Содержание к диссертации
Список сокращений 6
Введение 7
Обзор литературы 12
Механизмы длительного выживания микробактерий М. tuberculosis 13
Модели персистенции М. tuberculosis in vitro 15
Модель - «без перемешивания» 16
Модель - «с перемешиванием» 17
Модель- «стационарная фаза роста» 18
Пути получения энергии М. tuberculosis при персистенции in vitro
Ркспрессия генов В«dormancyВ» - регулона Рњ. tuberculosis РїСЂРё персистенции in vitro
Ркспрессия генов, РЅРµ входящих РІ состав В«dormancyВ» - регулона Рњ. tuberculosis РїСЂРё персистенции in vitro
Ркспрессия генов, кодирующих СЃРёРіРјР° - факторы Рњ. tuberculosis РїСЂРё персистенции in vitro
Определение жизнеспособности М. tuberculosis 25
Особенности фенотипических методов определения жизнеспособности М. tuberculosis 30
Определение жизнеспособности М. tuberculosis посредством мониторинга уровня мРНК
Материалы и методы 32
Штаммы микробактерий и условия их культивирования (модели персистенции in vitro)
Состав сред, используемых для культивирования микробактерий 34
Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК) 34
Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК) 35
Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием реакции обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) 35
Применение внутреннего калибровочного стандарта для определения количества мишени в ПЦРи ОТ-ПЦРреакциях 37
Подбор прайм еров для количественных ПЦРи ОТ-ПЦРсистем 37
Условия проведения реакции обратной транскрипции 38
Условия проведения ПЦРреакции 39
Характеристика количественных ПЦРи ОТ-ПЦРсистем 39
Детекция продуктов амплификации 40
Програмное обеспечение экспериментальной работы 40
Результаты и обсуждение 41
Рсследование генов Рњ. tuberculosis РІ качестве маркеров жизнеспособности Рё персистенции 41
Разработка количественных ПЦРи ОТ-ПЦРсистем для изучения экспрессии генов М. tuberculosis 42
Тестирование специфичности ПЦРи ОТ-ПЦРсистем 42
Внутренние калибровочные стандарты (ВКС) 43
Определение чувствительности количественных ПЦРи ОТ-ПЦРсистем 45
Определение чувствительности количественных ПЦРсистем 45
Определение чувствительности количественных ОТ-ПЦРсистем 47
Многопраймерная реакция обратной транскрипции 48
Рспользование Р’РљРЎ для количественного определения исследуемой мишени РІ ПЦРи РћРў-ПЦРсистемах 50
2.5.1. Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС) для количественных ПЦРсистем
2.5.2. Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (РНК-ВКС) для количественных ОТ-ПЦРсистем
2 5 Определение исходного количества числа копий ДНК (мРНК) мишени в препарате 52
2.7. Тестирование образцов на отсутствие деградации РНК 54
2.8. Выбор нормировочного маркера для сравнительного исследования количества специфических мРНК 54
Рсследование генетических маркеров жизнеспособности Рњ. РЁ 55 berculosis РЅР° моделях in vitro
3. Подбор системы ген - индуктор, позволяющей увеличить количество специфических мРНК М tuberculosis в исследуемом образце в пересчете на количество геном - эквивалента 55
4. Рсследование генов dnaK, sigH \\JbpB РІ качестве маркеров жизнеспособности Рњ. tuberculosis 58
5. Рсследование гена dnaK РІ качестве маркера жизнеспособности как показателя действия рифампицина Рё изониазида РЅР° референс -штаммы Рњ. tuberculosis 66
Рсследование генетических маркеров персистенции Рњ. tuberculosis РЅР° моделях in vitro
6. Рспользование молекулярно - генетических маркеров для нормирования состояния клеточной популяции Рњ. bovis BCG РІ условиях моделей персистенции in vitro 73
7. Рсследование динамики изменения экспрессии генов Рњ. bovis BCG РЅР° разных стадиях персистенции РЅР° моделях in vitro
Рсследование корреляции между уровнем экспрессии генов sigF, dosR, acr, Rv2623 Рё уровнем толерантности перс патентной культуры Рњ. bovis BCG Рє рифампиципу Рё метронидазолу 84
VI. Выводы 89
VII. РЎРїРёСЃРѕРє литературы В
Введение к работе
По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) ежегодно в мире туберкулезом заболевают более 10 млн. человек и умирают около 3 млн. человек, при этом ежегодно в России от туберкулеза умирают 30 тысяч человек (Покровский В.В., 2003). По разным оценкам треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями туберкулеза и подвержена опасности развития острой формы этого заболевания (Wayne LG. et al, 2001). В этой связи актуальность изучения всех аспектов этой опасной инфекции очевидна.
Несмотря на проводимую в ряде стран массовую иммунизацию против туберкулеза, заболеваемость туберкулезом продолжает расти. Разрастающаяся эпидемия туберкулеза в мире обусловлена несколькими факторами:
- ненадежность протекции, обеспечиваемой вакцинацией BCG (bacillus Cal-mette Guerin) (Bloom В. R., 2002);
- демографические сдвиги;
- интенсивная миграция населения;
- распространение штаммов микобактсрий СЃ лекарственной устойчивостью Рё множественной лекарственной устойчивостью (Бастиан Р. Рё Порталь Р¤., 2003);
- нарушение функций иммунной системы у людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (Покровский В.В., 2003);
- переход латентных форм туберкулеза в клинически манифестное заболевание (Voskuil M.I. et al., 2003).
Обращаясь к проблеме латентного туберкулеза, важно отметить, что латентное состояние туберкулезной инфекции обусловлено существованием М. tuberculosis в персистентном состоянии в организме человека или животного. Термином персистенция в литературе обозначают состояние М. tuberculosis in vivo, характеризующееся образованием морфологически и функционально измененных форм микобактерий, практически не чувствительных к противотуберкулезным препаратам и обладающих низким уровнем метаболической активности. В этом состоянии микобактерий не дают роста на твердых питательных средах. Показано, что при поглощении макрофагами, клетки микобактерий трансформируются в зернистые и L - формы, спороподобные (вегетативные) формы (Герасимов В.Н. и соавторы, 2003). В зарубежной литературе для обозначения видоизмененных форм микобак терий используют термин «dormant» (спящий), означающий нахождение микобак терий в метаболически неактивном нерепликативном состоянии (Wayne L.G. et al., 1998).
Для изучения феномена персистепции М. tuberculosis были разработаны модели персистепции in vitro, простые в исполнении и использовании, а таюке исключающие действие стресс - факторов, характерных для имунного ответа организма на присутствие микобактерий (Wayne L.G. et al., 2001). Одной из основных причин создания таких моделей in vitro являлось отсутствие методов, позволяющих исследовать генетические аспекты проблемы персистепции in vivo.
Персистенция микобактерий представляет собой серьезную проблему, так как персистентные Ы. tuberculosis способны к реактивации в активную форму, что может обеспечивать рецидивы инфекции. В связи с этим, существует необходимость в создании быстрых и надежных методов выявления латентных форм туберкулеза. Процесс создания диагностических реагентов для определения латентных форм туберкулеза долгий и многостадийный. В результате должен быть определен белковый продукт, обладающий высоким уровнем специфичности (в отношении персистентных форм микобактерий) и иммуногенности. Для этого в первую очередь необходимо определить адекватные генетические маркеры персистепции - гены М. tuberculosis. Представленные в данной работе исследования, проведенные на моделях in vitro являются первым шагом на пути к решению этой задачи.
Необходимо отметить, что Рє началу дайной работы Рѕ проблеме персистепции Рњ. tuberculosis было опубликовано РјРЅРѕРіРѕ работ, РЅРѕ основные исследования проводились СЃ использованием микробиологических методов, Р° генетические механизмы, детерминирующие основные процессы перехода популяции микобактерий РІ состояние персистепции, были мало исследованы (Герасимов Р’.Рќ. Рё соавт., 2003; Дорожкова Р.Р . Рё соавт., 1995; РџСЂРѕР·РѕСЂРѕРІСЃРєРёР№ РЎР’. Рё соавт., 1985). Существовали лишь отрывочные данные, позволяющие предполагать, что изменение физиологического состояния микобактерий связано СЃ изменением уровней экспрессии определенной РіСЂСѓРїРїС‹ специфических генов (Boon C.et al., 2001; Wayne L.G. et al., 2000). Задача быстрого определения жизнеспособности популяции Рњ. tuberculosis поставлена РІ РјРёСЂРѕРІРѕР№ науке давно Рё продолжает оставаться актуальной (Hellyer T.J., 1999). Определение жизнеспособности популяции микобактерий является РѕСЃРЅРѕРІРѕР№ для создания методов определения лекарственной устойчивости, Р° таюке методов, позволяющих РІ короткие СЃСЂРѕРєРё тестировать эффективность действия новых лекарственных препаратов СЃ использованием референс - штаммов Р«. tuberculosis.
Консолидация новейших исследований в области генетики М. tuberculosis и многолетних наработок в области микробиологии возбудителя туберкулеза позволила составить представление о вариабельности функциональных состояний, характерных для клеточной популяции микобактерий. На сегодняшний день известно, что популяция микобактерий, находясь в физиологически и морфологически измененном состоянии (персистенция) отличается устойчивостью к разного рода стрессовым воздействиям, в том числе к действию аптимикобактериальиых препаратов. В данном случае устойчивость не обусловлена мутациями (Хоменко А.Г., 1996; Wayne L.G. et al., 2001). Для изучения этого феномена важно использовать лабораторные методы, позволяющие в короткие сроки определять жизнеспособность микобактериалыюй популяции in vitro, работающие независимо от механизма, детерминирующего устойчивость к лекарственному препарату. По критерию универсальности перспективными являются фенотипические методы, основанные на определении изменений метаболического статуса популяции микобактерий, где определение жизнеспособности М. tuberculosis, как показателя действия лекарственных препаратов можно проводить для всего спектра аитимикобактериальных препаратов и независимо от физиологического состояния, в котором находится популяция микобактерий. Одним из быстрых способов определения роста микобактерий в присутствие антибиотика является определение содержания рибонуклеиновых кислот в исследуемой культуре микобактерий (Jou N.T., 1997). Необходимо отметить, что данная методика требует наличия адекватного генетического маркера (гена) и быстрого способа регистрации количества данной мишени.
Существенным недостатком практического применения данного РїРѕРґС…РѕРґР° является РЅРёР·РєРѕРµ содержание специфических РјР РќРљ РІ культуре микобактерий. Р’ СЃРІСЏР·Рё СЃ этим цель данной работы состояла РІ исследовании индуцибельных генов РІ качестве маркеров жизнеспособности Рњ. tuberculosis Рё РїРѕРґР±РѕСЂРµ такой системы ген - индуктор, использование которой позволит увеличить РёСЃС…РѕРґРЅРѕРµ количество специфической РјР РќРљ РІ клетке Рё тем самым сделает детекцию лабильной мишени более точной. В