышленных масштабах поиск дешёвого сырья и разработка на его основе новых ПС являются актуальными [51].
Материалы и методы исследований
Работа была выполнена в период с 2001 по 2005 год на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина и в Центре военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ.
Микроорганизмы. В процессе проведения исследований использовали споровые и вегетативные клетки аэробных спорообразующих микроорганизмов B.subtilis ТПИ 13, B.subtilis ВКПМ В-2335 (3), B.licheniformis ТПИ 11, B.licheniformis ВКПМ В-2336 (31), B.anthracis СТИ-1 и B.anthracis 55-ВНИИ-ВВиМ. Данные штаммы не обладают патогенностью для человека и животных, хранятся в коллекции ЦВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ и систематически репродуцируются.
Для определения антагонистической активности изучаемых бацилл использовали тест-штаммы - Shigella sonnei 5063, Salmonella typhimurium 55, Staphylococcus aureus 209, Candida albicans ИМВ 690.
Питательные среды, растворы и реактивы. При проведении экспериментов были использовали стандартные (МПА, МПБ, среда Эндо, агар Сабу-ро и др.) и модифицированные (среда с мочевиной, желточно-солевой агар Чистовича, среда Гаузе № 2, ПС № 4, ПС № 7 и др.) плотные и жидкие ПС, а также разработанные нами в ходе проведения исследований (среды В1 и В2).
Питательные среды готовили из следующих питательных основ: кукурузный экстракт, ферментативный гидролизат мяса, солянокислотный гидроли-зат соевой муки, солянокислотный гидролизат казеина. Для приготовления гидролизатов использовали говяжью вырезку (ГОСТ 779-87); соевую муку (ГОСТ 3898-56); казеин технический (ГОСТ 17626-81); поджелудочную железу (ГОСТ 11285-73); панкреатин (ГФ, изд. 9-е, С. 353).
В работе также применяли дистиллированную воду, концентрированную соляную кислоту, фосфатный буфер, 50 %-ный раствор глюкозы, некоторые другие химические реактивы и растворы, состав и наименование которых изложены в соответствующих разделах работы.
Использовали сырье, реактивы и материалы, прошедшие входной контроль и отвечающие требованиям действующих нормативных документов.
Технологическое оборудование. При выполнении исследований применялось следующее технологическое оборудование: биореакторы вместимостью 150 и 300 л (г. Дзержинск, АО «Дзержинскхиммаш»); биореакторы БИОР-0,1 и БИОР-0,25 (г. Кириши, завод ОКТБМ); фильтр-пресс РП - 0,7 (г. Павлоград, завод «Павлоградхиммаш»); качалка (шуттель-аппарат) G-53 (ФРГ); сепараторы АСГ-ЗМБ (г. Плавск, машиностроительный завод «Смычка»); установка «Магнолия» (г. Йошкар-Ола АО «Фармбиомаш»); установки сублимационной сушки МАСС-25 (г. Йошкар-Ола НПО «МАСС») и АКСС-5 (г. Омск НТК «Криогенная техника») и др.
Кислотный гидролиз белкового сырья осуществляли во флаконах в шкафных автоклавах и эмалированных биореакторах объемом 0,3 и 0,15 м3 при постоянном перемешивании при 50 об/мин. Осветление полученных гидролиза-тов проводили методом фильтрования через ткань бельтинг.
Методы исследований. Контроль качества приготовленных питательных основ и сред проводили по методам, рекомендованным ГИСК им. Л.А.Тарасевича, по следующим показателям: внешний вид, растворимость, цветность, влажность, показатель концентрации водородных ионов, показатели общего и аминного азота, золы, белка, хлоридов, сульфатов, различных микроэлементов, редуцирующих веществ и т.д. [53, 54, 55].
Аминокислотный состав приготовленных гидролизатов определяли по методикам, описанным Телишевской Л.Я. [90].
Изучение пептидного состава гидролизатов проводили методом колоночной жидкостной гель-хроматографии [90].
Контроль технологических процессов изготовления ПС осуществляли по методам, описанным Артюхиным В.И. с соавт. [5].
Определение рН сред проводили потенциометрическим методом.
Общий азот определяли методами Къельдаля и Несслера. Для оценки содержания азота в составе аминогрупп использовали показатель «аминный азот», который определяли методом формольного титрования [55, 60, 99].
Экономическая эффективность полученных результатов
Экономическую эффективность внедрения разработанных питательных сред рассчитывали согласно методике, предложенной В.А. Кейлером [38].
В качестве базовой технологии для расчетов использовали автоматизированную технологическую линию по производству пробиотика Биоспорин.
Таким образом, затраты на 1000 руб. товарной продукции по разработанной технологии были меньше в 2,3 раза (или на 44 %), чем по существующей технологии.
2. Рентабельность продукции рассчитывали по формуле:
Рм = (Пм/См)хЮ0, где
Пм - прибыль от реализации товарной продукции за год, руб; См - себестоимость продукции, произведенной за год, руб. Рентабельность продукции, произведенной по существующей технологии, составила:
Рм = (360 000/12 000 000)х100 = 30 %
Рентабельность продукции, произведенной по разработанной технологии, составила:
Р„ = (540 000/9 000 000)х100= 60 %
Таким образом, рентабельность продукции, произведенной по разработанной технологии, была в 2 раза выше, чем по существующей.
3. Годовой экономический эффект от внедрения разработанной технологии рассчитывали по формуле:
Э = (Зс - Зр)хА2, где
Зс и Зр - приведенные затраты на единицу продукции, произведенной по существующей и разработанной технологиям, руб;
А2 — годовой объем произведенной продукции по разработанной технологии, доза.
Приведенные затраты рассчитывали по формуле: 3 = См+Е„К, где
См - себестоимость продукции, произведенной за год, руб; Ен - нормативный коэффициент эффективности капитальных вложений. К - удельные капитальные вложения в производственные фонды, руб. Приведенные затраты на единицу продукции по существующей технологии составили:
Зс = 6,0+0,15x2,64 = 6,40 руб.
Приведенные затраты на единицу продукции по разработанной технологии составили:
Зс = 2,64+0,15x2,64 = 3,10 руб.
Годовой экономический эффект от внедрения разработанной технологии составил:
Э = (6,4-3,1)хЗ 000 000 = 9 900 000 руб.
Таким образом, затраты на 1000 руб. товарной продукции, произведенной по разработанной технологии, были меньше на 44 %, а рентабельность в 2 раза выше, чем по существующей технологии. Годовой экономический эффект от внедрения новых сред В1 и В2 составил 9900000 руб.
Приведённые расчёты показали преимущество применения предложенных питательных сред на основе ГСМ в сравнении с питательными средами на основе КУК и ГК.
