Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Общие предпосылки 9
1.2. Характеристика процесса 10
13. Основные направления совершенствования периодических процессов микробиологического синтеза 13
1.4. Материальные и энергетические балансы 14
1.5. Кинетические модели 15
1.6. Термодинамика и процессы жизнедеятельности 18
1.7. Моделирование гидродинамики биореакторов 20
1.8. Моделирование периодических процессов глубинного культивирования микроорганизмов 24
1.9. Оптимальное управление периодическими процессами глубинного культивирования микроорганизмов 30
2. Собственные исследования 36
2.1. Материалы и методы :. 36
2.2. Результаты исследований 41
2.2.1. Изучение влияния основных технологических параметров на процесс периодического глубинного культивирования микроорганизмов 41
2.2.2. Материальный баланс глубинного культивирования микроорганизмов 44
2.2.3. Термодинамические и кинетические параметры 48
2.2.4. Изучение гидродинамических условий в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией в процессе глубинного периодического культивирования микроорганизмов 50
2.2.5. Объединение кинетической и гидродинамической модели 55
2.2.6. Влияние концентрации глюкозы на выживаемость микроорганизмов на разных фазах роста 57
2.2.7. Математическая модель периодического процесса глубинного культивирования микроорганизмов 61
2.2.8. Выбор каналов и законов регулирования при управляемом Культивировании сальмонелл шт. №9 и ТС-177 74
3. Обсуждение результатов исследований 80
4. Выводы 83
5. Практические предложения 85
Литература 86
Приложения 99
Введение к работе
Актуальность проблемы. При производстве противобактерийных препаратов для получения микробной массы используется глубинное периодическое культивирование в биореакторах. Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики биопрепаратов. Накоп тение биомассы микроорганизмов при этом находится в тесной зависимости от выбранного штамма, состава питательной среды, конструкции биореактора и условий культивирования. Однако большинство технологических процессов, в том числе и культивирование при промышленном производстве ветеринарных препаратов, базируется на эмпирических данных и требует научного обоснования. Частые колебания в накоплении микробной массы в биореакторах, наблюдаемые в практике производства биопрепаратов, вызывают необходимость селекционирования новых высокопродуктивных штаммов; усовершенствования состава питательных сред и конструкции бис реакторов, оптимизации режимов глубинного периодического культивирования микроорганизмов.
Процесс выращивания микроорганизмов до недавнего времени представлялся довольно простым, идущим через ряд принципиально общих стадий, приводящих к получению из небольшого количества посевного материала значительного количества биомассы или биомассы и продуктов метаболизма.
Отечественная агробиологическая промышленность выпускает несколько десятков противобактерийных вакцин. В технологии их изготовления основным направлением является разработка современных процессов глубинного культивирования микроорганизмов, позволяющих интенсифицировать производство вцелом и получать высококачественные биопрепараты. Большинство работ, посвященных процессам глубинного культивирования микроорганизмов для изготовления ветеринарных препаратов (диагностику-
мов, вакцин), за редким исключением, отмечают возможность глубинного выращивания микроорганизмов без учета процессов метаболизма и влияния основных физико-химических параметров (за исключением температуры и рН) на динамику их роста.
Важным методологическим вопросом математического моделирования является выбор уровня организации биологической системы, моделирование взаимодействия компонентов культуральной среды, которые наиболее полно и адекватно соответствует поставленной практической задаче. Конечной целью математического моделирования является управляемое культивирование микроорганизмов.
Лимитирование, ингибирование или стимулирование роста микроорганизмов и процессов биосинтеза известными управляющими воздействиями в известные моменты роста популяции - эю и есть управляемое культивирование. Примером является оптимизация процесса биосинтеза эритромицина по температуре и рН с увеличением выхода на 10%.
В связи с вышеизложенным, весьма актуальным в решении этой общей проблемы является оптимизация процессов глубинного периодического культивирования микроорганизмов с использованием современных методов математического моделирования и разработка алгоритма оптимального управления применительно к свойствам и особенностям используемых культур микроорганизмов.
Цель и задачи исследования. Цель работы - оптимизация процессов глубинного периодического культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией с использованием методов математического моделирования.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
- изучение влияния основных технологических параметров на процесс периодического глубинного культивирования микроорганизмов;
разработка материального баланса в процессе роста культуры микроорганизмов;
анализ термодинамических параметров и определение коэффициента полезного действия (к.п.д.) роста популяций микроорганизмов;
изучение динамики и составление кинетической модели периодического выращивания микроорганизмов;
изучение гидродинамических условий в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией в процессе глубинного периодического культивирования микроорганизмов;
разработка объединенной кинетической и гидродинамической модели глубинного периодического культивирования микроорганизмов в биореакторе;
разработка математической модели и алгоритма управления культивированием микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией.
Научная новизна. Определены основные критерии для математического моделирования процессов глубинного периодического культивирования микроорганизмов в биореакторе.
Разработана математическая модель периодического глубинного культивирования микроорганизмов.
Разработан алгоритм и система управления процессом глубинного периодического культивирования микроорганизмов в биореакторе.
Показана адекватность выбранной математической модели экспериментальным данным при управляемом глубинном периодическом культивировании микроорганизмов.
Практическая значимость работы. Впервые разработана методика анализа материальных, энергетических балансов, кинетических и гидродинамических показателей процессов и математическая модель периодического
глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах, используемых для производства вакцин и диагностикумов для нужд ветеринарии.
Разработан алгоритм управления периодическим процессом глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией.
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты доложены и обсуждены на: Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» (Владимир, март 2004 г.); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина — 2004»; «Современные аспекты разработки, маркетинга и производства ветеринарных препаратов» (Феодосия, май 2004 г.); научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования ФГУП «Щелковский биокомбинат» (Щелково, сентябрь 2004 г.); конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, октябрь 2004 г.).
По результатам диссертации опубликовано 5 работ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту. По результатам составления материального и энергетических балансов изучена кинетика и гидродинамика процесса глубинного периодического культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией.
Проведено теоретическое обоснование и экспериментально проверены методики использования математического моделирования при оптимизации процессов глубинного периодического культивирования микроорганизмов в биореакторах.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 201 наименование, в том
"if '
числе 77 зарубежных авторов. Материалы диссертации иллюстрі рованы 11 таблицами и 22 рисунками.
Общие предпосылки
Современные биотехнологические производства представляют собой сложный комплекс взаимосвязанных биохимических и физико-химических процессов. Для определения оптимальных условий организации производства глубинного культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией необходимо исследование этих процессов на популяционном и аппаратурно-технологическом уровнях функционирования. Это требует разработки специальных методов и приемов решения научных и технических задач, возникающих в связи с проблемами оптимизации и управления живыми системами (10, 28, 32, 52, 57, 65, 70, 76, 113, 145).
С методической точки зрения из огромного многообразия биологических систем целесообразно выделить в отдельный класс так называемые «нечетко определяемые» системы, характерными признаками которых являются (184) невозможность создания в данное время детального математического описания процесса только за счет количественных соотношений, наличие качественной информации (априорная информация) и визуальной щенки исследователем или оператором состояния системы (текущая информация) (9,13,17,43,48,92,100).
Чрезвычайно сложная иерархическая организация таких биотехнологических систем затрудняет построение теоретического фундамента, основанного на законах, выраженных в количественной форме, а обширные накопленные знания представлены преимущественно в описательной форме (51,55,161).
Большой удельный вес информации описательного (качественного) характера о поведении микробиологических систем часто затрудня т строгую математическую постановку и решение задач исследования, моделирования, оптимизации и управления микробиологическими явлениями и процессами, что является существенным тормозом в решении актуальных задач, стоящих перед современной биотехнологией (144,146, 169, 179).
Однако, создание современных технических средств автоматического контроля и управления основными физико-химическими и технологическими параметрами культивирования микроорганизмов (температура, рН, еН, рОг, рСОг и т.д.) позволяет получить количественную информацию в процессе культивирования микроорганизмов.
В условиях обилия информации о внутренней структуре и особенностях функционирования биотехнологических систем возникает проблема разработки специальных приемов эффективного использования накопленной количественной информации для целей моделирования, оптимизации и управления этими системами (27,44,50,57,77,82,83, 89,102,103).
Теория процессов культивирования микроорганизмов у нас в стране создана Н.Д.Иерусалимским (1963), И.А.Работновой (1974, 1976), И.Н.Помозговой (1979), Н.С.Печуркиным (1978), В.В.Кафаровым (1979), И.А.Баснакьян (1992), В.В.Бирюковым (1985), Е.А.Рубаном (1995, 2003); за рубежом - I.Monod (1942), A.Novick (1959). D.Herbert (1958, 1961), A.Fiecher (1975), SJ.Pert (1975), G.Hamer (1982), J.Janessens (1984) и, в основном, посвящены производству антибиотиков, дрожжей, БВК, ферментов и т.д. Отсутствуют работы по моделированию процессов культивирования микроорганизмов при производстве ветеринарных биопрепаратов.
Следовательно, оптимизация и управление биотехнологическими процессами требуют построения математических моделей, описывающих как количественные связи между различными переменными объектами управления (16,35,37,75,198).
Характеристика процесса
Перечень продуктов микробного синтеза чрезвычайно велик и непрерывно пополняется новыми наименованиями. В настоящее время большинство продуктов производится способом периодического культивирования ми кроорганизмов.
В связи с этим вопросы совершенствования периодических процессов культивирования микроорганизмов в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией являются актуальным при производстве ветеринарных биопрепаратов (18).
Периодический процесс характеризуется однократной загр) жой питательной среды и выгрузкой готового продукта, а по ходу процесса культивирования производится подача воздуха на аэрацию, периодическая или непрерывная подача титрантов, пеногасителей и добавок. Периодический процесс культивирования, в основном связан с накоплением либо биомассы, либо продуктов метаболизма (3,107).
Характеристика процесса как объекта исследования обычно производится по основным кинетическим зависимостям и по конечному целевому продукту и может быть условно поделена на три группы (29,99,110,190).
Первая группа - это биопрепараты, имеющие в конечном лродукте в качестве основного активного компонента жизнеспособные микроорганизмы. К этой группе относятся вакцины, средства защиты растений, бактериальные удобрения, биодеграданты и другие активные средства биотрансформации (46, 88).
Вторая группа является промежуточной, когда в процессе культивирования полученный продукт косвенно связан с процессом метаболизма. В данном случае организм генетически видоизменен таким образом, что он следует по метаболическому пути, ведущему к сверхсинтезу целевого продукта. Примером может служить производство аминокислот, лимонной кислоты и др. (83).
Третья группа - биопрепараты на о :нове очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов. К ним относятся витамины, аминокислоты, ферменты, антибиотики, биолипиды, полисахариды, продукты комплексной переработки биомасс и метаболитов (128).
Микроорганизмы различают по своим трофическим свойствам (111). Аэробные микроорганизмы растут только s присутствии кислорода, анаэробные - без него. Имеется промежуточный класс микроорганизмов - факультативные анаэробы (36,38).
Аэробные микроорганизмы более других используют в промышленных биотехнологических процессах, которые существенно различаются по условиям массопередачи кислорода и гидродинамики. Это связано не только с конструкцией биореактора, в котором осуществляется процесс культивирования, но и реологическими свойствами культуральной жидкости (плотность, вязкость, ньютоновскими или неньютоновскими свойствами) (22,30, 56,81,86,87,106,115).
Отмечаются (12, 156) некоторые особенности микробиологических процессов как объектов управления.
Обычно процессы глубинного культивирования синтеза являются частью многостадийного производства биопрепаратов (вакцин, диагностикумов и т.д.) (47).
Культивирование микроорганизмов осуществляется в асептических условиях, что связано со стерилизацией биореактора и его обвязки, а также всех компонентов, поступающих в биореактор (68,69,73,129).
При этом оно осуществляется в гетерогенных многофазных системах, реологические свойства которых в ходе процесса часто изменяются (33,93,122,135,154,168,183).
Наличие биологической основы микробиологических процессов предопределяет более высокую, по сравнению с химико-технологическими процессами, вариабельность объекта (97).
Материалы и методы
Основной объем исследований выполнен в 2003 - 2004 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте биологической промышленности и ФГУП «Щелковский биокомбинат» по поисковой теме «Провести математическое моделирование и оптимизацию процессов глубинного культивирования аэробных микроорганизмов» по плану НИР и ОКР на 2004 г., включенную в программу фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению р.язвития агропромышленного комплекса РФ на 2001-2005 г.
При проведении исследований по моделированию и оптимизации периодических процессов глубинного культивирования аэробных микроорганизмов были использованы следующие культуры: Salmonella clolerae suis, шт ТС 177 и №9, Pasteurella multocida, 2-й авирулентный (пастеровский) штамм; Brucella abortus, шт. 19; Campylobacter fetus subspecies intestinalis №30 (ВИ-ЭВ). Культивирование осуществлялось на лабораторных установках АК-10-1 и АНКУМ-2 и промышленном биореакторе фирмы «Электролюко емкостью 100л.
Процессы биосинтеза представляют собой системы со сложной структурой, поведение которых зависит от множества факторов. Для определения этой структуры, а также степени влияния на нее разных факторов, измерялись текущие значения многих переменных. Это явилось основой при анализе процессов метаболизма, а также для оптимального управления процессом периодического глубинного культивирования аэробных микроорганизмов. Основные переменные процесса, которые измерялись в процессе исследований, представлены в таблице 2. Их можно разделить на три категории.
1. Переменные, характеризующие состояние микроорганизмов -концентрация микроорганизмов, их размерные и возрастные характеристики, текущая скорость роста.
2. Переменные, характеризующие химический состав культуральной среды (концентрация питательных углеводных субстратов, концентрация минеральных солей).
3. Переменные, характеризующие фгзико-химические условия в биореакторе (температура среды, давление, вязкость и плотность среды и т.д.).
