Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие атомной промышленности тесно связано с решением проблемы утилизации радиоактивных отходов (РАО). На начальных этапах радиоактивные отходы удаляли в пресные и морские водоемы, в подземные горизонты (Лаверов и соавт., 1991, 2000). Впоследствии в США, Канаде и европейских странах, производящих радионуклиды, была принята концепция многобарьерного варианта захоронения радиоактивных отходов, которые сначала цементируют или остекловывают, затем в контейнерах помещают в хранилище, размещенное в геологической формации.
В России одним из методов захоронения радиоактивных отходов среднего и низкого уровня активности является их нагнетание в жидком виде в глубинные водоносные геологические формации - пласты-коллекторы (Рыбальченко и соавт., 1994; Адушкин и соавт., 1999).
По данным многолетних наблюдений за эксплуатацией глубинных хранилищ жидких РАО установлено, что за счёт процессов сорбции на песчано-глинистых породах основное количество радионуклидов переходит в твёрдую фазу и локализуется на незначительном расстоянии от нагнетательных скважин (Захарова и соавт., 2003). В результате уровень активности в межпоровом пространстве пород по мере удаления от нагнетательной скважины (100-150 м) снижается до значений ниже регламентированных для радиоактивных отходов (НРБ, 1999).
Несмотря на большое количество данных, накопленных по миграции радионуклидов в глубинных хранилищах жидких РАО, сведения о влиянии микроорганизмов на формы нахождения и подвижность радионуклидов в этой экосистеме ограничены (Francis et al., 1998; Francis, 1998).
Известно, что взаимодействие микроорганизмов с радионуклидами может происходить по разным механизмам: биосорбция (адсорбция на клеточной поверхности), биоаккумуляция (проникновение и накопление внутри клетки), биотрансформация (изменение степени окисления радионуклида за счёт биохимических процессов) и др. (Lovley, Anderson, 2000; Lloyd, Macaskie, 2000; Gadd, 2000; Nealson, Saffarini, 1994).
Имеется обширная литература о составе микроорганизмов на поверхности контейнеров с отвержденными РАО и в окружающих породах, исследованы процессы образования биопленок и биогенной коррозии материалов, из которых сделаны контейнеры (West et al., 1982; Pedersen et al., 1996; Stroes-Gascoyne, West, 1997; Pedersen, 1996; McKinley et al., 1997; Humphreys et al., 1997). Результаты этих микробиологических
исследований невозможно однозначно экстраполировать на глубинные хранилища жидких РАО (Nazina et al., 2004; Косарева и соавт., 2007). Основными компонентами средне- и низкоактивных отходов являются нитрат- и сульфат-ионы, ацетат и детергенты; радионуклиды представлены главным образом продуктами деления: 141, 144Се, 90Sr, 137Cs, 95Zr, 95Nb, 103' 106Ru и 3H (Рыбальченко и соавт., 1994). Долгоживущие альфа-излучающие нуклиды могут содержаться в следовых количествах. В связи с вышесказанным, необходимо исследование глубинных хранилищ РАО как среды обитания микроорганизмов, изучение основных групп микроорганизмов, которые по теоретическим предположениям могут участвовать в преобразовании химических и радиоактивных компонентов отходов (денитрифицирующие, сульфат- и железоредуцирующие и другие).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение распространения, биоразнообразия и геохимической деятельности микроорганизмов в глубинном хранилище жидких радиоактивных отходов и выяснение роли микроорганизмов в преобразовании радионуклидов (урана и трансурановых элементов).
Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.
Исследовать экологические условия в глубинных горизонтах, используемых для захоронения жидких радиоактивных отходов, определить численность микроорганизмов основных физиологических групп и оценить скорости биогенных процессов в зоне дисперсии отходов и вне этой зоны.
Выяснить биоразнообразие микробного сообщества глубинных горизонтов методом ГХ-МС анализа жирных кислот суммарной биомассы сообщества и молекулярно-биологическим методом анализа генов 16S рРНК.
3. Выделить чистые культуры аэробных органотрофных и
анаэробных сульфат- и железо-редуцирующих бактерий из глубинных
горизонтов. Определить таксономическое положение и исследовать
физиолого-биохимические свойства чистых культур.
4. Оценить способность выделенных микроорганизмов участвовать
в восстановлении нитрат-ионов и трансформации и концентрировании
урана и трансурановых элементов.
Научная новизна работы. Впервые микробное сообщество глубинного хранилища жидких радиоактивных отходов исследовано с использованием микробиологических, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов. На примере глубинных хранилищ РАО ФГУП «Сибирский Химический Комбинат» показано, что плотность микробной
популяции и скорости процессов денитрификации и сульфатредукции в пластовых водах были низки и возрастали в зоне дисперсии отходов.
Методом анализа генов 16S рРНК пластовой воды показано, что в
глубинных горизонтах доминировали Alpha-, Beta-, Gamma- и Delta-
proteobacteria, выявлены также представители порядков Nitrospirales,
Actinobacteriales, Verracomicrobiales, Planctomycetes, Dehalococcoidetes и
некультивируемых групп домена Bacteria. Архей включали метаногенов
семейства Methanomicrobiaceae и Methanobacteriaceae и
некультивируемые кренархеоты. Эти результаты подтверждены
микробиологическими методами, позволившими выявить
грамотрицательных протеобактерий и грамположительных
актинобактерий в пластовой воде, содержащей компоненты низкоактивных отходов (НАО).
Из глубинных горизонтов выделено более 50 штаммов разных физиологических групп, относящихся к известным видам родов Kocuria, Microbacterium, Pseudomonas, Pantoea, Acinetobacter, Enterobacter, Klebsiella, Stenotrophomonas, Sphingomonas, Acidivorax, Shewanella и Desulfosporosinus. Два штамма, имеющие 98% сходства генов 16S рРНК с таковыми вида Cellulomonas flavigena, вероятно, относятся к новому виду.
В составе пластовой микрофлоры обнаружены микроорганизмы, способные участвовать в преобразовании химических и радиоактивных компонентов отходов. Денитрифицирующие бактерии восстанавливали нитрат-ионы до N2. Бактерии рода Shewanella и сульфатредуцирующие бактерии восстанавливали 233U(VI) и 237Np(V) в присутствии разных органических субстратов, что свидетельствует о возможном участии их в осаждении и концентрировании радионуклидов в глубинном хранилище. Обнаружены бактерии Klebsiella oxytoca, способные окислять сульфид железа за счет восстановления нитрат- до нитрит-иона, и таким образом способствовать растворению труднорастворимых соединений металлов и их дальнейшей миграции.
Аэробные бактерии сорбировали (аккумулировали) актиниды и другие трансурановые элементы, входящие в состав отходов - Pu, Np, 233U, 241Ат и 90Sr, и не сорбировали 137Cs и 99Тс. Максимум сорбции 237Np наблюдается при рН 7-9; a 238Pu, 241Ат и 233U при рН 3-5. Показано, что в сорбции урана клетками грамотрицательных бактерий P. fluorescens и Р. grimontii участвуют органические фосфаты. Выявлен конкурентный характер биосорбции 238Pu, 241Ат и 237Np из карбонатных растворов, близких по составу пластовой воде, что в целом позволяет считать незначительным вклад биосорбции в концентрирование радионуклидов в глубинном хранилище жидких радиоактивных отходов.
Научно-практическая значимость работы. Результаты изучения микробных процессов в глубинных хранилищах жидких радиоактивных отходов могут быть использованы при составлении прогнозов миграции радиоактивных и химических компонентов отходов в подземных горизонтах. Выделены штаммы, избирательно сорбирующие 241Am, 237Np, Ри и U из разбавленных растворов. Показана перспективность поиска микроорганизмов для разработки биотехнологий сорбционной очистки жидких отходов от радионуклидов в поверхностных хранилищах.
Снижение концентрации нитрат-ионов путем активации жизнедеятельности денитрифицирующих бактерий в глубинном горизонте будет способствовать повышению радиоэкологической безопасности глубинных хранилищ жидких радиоактивных отходов и предотвращению миграции радионуклидов.
Исследования выполняли в 2004-2007 гг. при финансовой поддержке РФФИ (гранты №№ 05-04-49556, 05-03-32129 и 06-03-33193).
Апробация работы. Результаты работы были представлены на пятой Российской конференции по радиохимии "Радиохимия-2006" (Дубна, 2006); четвертом Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007); четвертой молодежной научно-практической конференции "Ядерно-промышленный комплекс Урала: Проблемы и перспективы" (Озерск, 2007) и на Всероссийской межведомственной научно-технической конференции "Подземное захоронение жидких радиоактивных отходов: прошлое настоящее будущее" (Северск, 2007).
Личный вклад соискателя состоял в проведении экологических, микробиологических и радиохимических исследований и обработке экспериментальных данных. Радиохимические анализы выполняли в лаборатории экологических проблем обращения с радиоактивными и токсичными отходами ИФХЭ РАН (зав. лаб., к.х.н. Е.В. Захарова), микробиологические исследования - в лаборатории нефтяной микробиологии ИНМИ РАН (зав. лаб., д.б.н., профессор С.С. Беляев). Электронно-микроскопические исследования проводили совместно с Н.А. Кострикиной (ИНМИ РАН), молекулярно-биологические - с А.Б. Полтараусом (ИМБ РАН), Н.К. Павловой, Е.М. Михайловой и Т.П. Туровой (ИНМИ РАН). Автор приносит благодарность соавторам Л.И. Константиновой, И.М. Прошину, B.C. Ивойлову, Г.А. Осипову и И.Г. Тананаеву, а также всем коллегам и друзьям за содействие и поддержку.
Публикации. Материалы диссертации представлены в 6 печатных работах, включая 3 статьи и 3 тезисах конференций.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 178 страницах машинописного текста, включая 37 рисунков и 23 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, содержащей разделы "Объекты и методы исследования", "Результаты исследований и их обсуждение", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы", включающий 34 отечественных и 220 зарубежных наименований.
