Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ДЕНИТРИФИЦИРУЮЩИЕ ПРОКАРИОТЫ (Обзор литературы) 11
1.1. Введение 11
1.2. Сущность процесса денитрификации 12
1.3. Денитрифицирующие микроорганизмы 15
1.4. Денитрифицирующие бактерии рода Halomonas 22
1.5. Энзимология денитрификации 24
1.6. Транспорт нитрата и нитрита в бактериях 30
1.7. Биотехнологический потенциал денитрификаторов 33
1.8. Заключение 35
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2.1. Объекты исследований 36
2.1.1. Микроорганизмы 3 6
2.1.2. Плазмидный вектор 3 6
2.2. Материалы и реагенты 37
2.2.1. Реактивы для микробиологических исследований 37
2.2.2. Реактивы для молекулярной биологии 37
2.2.3. Реактивы для капиллярного электрофореза 37
2.3. Микробиологические методы 38
2.3.1. Питательные среды 3 8
2.3.2. Условия культивирования и инокуляции 40
2.3.3. Почвенные образцы и пробы воды, их отбор и хранение 41
2.3.4. Учет численности микроорганизмов 41
2.4. Методы микроскопических исследований 42
2.5. Методы таксономических исследований 43 2.5.1. Фенотипический анализ 43
2.5.2. Филогенетический анализ 43
2.6. Молекулярно-биологические методы исследований 44
2.6.1. Амплификация гена рибосомной РНК с помощью ПНР 44
2.6.2. Секвенирование последовательностей гена 16S рРНК 45
2.6.3. Трансформация бактерий плазмидной ДНК 45
2.6.3.1. Трансформация хлористым кальцием 46
2.6.3.2. Метод электропорации 46
2.7. Методы биохимических исследований 47
2.7.1. Определение оптической плотности культуральной жидкости 47
2.7.2. Определение выхода общего белка 47
2.7.3. Определение скорости денитрификации 47
2.7.4. Определение токсичности рабочей культуры 48
2.8. Аноксическая ферментация 48
2.9. Физико-химические методы исследований 49
2.9.1. Определение концентрации анионов 49
2.9.2. Измерение интенсивности флуоресценции 49
2.10. Математическая и статистическая обработка результатов
экспериментов 49
ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ НИТРИТРЕЗИСТЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА HALOMONAS 50
3.1. Скрининг нитриттолерантных галомонад 51
3.2. Фенотипическая характеристика 54
3.3. Изучение денитрифицирующей активности 61
3.4. Филогенетическое положение 69
3.5. Выбор рабочего штамма Halomonas sp. 74
ГЛАВА 4. АНОКСИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ НИТРИТРЕЗИСТЕНТНЫХ ГАЛОМОНАД 76
4.1. Получение рекомбинантного штамма Halomonas sp. IB-G4 77
4.2. Определение основных параметров аноксической ферментации 81
4.3. Изучение периодического и непрерывного культивирования штамма Halomonas sp. IB-G4 в аноксических условиях 91
4.4. Преимущества нитритрезистентных денитрификаторов для промышленной ферментации 102
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСПОРТА НИТРИТ АНИОНОВ ВНУТРЬ КЛЕТОК АЛКАЛОФИЛЬНЫХ ДЕНИТРИФИКАТОРОВ 104
ГЛАВА 6. ГЛУБОКАЯ ОЧИСТКА ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ ОТ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ ПРИ ПОМОЩИ
БАКТЕРИЙ РОДА HALOMONAS 115
6.1. Экологическое состояние подземных вод в условиях антропогенного загрязнения 115
6.2. Очистка воды, загрязненной нитрат и нитрит анионами, штаммом Halomonas sp. IB-I6 121
ВЫВОДЫ 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125
ПРИЛОЖЕНИЯ 147
Введение к работе
Актуальность проблемы
В 70-е годы XX века, когда технология рекомбинантной ДНК прочно вошла в практику биотехнологов, бактериальная клетка стала основной платформой для получения гетерогенных белков (Muller et al., 2006). Промышленные биотехнологические процессы, основанные на использовании микроорганизмов, практически всегда связаны с их культивированием, осуществляемым различными способами. Одним из основных требований, предъявляемых к микробным технологиям, является создание асептических условий, при одновременной подаче и диспергировании в питательной среде свежих порций стерильного кислорода (воздуха) в сочетании с отводом отработанного газа (Капе, 1993; McNeil and Harvey, 2008; Schallmey et al., 2004). Реализация этого требования возможна лишь при использовании сложного технологического оборудования и сопряжена с высокими энергетическими и экономическими затратами. Одним из путей их снижения является использование методов анаэробного культивирования, осуществляемых, например, при ферментации облигатно анаэробных бактерий или микроорганизмов, обладающих бродильным типом метаболизма, архей, дрожжей (Morris, 1994; Stal and Moezelaar, 1997). Недостатком биотехнологий данного типа являются их сравнительно низкие скорость и эффективность. Вместе с тем, известны микроорганизмы, обладающие аэробным типом дыхания, и, одновременно, способные к энергетическому метаболизму при наличии в питательной среде других окислителей, например, нитратов, перхлоратов (Stal and Moezelaar, 1997; Straub et al., 2000; Zumft, 1992). Процессы их ферментации относятся к аноксическим и применяются, главным образом, в технологии очистки сточных вод, при этом скорость деления клеток приближается к уровню аэрируемого культивирования (Casella and Payne, 1996; Stepanov and Korpela, 1997). Присутствие NaN03 в среде устраняет необходимость стерильной аэрации и диспергирования воздуха, что приводит к соответствующему снижению затрат. Вместе с тем, для получения высоких конечных концентраций биомас-
7 : ;.
сы в аноксических процессах требуются значительные стартовые концентрации окислителя в среде, например, нитратов. С другой стороны, восстановление нитратов микроорганизмами до газообразного азота происходит с образованием и промежуточным накоплением в среде токсичных нитритов, способных ингибировать рост рабочей культуры в очень низких концентрациях - 0,05 - 0,l%NaNO2 (Chung et al., 2004); Таким образом, использование метаболизма полной денитрйфикации в-:классическом'.' варианте не целесообразно из-за низких результирующих концентраций клеток. .Сравнительно- недавно; (Усанов с соавт., 2002, 2003) обнаружены алкалогалотолерантные микроорганизмы, относящиеся к роду Halpmonas (Vreeland et al., 1980); устойчивые к. высоким концентрациям нитритов и осуществляющие активную, де-нитрификацию NOf и NOo" до газообразного азота. Представляется вероятным и возможным их использование в качестве базовых-культур (хостов) для генетической модификации, что позволит осуществлять их культивирование без применения аэрации. воздухом, заменив>его адекватными концентрациями NaN03. Можно предположить, что вследствие высокой токсичности нитрита, который неизбежно будет накапливаться: в среде,, подобные: системы будут устойчивы к контаминации. В этом» случае процесс культивирования можно: будет осуществлять в биореакторах упрощенного типа, представляющих собой герметичную емкость с устройством для. термостатирования, снабженных маломощной циркуляционной мешалкой; что, в свою- очередь, приведет к значительному снижению капитальных, эксплуатационных и энергетических затрат.
Цель исследования
Выделение и изучение нитритрезистентных бактерий рода Halomonas для процессов аноксической ферментации и получения рекомбинантных белков в.условиях неингибированного нитратного>и нитритного дыхания:
Задачи исследования
Г.' Выделить из природных ниш обитания культуры денитрифицирующих бактерий, способные к активному аноксическому росту на минимальных
8 субстратах (цитрат натрия) в присутствии высоких концентраций нитратов и " нитритов, определить их таксономическое положение с использованием современных методов сравнительного филогенетического анализа структуры 16SpPHK.
Изучить физиологические и биохимические свойства, а также денитрифицирующую активность выделенных штаммов, их устойчивость к высоким концентрациям токсичных нитритов, выявить перспективные рабочие изоляты бактерий, способных к активному аноксическому дыханию.
Подобрать модельный вектор, кодирующий зеленый флуоресцентный белок, и провести трансформацию одного из активных изолятов реком-бинантной ДНК, испытать его в режиме периодической и проточной ферментации.
Изучить поведение культур наиболее активных денитрификаторов в моделях технологии очистки образцов питьевой воды из подземных источников, загрязненной анионами нитратов и нитритов.
Научная новизна
Впервые обнаружены два типа акцепции нитрит анионов, используемых в качестве единственного акцептора электронов при росте культур денитрификаторов рода Halomonas в средах с высокой щелочностью (рН>9) — диффузия и активный транспорт.
Для обозначения предположительно новой группы денитрификаторов, способных к активной акцепции NCV, предложен термин "нитритофиль-ные" культуры.
Определены полные последовательности гена 16S рРНК для 5 изолятов галомонад, проведена реконструкция моделей филогенетических древ и определено их положение в роду Halomonas.
Подобраны условия трансформации культуры рода Halomonas sp. IB-G4 плазмидой pHS15G2, несущей ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), в результате чего получены 4 клона трансформантов.
Впервые проведена трансформация денитрификаторов рода Halomonas рекомбинантной ДНК без использования хелперной плазмиды.
Качественно показана экспрессия плазмиды в хосте при аноксическом культивировании трансформанта G4.4 в условиях неингибированного нитратного и нитритного дыхания.
Практическая значимость
Создана коллекция штаммов Halomonas, развивающихся в аноксиче-ских условиях на минимальном субстрате (цитрате), способных к одновременному активному росту и денитрификации в присутствии высоких концентраций нитрита натрия (до 8%масс).
Полные последовательности генов 16S рРНК пяти культур депонированы в базе данных EMBL (European Molecular Biology Laboratory)/GenBank и доступны в сети Internet ( под номерами АМ490135, АМ490136, АМ490137, АМ490138, АМ490139.
Установлены кинетические параметры аноксического культивирования штамма Halomonas sp. IB-G4 в присутствии нитрата или нитрита в качестве единственного акцептора электронов - максимальная удельная скорость роста на нитрате \лтак - 0,8 ч"1, на нитрите цтах = 0,9 ч"1.
Показана принципиальная возможность и перспективность применения нитритофильных галомонад в процессах тонкой очистки питьевой воды, загрязненной анионами нитратов и нитритов.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на ряде научных форумов: межвузовской научно-технической конференции «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук» (Уфа, 2006), XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), межрегиональной школе-конференции «Биомика -наука XXI века» (Уфа, 2007), III Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), региональной конференции молодых, ученых с международным участием «Современ-
10 ные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург -Пермь, 2007), II Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), Международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 1 - в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикаций материалов кандидатских работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов, выводов, приложений и списка цитируемой литературы, содержащего 241 ссылку. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 17 таблиц.
Сущность процесса денитрификации
Денитрификация - важный процесс окисления органических и неорганических соединений в природных и искусственно созданных условиях без доступа кислорода (Shapovalova et al., 2008). Этот процесс является заключительной стадией глобального биогеохимического цикла азота (рис. 1.1). В природе совершается сложный цикл взаимопревращений молекулярного азота и его разнообразных соединений, в составе которых он находится в различных степенях окисления - от -3 до +5. Неорганический азот переходит в биологически полезную форму благодаря процессам азотфиксации и ассимиляции нитрата с последующим усвоением образовавшегося аммония различными про- и эукариотами (Болтянская, 2007). В результате деятельности нитрифицирующих бактерий рода Nitrosomonas аммоний окисляется до нитрита (NCV) и далее бактериями рода Nitrobacter до нитрата (N03"). Денитрификация или нитрат ассимиляция и аммонификация приводят к исчезновению нитратов и нитритов и таким образом завершают цикл азота.
Первые систематические исследования конверсии нитратов в газообразные формы азота проводили Gayon и Dupetit в 1882 году (Gayon and Dupetit, 1882). Отметив исчезновение нитратов из разлагающихся отходов, они назвали это явление "денитрификацией" и впервые выделили денитрифицирующие бактерии (Gayon and Dupetit, 1886), которые они обозначили как Bacterium denitrificans а и /?. На ранних стадиях изучения денитрифика-ции ошибочно полагали, что нитраты высвобождают и таким образом доставляют элементарный кислород к организмам для использования в процессе кислородного дыхания. Термин "денитрификация" в современном понимании был предложен Kluyver и Donker в 1926 году, когда они сформулировали общие концепции клеточной биоэнергетики и признали, что денитрификация позволяет бактериям осуществлять дыхательный путь в анаэробных условиях (Kluyver and Donker, 1926).
Физиологическая сущность денитрификации заключается в образовании АТФ в результате анаэробного дыхания: нитрат или нитрит служат конечным акцептором электронов в электрон-транспортной цепи для формирования электрохимического градиента поперек цитоплазматической мембраны. При восстановлении нитрата образуются окислы азота, которые также являются конечными акцепторами электронов в той же или другой цепях транспорта электронов. Таким образом, денитрификация представляет собой каскад анаэробных дыхательных процессов, благодаря которым нитрат редуцируется до N2 (Knowles, 1996):
N03" - N02" -» NO - N20 - N2 (1.1)
В конечном итоге, каждый шаг восстановления сам по себе должен обеспечивать рост, поскольку, как, например, было показано в случае Pseu-domonas denitrificans, все стадии денитрификации связаны с выработкой АТФ (Kornaros et al., 1996). Следовательно, существуют микроорганизмы, использующие усеченный путь денитрификации. Сокращение пути возможно одним из двух способов: 1) когда организмы, способные пройти каждый шаг пути превращения, имеют доступ только к тем интермедиатам, которые более восстановлены чем нитрат; 2) когда организмы на генетическом уровне не способны к некоторым этапам пути превращения (Cheneby et al, 2004).
Объекты исследований
В работе использовали нитритрезистентные штаммы Halomonas sp. из коллекции лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН, а также бактерии рода Halomonas, выделенные из различных природных мест обитания. В качестве тестовых культур при проведении физио-лого-биохимических анализов использовали типовые штаммы Немецкой коллекции MHKpoopraHH3MOB(DSZM): Halomonas halophila DSM 4770, Halomonas desiderata DSM 9502. Для амплификации плазмидного вектора использовали культуру E.coli DH5a (Douka et al., 2001).
Чистые культуры бактерий хранили при 4 - 5С на чашках Петри, содержавших агаризованные среды BS или С А, пересевая с периодичностью один раз в три месяца. Для более длительного хранения использовали замораживание бактериальной суспензии, содержавшей 50% глицерина, при -18 --20С. В экспериментах использовали 2-3-х суточные колонии чистых культур, полученные путем высева бактериальной суспензии, разведенной в стерильном растворе 0,9% хлорида натрия, на базовую агаризованную среду. В экспериментах, связанных с изучением аноксического культивирования, использовали жидкую анаэробную культуру, полученную в течение суток на средах GF1 или CGF1 при температуре 35 - 37С.
Плазмидный вектор
Для трансформации культуры Halomonas sp. IB-G4 использовали плазмидный вектор pHS15G2 длиной 13180 п.о. под контролем универсального гетерогенного промотора (Douka et al., 2001). Вектор кодировал синтез зеленого флуоресцентного белка (GFP), содержал гены устойчивости к стрептомицину и ампициллину. Клетки, несущие эту плазмиду, выращивали аэробно или в условиях денитрификации при 35 - 37С на среде, содержавшей по 40 мкг/мл ампициллина и стрептомицина. Флуоресценцию GFP наблюдали поеле инкубации трансформированной культуры в течение 24 часов при 4 - 5С. Образцы плазмид были любезно предоставлены профессором Constantin Drainas (University of Ioannina Department оГ Chemistry Biochemistry Lab, Греция).
. Реактивы для микробиологических исследований
В работе использовали агар бактериологический (Испания), дрожжевой экстракт (Франция), триптон («Amresco», США), органические и неорганические натриевые и калиевые соли, углеводы, растворители, щелочи и кислоты категорий ч.д.а. и х.ч. фирм АО «Реахим» (г. Москва, Россия); ЗАО «Химре-активенаб», ЗАО «Уфимская химическая компания», ЗАО НПП «Биомед-хим» (г. Уфа, Башкортостан); ЗАО «НПО Экрос» (г. Санкт-Петербург, Россия).
. Реактивы для молекулярной биологии
В работе применяли трис («Sigma», США), этилендиаминтетрауксус-ной кислоты динатриевую соль (ЭДТА) («Amresco», США), додецилсульфат натрия (SDS) («Pract», Англия), глицерин («Merck», Германия); ацетат натрия, фенол, хлороформ, изоамиловый спирт, кальций хлористый российского производства; ферменты, олигонуклеотидные праймеры, смесь дНТФ фирм «Fermentas» (Литва), «Promega» (США); агарозу разного типа фирм «Sigma» и "Promega" (США); а также набор QIAquik Gel Extraction Kit (50) (QTAGEN, Германия). Для приготовления селективных питательных сред использовали антибиотики медицинского качества: ампициллин (ОАО «Биосинтез», г. Пенза), стрептомицин (ОАО «Синтез», г. Курган).
Скрининг нитриттолерантных галомонад
С целью скрининга денитрифицирующих бактерий, предположительно относящихся к роду Halomonas, развивающихся на минимальном субстрате и при этом проявляющих устойчивость к нитриту натрия, были отобраны различные образцы природного материала, имеющие естественный уровень рН в интервале 8,4 - 9,5 и минерализации 5,5 - 330 г/л. Было обследовано 24 почвенных образца, включавших пробы чернозема (Челябинская и Кировская обл.), песка и литорального грунта с прибрежных зон Красного и Черного морей, ила со дна содовых и соленых озер (респ. Бурятия и Оренбургская обл.), почвы горячих источников (респ. Бурятия и Камчатка).
Выделение проводили методом накопительных культур (Методы общей бактериологии, 1984) на минерализованных щелочных средах при рН 9,2 — 9,4. Селектирующим агентом служил нитрит натрия в концентрации 2% масс, вносимый в питательную среду как единственный акцептор электронов. Для скрининга использовали два типа питательных сред, различавшихся источником углерода. Часть изолятов выделяли на богатой среде GF2, содержавшей в качестве субстрата 1% масс, дрожжевого экстракта. Остальные культуры выделяли на минимальной среде CGF2 с 1,5% масс, цитрата натрия и 0,025% масс дрожжевого экстракта в качестве источников углерода.
Для получения накопительной культуры нитрит-устойчивых микроорганизмов стеклянные 16 мл "анаэробные" пробирки, заполненные до верха стерильной средой GF2 или CGF2, инокулировали материалом из различных почвенных образцов и закрывали завинчивающимися крышками с резиновым уплотнением, далее инкубировали при 37С до появления признаков роста (обычно 1 - 2 сут). «Положительные» пробы пассажировали (3-4 раза) в тех же условиях, что обеспечивало получение практически чистой культуры микроорганизмов при высеве на плотные среды. Основными критериями при отборе накопительных культур служили: 1) хороший рост на среде с высоким содержанием нитрита натрия; 2) интенсивное газообразование на протяжении всего скрининга, то есть при пересевах. Последнее свидетельствовало о процессах денитрификации и наличии соответствующей активности в накопительной культуре. Чистые культуры получали путем изолирования отдельных клеток на твердой среде BS или С А высевом десятикратных разведений КЖ из последнего пассажа накопительных культур.
В результате скрининга были получены 16 изолятов алкалогалотоле-рантных нитритустойчивых бактерий, из них 5 на богатой питательной среде и 11 на минимальном субстрате. Культуры, полученные на цитрате натрия, были выделены в отдельную группу изолятов, развивавшихся на минимальной среде, и обозначены индексом "с". Дальнейшая работа по идентификации и изучению денитрифицирующей активности таких штаммов проводилась с использованием питательных сред на основе цитрата натрия (CGFx и СА). Все полученные изоляты и культуры из музея лаборатории прикладной микробиологии ИБ УНЦ РАН были объединены в коллекцию нитритрези-стентных бактерий, включившую 21 штамм. Краткое описание колониальной морфологии всех культур, а также источника выделения с указанием субстрата представлено в таблице 3.1.
