Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Влияние экзогенных факторов на стабильность мРНК растений 10
1.2. Факторы, определяющие селективную деградацию мРНК 17
1.2.1. Цис-элементы стабильности мРНК 17
1.2.2. Транс-факторы, участвующие в регуляции распада мРНК 25
1.2.3. Пути деградации мРНК в растительной клетке 33
1.3. Посттранскрипционное "молчание" генов и РНК интерференция 39
1.4. Методические подходы к изучению деградации мРНК 44
1.4.1. Методы определения содержания специфических мРНК 44
1.4.2. Методы оценки стабильности мРНК 48
1.4.3. Применение технологий массового анализа экспрессии генов для изучения стабильности мРНК 54
1.5. Анализ литературных данных о распаде мРНК эукариот в
высокоочищенных препаратах (in vitro) 56
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 64
2.1. Подготовка растительного материала 64
2.2. Выделение суммарной РНК 65
2.3. Обработка мРНК целитом 66
2.4. Аффинная хроматография мРНК на поли(У)-сефарозе 66
2.5. Термальная хроматография поли(А)мРНК на поли(У)-сефарозе 67
2.6. Радиоактивное мечение дезоксирибонуклеотидных зондов 67
2.7. Гибридизация дезоксирибонуклеотидных зондов с поли(А)мРНК на колонке поли(У)-сефарозы 68
2.8. Гибридизация дезоксирибонуклеотидных зондов с мРНК
в растворе 69
2.9. Синтез кДНК и полимеразная цепная реакция 70
2.10. Электрофоретический анализ РНК и ДНК 71
2.11. Статистическая обработка результатов 72
2.12. Использованные реактивы 72
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 73
3.1. Сравнение закономерностей деградации мРНК злаков in vivo и in vitro 73
3.2. Влияние света и температуры выращивания на стабильность мРНК пшеницы и ячменя 92
3.3. Изменение стабильности мРНК пшеницы и ячменя под действием стрессов 99
3.4. Влияние биологически активных веществ на стабильность мРНК пшеницы 114
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 120
ВЫВОДЫ 126
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 128
- Влияние экзогенных факторов на стабильность мРНК растений
- Подготовка растительного материала
- Сравнение закономерностей деградации мРНК злаков in vivo и in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Стабильность мРНК - оперативный элемент системы регуляции белкового синтеза у растений, важное звено адаптивной реакции растений на неблагоприятные воздействия среды [Клячко, 1991; Плотников, 1992; Johnson et ah, 1998]. Изучение стабильности мРНК растений - актуальная задача, решение которой позволит расширить представления о механизмах приспособления растительного организма к условиям окружающей среды, более эффективно и целенаправленно использовать теоретические представления о молекулярных механизмах адаптации в целях практической селекции.
В современных условиях достижения генетики, молекулярной биологии и биотехнологии значительно расширяют возможности селекции в создании устойчивых сортов. Несомненно, успех приложения генетических знаний к селекционному процессу в значительной степени определяется разработкой экспресс-тестов для увеличения скорости оценки генотипов по необходимым признакам продуктивности и устойчивости. Методы селекции на устойчивость к различным неблагоприятным факторам среды, используемые в настоящее время, зачастую трудоемки, требуют значительных финансовых затрат и времени. В связи с этим перспективной представляется разработка молекулярных маркеров стрессоустойчивости, особенно на основе такого динамичного и информативного показателя, как стабильность мРНК.
В настоящее время уже многое известно о молекулярных процессах, лежащих в основе дифференциальной стабильности мРНК эукариот, идентифицированы цис- и транс-факторы, участвующие в деградации мРНК [Ross, 1995; Gallie, 1996; Gutierrez et al., 2002]. Однако изучение изменения стабильности в зависимости от внешних и внутренних сигналов значительно сдерживалось отсутствием простого и эффективного метода оценки. В лаборатории молекулярной биологии КНИИСХ им П.П. Лукьяненко более 15 лет ведутся
исследования посттранскрипционной регуляции синтеза белка у злаковых растений на уровне стабильности мРНК. В ходе работ по выделению полиадени-лированной мРНК из проростков озимой пшеницы было обнаружено явление дифференциального распада мРНК in vitro, отражающее генетические особенности и физиологическое состояние растений [Плотников и др., 1993; Плотников и Бакалдина, 1997]. Эти факты послужили отправной точкой исследований стабильности мРНК в простейшей бесклеточной системе, некоторые результаты которых представлены в данной работе. Система получила название оттр от латинского выражения "omnia теа тесит porto " ("все свое несу с собой"), предложенного А.С. Спириным для характеристики свойства мРНК ассоциироваться с факторами, необходимыми для ее функционирования [Spirin, 1978].
В последние годы определены последовательности геномов более 800 видов живых организмов. Однако расшифровка нуклеотидных последовательностей не всегда дает полное представление о функциональном значении и экспрессии генов. В связи с этим большое значение приобретает анализ изменений стабильности целых групп мРНК в ответ на различные внешние воздействия, оценка экспрессии десятков тысяч генов одновременно [Brenner et ah, 2000; Gutierrez et al, 2002]. Представляется перспективным использование фе-номена Mg -зависимой дифференциальной деградации мРНК in vitro, некоторые особенности которого описаны в данной работе, в сочетании с методами массового анализа, для изучения механизмов экспрессии генов культурных растений и создания новых методов отбора в селекционном процессе. Молеку-лярно-кинетические маркеры на основе анализа стабильности мРНК могут существенно дополнить статичные молекулярные маркеры на основе анализа последовательностей ДНК, особенно когда параметры экспрессии генов важнее параметров их структуры.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение природы феномена дифференциальной деградации мРНК злаков в системе оттр и обоснование возможности применения этой системы в качестве основы для
создания методов оценки таких важнейших параметров селекционного материала, как стрессоустойчивость и фотопериодизм. В соответствии с целями были определены следующие задачи исследования:
Сравнить закономерности распада мРНК злаков in vitro и in vivo, в живой клетке.
С помощью системы оттр исследовать закономерности деградации мРНК в созревающем зерне кукурузы.
Изучить влияние температуры выращивания и света на деградацию мРНК пшеницы и ячменя.
Изучить изменения стабильности мРНК пшеницы и ячменя под действием стрессов и биологически активных веществ.
Показать возможность использования данных об изменениях стабильности мРНК, полученных с помощью системы оттр, для оценки стрессоустойчивое и фотопериодической реакции у злаков.
Исследования проводили на четырехсуточных проростках пшеницы {Triticum aestivum L.) и ячменя (Hordeum vulgare L.) сортов селекции Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко и на созревающем зерне кукурузы (Zea mays L.) линии Wisconsin 64А (W64A+/+) и ее высоколизиновом спонтанном мутанте opaque-2 (W64Ao2/o2).
В работе использовали следующие методы: аффинную хроматографию поли(А)мРНК на поли(У)-сефарозе, термальную хроматографию, молекулярную гибридизацию мРНК со специфичными радиоактивно мечеными дезокси-рибонуклеотидными зондами на поли(У)-сефарозе и в растворе, синтез кДНК (обратную транскрипцию) и полимеразную цепную реакцию для определения содержания специфических мРНК.
Научная новизна. В настоящей работе впервые: - установлено, что при инкубации высокоочищенных препаратов РНК проис-
9+
ходит Mg -зависимый распад суммарной поли(А)мРНК и индивидуальных
мРНК злаков in vitro, который отражает закономерности деградации мРНК in vivo;
использован индекс стабильности суммарной поли(А)мРНК, определенный in vitro, для характеристики физиологической реакции злаков на условия роста: температуру, освещение, стресс, биологически активные вещества;
изучены особенности деградации мРНК фитохрома А у пшеницы и ячменя, показано, что стабильность мРНК фитохрома А связана у этих злаков с генетически детерминированной реакцией на свет;
исследованы холодоиндуцируемые изменения стабильности мРНК субъединицы а фактора элонгации трансляции 1 (eEF-la) у озимых пшеницы и ячменя и установлено, что модуляция стабильности этой мРНК отражает сортоспеци-фичные особенности закалки злаков;
показано, что молекулярные механизмы активации метаболических процессов у пшеницы салициловой кислотой связаны с модуляцией стабильности мРНК.
Научно-практическая ценность работы. Полученные в работе данные о регуляции стабильности мРНК злаков в зависимости от условий роста расширяют современные представления о механизмах регуляции экспрессии генов, молекулярных процессах, лежащих в основе фотоморфогенеза, адаптации растений к стрессам. Предложена и охарактеризована простая и эффективная система для оценки стабильности мРНК злаков с помощью индекса стабильности, определяемого in vitro. Показано, что индекс стабильности характеризует сор-тоспецифичные особенности реакции злаков на изменения условий среды, и, в связи с этим, может служить основой для создания молекулярно-кинетических маркеров стрессоустойчивости и фотопериодизма у злаковых культур.
Основные положения, выносимые на защиту. 1. Распад мРНК в системе оттр происходит аналогично деградации мРНК in vivo.
2. Изменения индекса стабильности суммарной поли(А)мРНК и индивидуальных мРНК PHYA и eEF-І а злаков характеризуют генетически детерминированную физиологическую реакцию растений на изменения условий окружающей среды.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-й международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1995), конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996), II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), VIII международной конференции "Новые направления биотехнологии" (Москва, 1998), IV съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999), региональной конференции "Перспективы внедрения современных биотехнологических разработок для повышения эффективности сельскохозяйственного производства" (Ставрополь, 2000), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), I международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 152 страницах, содержит 12 таблиц и 13 рисунков.
Влияние экзогенных факторов на стабильность мРНК растений
Известны многочисленные примеры того, что изменения стабильности мРНК являются непосредственным результатом смены внешних сигналов. К их числу можно отнести случаи оперативной реакции клеток на действие гормонов, различных стрессовых факторов окружающей среды, а также влияния концентрации определенных эффекторных молекул на распад специфических мРНК [Sachs, 1993; Ross, 1996]. Регуляторную роль селективной деградации мРНК впервые была выявлена у бактерий несколько десятилетий назад, и уже тогда мРНК были разделены на стабильные и нестабильные [Ehretsmann et al, 1992]. В эукариотических клетках время существования стабильных транс-криптов составляет десятки часов, а нестабильных - минуты. Глобиновые мРНК в эритроцитах млекопитающих транслируются десятки часов, время же функционирования факторов роста, таких как c-fos и с-тус, не превышает 30 минут [Ross et ah, 1987].
Безусловно, большое значение в регуляции экспрессии генов растений имеет интенсивность транскрипции. Например, изучение накопления мРНК фитохрома A (PHYA) в колеоптилях овса в темноте и после обработки красным светом показали, что этот транскринт нестабилен, независимо от условий освещения, с периодом полураспада около 1 часа [Seeley et al., 1992]. Такое короткое время существования делает возможным быстрое изменение содержания мРНК PHYA путем изменения скорости транскрипции.
Хотя многие мРНК растений нестабильны в любых условиях и их содержание в цитоплазме регулируется уровнем транскрипции, несомненно, что существует огромное число транскриптов с регулируемой стабильностью мРНК. В литературе описано множество примеров регуляции экспрессии генов у растений, в которых изменение стабильности мРНК предполагается важнейшим компонентом регуляции.
В большинстве таких исследований вывод об изменении стабильности мРНК основывается на разнице между уровнем транскрипции и скоростью накопления транскрипта или на экспериментах с ингибиторами транскрипции [Sullivan & Green, 1993; Gutierrez et al, 1999].
Например, сравнение скоростей деградации и синтеза мРНК запасных белков гороха легуминов и лектина во время созревания семян гороха привело исследователей к выводу о посттранскрипционной регуляции экспрессии соответствующих генов [Thompson, 1989; Turner et al, 1990].
Модуляция стабильности мРНК дает возможность эффективной регуляции белкового синтеза в процессах клеточного роста и дифференцировки. Так, показано, что содержание мРНК гистона НЗ растений регулируется изменением стабильности транскрипта в зависимости от фазы клеточного цикла и накопленного количества гистона НЗ [Kapros et al, 1995].
Свет является одним из главных факторов внешней среды, определяющих рост и развитие растений. Не удивительно, что стабильность многих растительных транскриптов регулируется светом. Фоторегуляция экспрессии генов у высших растений интенсивно изучается с начала 80-х годов. Однако до сих пор мало известно о том, экспрессия каких именно генов высших растений регулируется светом, и какие фоторецепторы передают сигнал. В некоторых случаях фоторегуляции экспрессии генов существенное значение имеет модуляция стабильности мРНК [Thompson & White, 1991].
Прогресс в функциональном анализе фоторецепторов произошел в середине 90-х годов в связи с использованием мутантных растений, не имеющих тех или иных фоторецепторов, в частности, из семейства фитохромов. Новейшие методические подходы с использованием микрочипов и флуоресцентного сканирования открывают широкие перспективы идентификации генов, экспрессия которых регулируется светом, и фоторецепторов, участвующих в реакции на свет [Kuno & Furuya, 2000].
Подготовка растительного материала
Семена пшеницы и ячменя отмывали в водопроводной воде и проращивали при 20С на фильтровальной бумаге. Через трое суток снимали верхний слой бумаги и включали освещение или оставляли проростки в темноте. Четы-рехсуточные растения срезали и немедленно фиксировали в жидком азоте. Хранили материал в жидком азоте.
Эксперименты по блокаде транскрипции проводили на этиолированных проростках. Корни проростков инкубировали 6 ч на растворе актиномицина Д (20 мкг/мл). Для изучения влияния салицилата натрия на стабильность мРНК зеленые проростки пшеницы инкубировали в течение 20 ч на растворах салицилата натрия различной концентрации (10 3; 10"4; 10"5М). Эксперименты со стимуляторами роста фуроланом и янтарной кислотой предусматривали замачивание семян пшеницы в растворах этих препаратов (10"5М) в течение 18ч перед проращиванием.
Кукурузу выращивали в полевых условиях. Проводили искусственное самоопыление, початки срезали через 15, 20 и 30 дней после опыления, зерно фиксировали и хранили в жидком азоте.
В экспериментах по блокаде транскрипции початки кукурузы линии W64A+/+ срезали с растения, рассекали на сегменты и инкубировали в течение 5 ч на растворе актиномицина Д (20 мкг/мл); контрольные сегменты инкубировали на дистиллированной воде при температуре 23С. После инкубации сегменты замораживали и хранили в жидком азоте.
Выделение суммарной РНК
РІЖ выделяли фенол-детергентным методом по Plotnikov & Bakaldina (1996). Проростки пшеницы и ячменя размалывали в жидком азоте до пылевидного состояния, заливали 5 объемами экстрагирующего буфера (200 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 50мМ MgCl2, бОмМ КС1) и добавляли SDS до конечной концентрации 2%. Гомогенат дважды экстрагировали при комнатной температуре равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) для денатурации и удаления большей части белков. Водную фазу отделяли центрифугированием при (3000g 20 минут). Нуклеиновые кислоты осаждали 2,5 объемами этанола с добавлением ацетата натрия до концентрации 0,3 М (2 часа, -20С). Осадок отделяли центрифугированием (ЗОмин, 5000g) и перерастворяли в бидистиллированной воде (1 мл на 1 г растительной ткани), смешивали с таким же количеством депро-теинизирующего раствора (8М хлористый литий, 8М мочевина, 4мМ Na2-EDTA) для осаждения и очистки РНК. Смесь выдерживали в течение ночи при +4С и центрифугировали (ЗОмин, 3000g). Осадок промывали 70% этанолом, растворяли в минимальном объеме стерильной бидистиллированной воды и центрифугировали (ЗОмин, 3000g) для отделения полисахаридов. При выделении РНК из зерна кукурузы в экстрагирующий буфер добавляли сахарозу до концентрации 0,25М и для отделения крахмала подвергали гомогенат дополнительному центрифугированию (3000g, 30 секунд) и только после этого добавляли SDS.
Концентрацию и чистоту препаратов РНК определяли спектрофотомет-рически по стандартной методике из расчета 1 ОЕ2бо = 40 мкг/мл [Маниатис и др, 1984]. Выход высокополимерной РНК обычно составлял около 1мг/1г свежего веса ткани при отношении А26о/А280 1,8 и А260/А2зо 1 9. Выделенные таким образом препараты РНК активно транслировались в бесклеточной системе синтеза белка. Хранили РНК в жидком азоте не более трех месяцев.
Сравнение закономерностей деградации мРНК злаков in vivo и in vitro
Одним из основных методов выделения полиаденилированной мРНК, применяемых в молекулярной биологии с начала 70-х годов, является аффинная хроматография. Суть метода состоит в том, что препарат РНК пропускают через колонку с поли(У)-сефарозой или олиго(ёТ)-целлюлозой. В таких условиях происходит гибридизация поли(А)-содержащей мРНК с последовательностями поли(У) или олиго(сГГ), закрепленными на инертном носителе. Существенный момент выделения мРНК этим методом - возможность ее доочистки от не специфически связавшихся молекул рибосомной РНК повторным циклом хроматографии [Aviv & Leder, 1972; Попов и др., 1975].
В ходе выделения мРНК из проростков пшеницы и ячменя в лаборатории молекулярной биологии КНИИСХ им. Лукьяненко были отмечены некоторые закономерности изменения процентного выхода мРНК во втором цикле хроматографии от выхода в первом цикле (% поли(А)++мРНК от поли(А)+мРНК) [Плотников и др., 1993]. При этом доля выхода поли(А)++мРНК во втором цикле хроматографии зависела как от культуры и сорта растений, так и от их физиологического состояния в момент фиксации [Плотников и др., Патент РФ, 1997].
Для изучения состава фракции РНК, которая не сорбировалась на колонке с аффинным носителем при повторном нанесении на нее поли(А)+мРНК, использовали ионообменную хроматографию на метилированном альбумин-кизельгуре (МАК). Оказалось, что помимо рибосомной РНК, эта фракция содержит большое количество низкомолекулярных продуктов деградации РНК. Только 10% материала сорбировалось на МАК.
Логично было предположить, что разрушение мРНК во время хроматографии связано с загрязнением препарата рибонуклеазами. Однако ни обработка препаратов РНК проназой и протеиназой К, ни эксперименты с разведением препаратов РНК не подтвердили присутствия в препаратах РНК свободных нуклеаз [Плотников и Бакалдина, 1997].
Литературные данные о деградации мРНК в высокоочищенных препаратах и факты изучения дифференциального распада транскриптов в системах in vitro позволили предположить, что разрушение мРНК в ходе хроматографии производится ассоциированными РНКазами. Закономерная зависимость выхода поли(А)++мРНК по отношению к поли(А)+мРНК (индекс стабильности) от сорта и условий выращивания растений привела исследователей к выводу о возможной аналогии распада мРНК in vitro, в процессе хроматографии, и in vivo, в живой клетке [Плотников и др., 1993; Плотников и Бакалдина, 1997].
В связи с этим, представляло значительный интерес сравнить процессы деградации мРНК in vivo, в условиях блокады транскрипции актиномицином Д, и in vitro. Важно было выяснить, какие условия в процессе аффинной хроматографии способствуют деградации мРНК, а также изучить природу это явления на примере ряда специфических мРНК злаков.
Для решения этих задач мы провели исследование стабильности мРНК нескольких специфических мРНК созревающего зерна кукурузы линии Wisconsin 64А (W64A+/+) и ее высоколизинового спонтанного мутанта opaque-2 (W64Ao2/o2). Созревающее зерно кукурузы представляет собой хорошую модельную систему, поскольку здесь синтезируется в большом количестве ограниченный набор запасных белков - зеинов, биохимия и генетика которых хорошо изучена. Этому в значительной степени способствовали исследования действия мутации opaque-2, определяющей глобальное перераспределение синтеза белковых фракций в зерне кукурузы [Larkins et ah, 1982; Плотников и Букреева, 1985; Marks etal, 1985; Schmidt, 1993].
