Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Общие предпосылки 8
1.2. Классификация и выбор биореакторов 10
1.2.1. Гомогенность культуральной среды в биореакторе 12
1.2.2. Механическое перемешивание в биореакторах 14
1.2.3. Аэрация 18
1.3. Гидродинамика биореакторов 21
1.3.1. Физико-химические особенности культуральной среды 22
1.3.2. Модели структуры потоков в биореакторах 22
1.4. Массообмен в биореакторах с механическим перемешиванием 25 и аэрацией
1.5. Критерии масштабирования биореакторов с механическим пе- 29 ремешиванием и аэрацией
2. Собственные исследования 38
2.1. Материалы и методы 38
2.2. Теоретический анализ 42
2.3. Результаты исследований 47
2.3.1. Характеристики биореакторов использованных для масшта- 47 бирования
2.3.2. Гидродинамика биореакторов с механическим перемепшва- 49 нием и аэрацией
2.3.3. Структура потоков и время перемешивания в биореакторах ... 54
2.3.4. Объемный коэффициент массопереноса (KLa) 65
2.3.5. Примеры масштабирования процессов культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и
аэрацией 74
2.3.5.1. Масштабирование процесса культивирования E.coli 75
2.3.5.2. Масштабирование культивирования Erysipelotrix rhu-
siopathiae шт. ВР-2 82
3. Обсуждение результатов исследований 84
4. Выводы 87
5. Практические предложения 88
Литература 89
Приложения 105
Введение к работе
Актуальность проблемы. Отсутствие научно обоснованных критериев масштабирования предопределяет многоступенчатость опытно-технологических работ, существенно замедляет внедрение полученных в полупроизводственных условиях технологических результатов и требует проведения дорогостоящих и длительных экспериментов непосредственно на крупномасштабном оборудовании.
Сложность определения условий масштабного перехода, с одной стороны, и важность изучения этих условий — с другой, приводят к необходимости применения системного подхода, суть которого в данном случае состоит в том, что вся информация, получаемая на лабораторных, опытных и промышленных установках, последовательно накапливается и обогащается в процессе разработки полной математической модели биореактора. Построенная таким образом математическая модель позволяет наиболее достоверно осуществлять масштабный переход и решать задачи оптимального проектирования биороеакторов.
Непосредственный перенос опытных данных, полученных для данной системы глубинного культивирования с одного биореактора на другой (масштабирование), осуществляется в три этапа:
выбор лучшего штамма посевного материала и среды пс основным биотехнологическим показателям;
сравнительная оценка ростовых свойств питательной среды и штамма в лабораторной посуде (пробирка, колба и т.д.);
оценка гидродинамических параметров процесса культивирования и их оптимизация в условиях использования лабораторной пилотной установки (от 1 до 10 л), снабженной системами автоматического контроля и управления;
- перенос полученного оптимального режима культивирования в промышленные объемы (собственно масштабирование).
Эффективная работа биореактора во многом определяет технико-экономические показатели всего производства. При этом существует тесная взаимосвязь вопросов аппаратурного и технологического оформления процессов биосинтеза, в частности, рассмотрение вопросов гидродинамики и массопередачи являются определяющими при реализации процессов в крупнотоннажных аппаратах.
Наиболее перспективным в настоящее время следует признать применение для целей масштабирования сочетания двух и более критериев.
Так как в процессах биосинтеза скорость роста микроорганизмов и накопление целевого продукта могут лимитироваться гидродинамическим режимом работы биореактора и условиями массообмена, естественно предположить, что для возможности получения в биореакторах различных емкостей одинаковых показателей следует учитывать влияние большинства факторов, которые могут воздействовать на процессы жизнедеятельности, с учетом меняющихся по ходу биосинтеза реологических свойств системы. При культивировании микроорганизмов в производственных условиях обычно можно говорить о следующих основных параметрах -температура, рН, парциальное давление растворенного кислорода (рОг), растворенного углекислого газа (рССЬ) и окислительно-восстановительного потенциала (еН), достаточно полно характеризующих потребности микроорганизмов, по которым можно контролировать и управлять процессом в биореакторах различной емкости. При переходе к аппаратам больших емкостей неизбежно меняется гидродинамическая обстановка и масштабировать ее один к одному праї гически не представляется возможным. Следовательно, необходимо знание физических, биологических, биофизических данных, определяющих течение биосинтеза, и с помощью определенных условий аэрации, перемешивания, массообмена
поддерживать оптимальные для биосинтеза параметры по жизненно важным для микроорганизма факторам.
Воспроизводимость процессов биосинтеза в биореакторах различного объема значительно облегчается, если предварительно исследовано влияние на биосинтез следующих основных факторов, определяющих эффективность условий аэрации и перемешивания, условий массообмена в системах газ -жидкость и жидкость - микроорганизм.
Однако следует также учитывать, что масштабный переход в настоящее время не может осуществляться только на основе постоянства каких-либо гидродинамических критериев, так как в процессе биосинтеза меняются реологические свойства культуральных жидкостей, что требует изменения условий аэрации и перемешивания, т. е. управления ими. Именно поэтому необходим весь объем исследовательских работ по изучению всего комплекса проблем культивирования в биореакторах без чего в дальнейшем невозможен обоснованный масштабный перенос процессов культиви ювания от лабораторных биореакторов в промышленные объемы.
Цель и задачи исследования. Цель работы - масштабирование биореакторов для глубинного культивирования микроорганизмов, т.е. нахождение критериев, при которых возможен непосредственный перенос опытных данных, полученных в лабораторных установках в биореакторы промышленного масштаба.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
классификация биореакторов и их выбор;
изучение гидродинамики биореакторов;
анализ массообмена в биореакторах;
анализ основных критерий масштабирования биореакторов для глубинного культивирования микроорганизмов;
- выбор и экспериментальная проверка критериев масштабирования
биореакторов.
Научная новизна. Определены основные критерии масштабирования биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией для глубинного культивирования микроорганизмов с моделированием оптимальных гидродинамических и массо-и теплообменных характеристик. Показана адекватность выбранных критериев масштабирования полученным экспериментальным данным на лабораторных и промышленных биореакторах.
Практическая значимость работы. На основании модели биореактора с механическим перемешиванием и аэрацией выбраны критерии и разработана методика его масштабирования при переносе данных, полученных на лабораторных установках в промышленные биореакторы.
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты доложены и обсуждены на: научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования ФГУП «Щелковский биокомбинат» (Щелково, сентябрь 2004 г.); конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, октябрь 2004 г.).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Теоретическое обоснование и экспериментальная проверка выбранных методов моделирования и масштабирования процесса глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией с использованием современных методов анализа.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литер туры, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 157 наименование, в том числе 82 зарубежных. Материалы диссертации иллюстрированы 7 таблицами и 31 рисунком.
Общие предпосылки
При исследовании процессов культивирования микроорганизмов в био реакторах особое место занимает масштабирование, т.е. нахождение условий, при которых возможен непосредственный перенос опытных данных, полученных для данной системы, с одного масштаба аппарата на другой или соответственно с модельной установки на аппарат промышленного масштаба.
Разработка процессов глубинного периодического культивирования при производстве биопрепаратов (вакцин, диагностикумов) обьгп э осуществляется в три этапа и проходит через оборудование трех масштабов (24, 45, 46,57,83,97):
- лабораторная установка, на которой осуществляются основные операции отбора штамма, составление среды и посева микроорганизмов;
- полупромышленная установка, где определяются оптимальные условия ведения процесса культивирования;
- промышленная установка, на которой осуществляется масштабный перенос полученных ранее данных.
Исследования в области производства биопрепаратов име.от две основные цели: довести новые технологические процессы культивирования до промышленного масштаба или усовершенствовать существующие технологические процессы микроорганизмов (оптимизация питательной среды и процесса культивирования), а также выбор или создание необходимого оборудования (биореакторов) для культивирования (9,43).
Необходимо стараться поддерживать оптимальные условия окружающей среды осуществления конкретного микробиологического процесса на всех уровнях масштаба его проведения. Однако добиться этого сложно. Понятие «условия окружающей среды» или «окружающие условия» охватывает как химические (концентрация субстрата, концентрация предшественника), так и физические (характеристики передачи массы, характеристики перемешивания, усилия сдвига, диссипация энергии) факторы. Если постоянства химических факторов можно достичь посредством обычных операций контроля и регулирования, то физические факторы в значительной ст пени зависят от размеров аппаратуры и изменяются с изменением ее масштабов.
Теория масштабирования процессов культивирования отражена в работах Л.М.Батунера (1966), В.В.Бирюкова (1985), Е.С.Былинкиной (1973), У.Э.Виестура (1987), В.В.Кафарова (1974, 1976, 1979), Е.А.Рубана (1995, 2003), АЛ.Самуйленко (2003), Л.А.Самохвалова (1968), К.Г.Федосеева (1977), S.Aiba, J.E. Beiley, D.F. OUis (1989), A.E.Humphry, N.F.Mills (1965), N.Blakebroygh (1981), R.I.Fox (1978), Y.Miura (1976), Z.Seichert (1977), T.B.Young (1979), OXevenspiel (1972).
Анализируя накопленный за последние годы теоретические и практический материалы по изучению условий аэрации и перемешивания в процессах культивирования микроорганизмов, становится очевидным их значительное влияние на течение биосинтеза и соответственно выход целевых продуктов. Многообразие факторов, определяющих эффективность этих условий, и зачастую невозможность однозначного их решения подчеркивает необходимость в каждом конкретном случае детального решения их изучения. От этого зависит не только выбор режима биосинтеза, но и выбор, в первую очередь, конструкции биореактора (20-22,32).
В настоящее время имеются достаточно достоверные методы экспериментальных исследований и теоретических расчетов эффективности перемешивания и условий массообмена газ — жидкость. В тех случаях, когда вязкость культуральных жидкостей низка, например при культивировании микроорганизмов, решающую роль играют условия массообмена газ - жидкость, предварительное изучение этих условий позволяет затем с наименьшими затратами отработать режимы биосинтеза и осуществить масштабный переход (39,41,44).
Классификация и выбор биореакторов
Основным оборудованием для глубинного культивирования микроорганизмов является биореактор. Основной функцией биореакторов является обеспечение оптимальных условий для роста микроорганизмов в заданных условиях (2).
Хотя конструкция биореакторов для глубинного культивирования микроорганизмов и не поддается шаблону, однако можно предварительно сформулировать ряд следующих основных требований к аппаратам подобного типа (3,10,17, 19, 55, 60, 81):
- возможность поддержания гомогенности культуральной среды;
- оптимальные массообменные характеристики по потреблению питательных веществ и отводу продуктов метаболизма;
- обеспечение стерильности посева, взятия проб и процесса культивирования;
- простота наладки и обслуживания;
- стандартность блоков оборудования для культивирования;
- возможность осуществления масштабного перехода;
- возможность автоматического контроля и регулирования основных
параметров культивирования.
Для глубинного культивирования микроорганизмов наиболее широкое применение нашли биореакторы с перемешивающим устройством (мешалка) и аэрацией (51, 63,92,100).
Биореакторы изготавливают из высоколигированных марок стали. Внутренняя поверхность биореактора для глубинного культивирования микроорганизмов должна быть отполирована.
Биореакторы должны быть достаточно простыми в обслуживании: работа отдельных узлов должна контролироваться, измеряться. Должны регулироваться отдельные физико-химические параметры культивирования (температура стерилизации и культивирования, рН, еН, рОг, рСОг, скорость вращения мешалки, давление, расход воздуха или газов на аэрацию, пенообразо-вание) (1, 5, 8, 59, 61, 62). Соответствующая гидродинамическая обстановка в биореакторе, а следовательно и процессы тепло- и массообмена, поддерживаются с помощью специальной конструкции перемешивающих устройств, диспергаторов газа (барботеров) и наличия отражательных перегородок (отбойников). Кроме того, важное значение, особенно при масштабировании культивирования, имеют геометрические соотношения отдельных элементов биореактора.
В лабораторных и пилотных установках для глубинного культивирования часто корпус изготавливают из термостойкого и нейтрального стекла, а крышку - из нержавеющей стали с вводом через нее перемешивающего устройства, патрубков и датчиков.
Общий вид одной из конструкций биореактора приведен на рис. 2.
1.2.1. Гомогенность культу рольной среды в биореакторе. Процесс глубинного культивирования в биореакторах предусматривает грименение соответствующих методов и оборудования для поддержания гомогенности (однородности культуральной среды). Существуют две основные причины поддержания гомогенности среды и культуры. Первая непосредственно связана с необходимостью контроля и поддержания ряда физико-химических параметров культивирования. Полученная информация дает характеристику лишь о том небольшом объеме, куда помещен датчик. Если физические условия в измеряемом объеме не отличаются от всего объема культивирования, то получаемые данные являются достоверными, а это имеет место только в гомогенной культуре, т.е. в культуре, в которой все компоненты распределены равномерна (11,15, 37).
В микробиологии понятие «микросреда» используется для определения пространства, в котором наблюдается непосредственное взаимодействие между микроорганизмами и окружающей средой, и только если вся микросреда данной культуры одинакова в каждой точке, то такую культуру можно считать гомогенной. Однако все приведенные рассуждения распространяются только на микроуровень, когда величины микроорганизмов не более 1 мкм, а размеры тканевых клеток не более 10 мкм (77, 86,125).
Материалы и методы
Работа выполнена в отделе информатики и технологического обеспечения Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) РАСХН и ФГУП «Щелковский биокомбинат» по разделу 06.01. Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса «Разработать блочно-модуль: .ую линию производства противобактерийных препаратов с использованием современных методов исследований, оборудования и с учетом требований GMP».
При проведении исследований по масштабированию использовались биореакторы с перемешивающим устройством и аэрацией емкостью 5,10, 75, 100, 150, 500 л типа АК-10-1, АНКУМ-2М (институт биологического приборостроения, г. Пущино), биореакторы фирм «Электролюкс» (Швеция), Ма-рубиши (Япония), NBS (США), Bioenginering AG (ФРГ) и Lh tehnology (Англия).
Экспериментальная оценка характеристик дисперсной ЖЕ ДКОЙ фазы осуществлялась микроскопированием проб из биореактора.
В качестве характеристики микроперемешивания использовано понятие степени сегрегации, когда объем жидкости диспергирован на отдельные «жидкие» частицы, каждая из которых рассматривалась как отдельная система с достаточно малым объемом по сравнению с объемом биореактора, но достаточно большим, чтобы содержать в себе значительное число микроорганизмов. Степень сегрегации может меняться от 1 (полная сегрегация) до 0 - перемешивание на микроуровне.
Оценка интенсивности перемешивания по уровню микропі ремешива-ния проведена с помощью анализа структуры потоков с учетом, что каждый элемент потока может находиться в активной зоне различное время. Средняя длительность пребывания любой частицы (микроорганизм, кислород и т.д.) в биореакторе характеризуется функцией распределения F(t), распределяющих долю частиц, пребывающих в биореакторе в течение времени (t).
Изучение структуры потоков производилось введением в биореактор различных индикаторов в виде ступенчатого, импульсного или синусоидального возмущения. В качестве индикаторов использовались растворы кислоты или щелочи.
Удельный расход мощности на перемешивание в биореакторе при
Rer -10 определялся по уравнению N.=N, 4 (23)
где N0 - мощность, потребляемая мешалкой;
Np - число мощности для турбинной мешалки с плоскими лопастями - 5.0;
q - ускорение свободного падения;
п — скорость вращения мешалки; dm - диаметр мешалки; рж - плотность культуральной жидкости.
Эффективность работы биореактора по массообменным характеристикам можно предварительно оценить сульфитным методом, основанном на окислении кислородом сульфита натрия в сульфат.
Более сложным, но соответственно и более точным является динамический метод, когда концентрация растворенного кислорода опреде тяются после резкого прекращения подачи аэрирующего газа и при подаче его вновь.
Для определения реального коэффициента массопередачи в процессах культивирования микроорганизмов использовался балансный метод, когда в условиях установившегося режима культивирования (экспоненциальная фаза) определялось парциальное давление растворенного кислорода (рОг) и углекислого газа (рС02).
При предварительных лабораторных исследованиях гидродинамики, массообмена и критериев масштабирования использовались вода и бактерии Escherichie coli, которые культивировались в лабораторных биореакторах на глюкозной питательной среде с добавлением минеральных солей (простая среда) в безопасных для экспериментатора условиях.
