Список сокращений 6
Введение 7
Обзор литературы 12
Механизмы длительного выживания микробактерий М. tuberculosis 13
Модели персистенции М. tuberculosis in vitro 15
Модель - «без перемешивания» 16
Модель - «с перемешиванием» 17
Модель- «стационарная фаза роста» 18
Пути получения энергии М. tuberculosis при персистенции in vitro
Экспрессия генов «dormancy» - регулона М. tuberculosis при персистенции in vitro
Экспрессия генов, не входящих в состав «dormancy» - регулона М. tuberculosis при персистенции in vitro
Экспрессия генов, кодирующих сигма - факторы М. tuberculosis при персистенции in vitro
Определение жизнеспособности М. tuberculosis 25
Особенности фенотипических методов определения жизнеспособности М. tuberculosis 30
Определение жизнеспособности М. tuberculosis посредством мониторинга уровня мРНК
Материалы и методы 32
Штаммы микробактерий и условия их культивирования (модели персистенции in vitro)
Состав сред, используемых для культивирования микробактерий 34
Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК) 34
Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК) 35
Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием реакции обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) 35
Применение внутреннего калибровочного стандарта для определения количества мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР реакциях 37
Подбор прайм еров для количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем 37
Условия проведения реакции обратной транскрипции 38
Условия проведения ПЦР реакции 39
Характеристика количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем 39
Детекция продуктов амплификации 40
Програмное обеспечение экспериментальной работы 40
Результаты и обсуждение 41
Исследование генов М. tuberculosis в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции 41
Разработка количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем для изучения экспрессии генов М. tuberculosis 42
Тестирование специфичности ПЦР и ОТ-ПЦР систем 42
Внутренние калибровочные стандарты (ВКС) 43
Определение чувствительности количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем 45
Определение чувствительности количественных ПЦР систем 45
Определение чувствительности количественных ОТ-ПЦР систем 47
Многопраймерная реакция обратной транскрипции 48
Использование ВКС для количественного определения исследуемой мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР системах 50
2.5.1. Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС) для количественных ПЦР систем
2.5.2. Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (РНК-ВКС) для количественных ОТ-ПЦР систем
2 5 Определение исходного количества числа копий ДНК (мРНК) мишени в препарате 52
2.7. Тестирование образцов на отсутствие деградации РНК 54
2.8. Выбор нормировочного маркера для сравнительного исследования количества специфических мРНК 54
Исследование генетических маркеров жизнеспособности М. Ш 55 berculosis на моделях in vitro
3. Подбор системы ген - индуктор, позволяющей увеличить количество специфических мРНК М tuberculosis в исследуемом образце в пересчете на количество геном - эквивалента 55
4. Исследование генов dnaK, sigH \\JbpB в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis 58
5. Исследование гена dnaK в качестве маркера жизнеспособности как показателя действия рифампицина и изониазида на референс -штаммы М. tuberculosis 66
Исследование генетических маркеров персистенции М. tuberculosis на моделях in vitro
6. Использование молекулярно - генетических маркеров для нормирования состояния клеточной популяции М. bovis BCG в условиях моделей персистенции in vitro 73
7. Исследование динамики изменения экспрессии генов М. bovis BCG на разных стадиях персистенции на моделях in vitro
Исследование корреляции между уровнем экспрессии генов sigF, dosR, acr, Rv2623 и уровнем толерантности перс патентной культуры М. bovis BCG к рифампиципу и метронидазолу 84
VI. Выводы 89
VII. Список литературы
По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) ежегодно в мире туберкулезом заболевают более 10 млн. человек и умирают около 3 млн. человек, при этом ежегодно в России от туберкулеза умирают 30 тысяч человек (Покровский В.В., 2003). По разным оценкам треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями туберкулеза и подвержена опасности развития острой формы этого заболевания (Wayne LG. et al, 2001). В этой связи актуальность изучения всех аспектов этой опасной инфекции очевидна.
Несмотря на проводимую в ряде стран массовую иммунизацию против туберкулеза, заболеваемость туберкулезом продолжает расти. Разрастающаяся эпидемия туберкулеза в мире обусловлена несколькими факторами:
- ненадежность протекции, обеспечиваемой вакцинацией BCG (bacillus Cal-mette Guerin) (Bloom В. R., 2002);
- демографические сдвиги;
- интенсивная миграция населения;
- распространение штаммов микобактсрий с лекарственной устойчивостью и множественной лекарственной устойчивостью (Бастиан И. и Порталь Ф., 2003);
- нарушение функций иммунной системы у людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (Покровский В.В., 2003);
- переход латентных форм туберкулеза в клинически манифестное заболевание (Voskuil M.I. et al., 2003).
Обращаясь к проблеме латентного туберкулеза, важно отметить, что латентное состояние туберкулезной инфекции обусловлено существованием М. tuberculosis в персистентном состоянии в организме человека или животного. Термином персистенция в литературе обозначают состояние М. tuberculosis in vivo, характеризующееся образованием морфологически и функционально измененных форм микобактерий, практически не чувствительных к противотуберкулезным препаратам и обладающих низким уровнем метаболической активности. В этом состоянии микобактерий не дают роста на твердых питательных средах. Показано, что при поглощении макрофагами, клетки микобактерий трансформируются в зернистые и L - формы, спороподобные (вегетативные) формы (Герасимов В.Н. и соавторы, 2003). В зарубежной литературе для обозначения видоизмененных форм микобак терий используют термин «dormant» (спящий), означающий нахождение микобак терий в метаболически неактивном нерепликативном состоянии (Wayne L.G. et al., 1998).
Для изучения феномена персистепции М. tuberculosis были разработаны модели персистепции in vitro, простые в исполнении и использовании, а таюке исключающие действие стресс - факторов, характерных для имунного ответа организма на присутствие микобактерий (Wayne L.G. et al., 2001). Одной из основных причин создания таких моделей in vitro являлось отсутствие методов, позволяющих исследовать генетические аспекты проблемы персистепции in vivo.
Персистенция микобактерий представляет собой серьезную проблему, так как персистентные Ы. tuberculosis способны к реактивации в активную форму, что может обеспечивать рецидивы инфекции. В связи с этим, существует необходимость в создании быстрых и надежных методов выявления латентных форм туберкулеза. Процесс создания диагностических реагентов для определения латентных форм туберкулеза долгий и многостадийный. В результате должен быть определен белковый продукт, обладающий высоким уровнем специфичности (в отношении персистентных форм микобактерий) и иммуногенности. Для этого в первую очередь необходимо определить адекватные генетические маркеры персистепции - гены М. tuberculosis. Представленные в данной работе исследования, проведенные на моделях in vitro являются первым шагом на пути к решению этой задачи.
Необходимо отметить, что к началу дайной работы о проблеме персистепции М. tuberculosis было опубликовано много работ, но основные исследования проводились с использованием микробиологических методов, а генетические механизмы, детерминирующие основные процессы перехода популяции микобактерий в состояние персистепции, были мало исследованы (Герасимов В.Н. и соавт., 2003; Дорожкова И.Р. и соавт., 1995; Прозоровский СВ. и соавт., 1985). Существовали лишь отрывочные данные, позволяющие предполагать, что изменение физиологического состояния микобактерий связано с изменением уровней экспрессии определенной группы специфических генов (Boon C.et al., 2001; Wayne L.G. et al., 2000). Задача быстрого определения жизнеспособности популяции М. tuberculosis поставлена в мировой науке давно и продолжает оставаться актуальной (Hellyer T.J., 1999). Определение жизнеспособности популяции микобактерий является основой для создания методов определения лекарственной устойчивости, а таюке методов, позволяющих в короткие сроки тестировать эффективность действия новых лекарственных препаратов с использованием референс - штаммов Ы. tuberculosis.
Консолидация новейших исследований в области генетики М. tuberculosis и многолетних наработок в области микробиологии возбудителя туберкулеза позволила составить представление о вариабельности функциональных состояний, характерных для клеточной популяции микобактерий. На сегодняшний день известно, что популяция микобактерий, находясь в физиологически и морфологически измененном состоянии (персистенция) отличается устойчивостью к разного рода стрессовым воздействиям, в том числе к действию аптимикобактериальиых препаратов. В данном случае устойчивость не обусловлена мутациями (Хоменко А.Г., 1996; Wayne L.G. et al., 2001). Для изучения этого феномена важно использовать лабораторные методы, позволяющие в короткие сроки определять жизнеспособность микобактериалыюй популяции in vitro, работающие независимо от механизма, детерминирующего устойчивость к лекарственному препарату. По критерию универсальности перспективными являются фенотипические методы, основанные на определении изменений метаболического статуса популяции микобактерий, где определение жизнеспособности М. tuberculosis, как показателя действия лекарственных препаратов можно проводить для всего спектра аитимикобактериальных препаратов и независимо от физиологического состояния, в котором находится популяция микобактерий. Одним из быстрых способов определения роста микобактерий в присутствие антибиотика является определение содержания рибонуклеиновых кислот в исследуемой культуре микобактерий (Jou N.T., 1997). Необходимо отметить, что данная методика требует наличия адекватного генетического маркера (гена) и быстрого способа регистрации количества данной мишени.
Существенным недостатком практического применения данного подхода является низкое содержание специфических мРНК в культуре микобактерий. В связи с этим цель данной работы состояла в исследовании индуцибельных генов в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis и подборе такой системы ген - индуктор, использование которой позволит увеличить исходное количество специфической мРНК в клетке и тем самым сделает детекцию лабильной мишени более точной.
