Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Краткие сведения о возбудителе туберкулеза. Лекарственная устойчивость и ее генетические основы 11
1.2. Эпидемиология туберкулеза и распространенность лекарственной устойчивости в мире и Российской Федерации 15
1.3. Полиморфизмы в геноме M. tuberculosis, их применение в филогенетических и эпидемиологических исследованиях туберкулеза 19
1.3.1. Общие сведения о полиморфизмах в геноме M. tuberculosis 19
1.3.2. Полиморфизмы в повторяющихся последовательностях и методы молекулярной эпидемиологии 22
1.3.3. Полиморфизмы, имеющие филогенетическое значение, и методы их анализа 26
1.3.4. Факторы вирулентности микобактерий и их генетические основы 28
1.3.5. Филогенетическая и филогеографическая классификация микобактерий туберкулезного комплекса 32
1.4. Распространенность генетической группы Beijing в мире и Российской Федерации и ее ассоциации с лекарственной устойчивостью 34
2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Объект исследования 41
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Бактериологические методы 43
2.2.2. Выделение ДНК из изолятов M. tuberculosis 44
2.2.3. Молекулярно-генетические методы 45
2.2.3.1. Типирование по спейсерным олигонуклеотидам (сполиготипирование) 45
2.2.3.2. Типирование по локусам VNTR 46
2.2.3.3. Анализ полиморфизмов в генах plcA, plcB, plcC и lipR 51
2.2.3.4. Анализ полиморфизмов в генах pks15/1 и dosT 53
2.2.4. Статистический анализ данных 55
3. Результаты и обсуждение 56
3.1. Распространенность генетических групп m. tuberculosis по районам самарской области 56
3.1.1. Общие данные по генетическим группам и кластеризации штаммов 56
3.1.2. Распространенность генетических групп в Самарской области 65
3.1.3. Кластеризация штаммов в районах Самарской области 66
3.1.4. Кластеризация штаммов, выделенных от впервые выявленных больных и пациентов, получавших лечение в прошлом 71
3.2. Генетические характеристики лекарственно-устойчивых и чувствительных штаммов m. tuberculosis в Самарской области 74
3.2.1. Распространенность лекарственной устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам в Самарской области 74
3.2.2. Распространенность лекарственной устойчивости среди различных генетических групп M. tuberculosis в Самарской области 77
3.2.3. Неоднородность генетических групп и ассоциированность отдельных кластеров с лекарственной устойчивостью 89
3.3. Генетический полиморфизм генов, ассоциированных с вирулентностью, среди штаммов m. tuberculosis в Самарской области 101
3.3.1. Ассоциированность полиморфизмов генов plcA, plcB, plcC, lipR, dosT и pks15/1 с генетическими группами M. tuberculosis 102
3.3.2. Ассоциированность полиморфизмов генов plcA, plcB, plcC, lipR, dosT и pks15/1 с кластерами M. tuberculosis 110
3.3.3. Ассоциированность полиморфизмов генов plcA, plcB, plcC, lipR, dosT и pks15/1 с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам 117
Заключение 123
Выводы 129
Список использованной литературы 131
- Полиморфизмы в геноме M. tuberculosis, их применение в филогенетических и эпидемиологических исследованиях туберкулеза
- Филогенетическая и филогеографическая классификация микобактерий туберкулезного комплекса
- Распространенность генетических групп m. tuberculosis по районам самарской области
- Ассоциированность полиморфизмов генов plcA, plcB, plcC, lipR, dosT и pks15/1 с генетическими группами M. tuberculosis
Введение к работе
Актуальность работы. Туберкулез (ТБ) остается важной проблемой здравоохранения во всем мире и Российской Федерации в частности. Самарская область относится к регионам России с неблагоприятной обстановкой по туберкулезу, где уровень заболеваемости в 2011 году (78,5 случаев на 100 тыс. населения) превышал средний показатель по стране (73,0 случая на 100 тыс. населения) (Аналитический обзор МЗ РФ, 2011). Около 20% всех впервые выявленных заболевших и 60% получавших лечение в прошлом пациентов в Самарской области инфицированы штаммами микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью (Balabanova et al., 2006). Серьезной проблемой является также рост заболеваемости ТБ с обширной лекарственной устойчивостью, вызванным микобактериями, дополнительно устойчивыми к фторхинолонам и инъекционным препаратам, особенно в сочетании с ВИЧ-инфекцией (Balabanova et al., 2011). Преобладающей генетической группой штаммов, циркулирующей в Самарской области, является группа Beijing (Балабанова, 2006). Она характеризуется высокой степенью внутригрупповой гомогенности, а также повышенной вирулентностью, патогенностью и ассоциированностью с лекарственной устойчивостью (Степаншина, 2007; Дымова, 2008; Baranov et al., 2009; Nodieva et al., 2010; Маничева, 2011; Лац, 2012; Дымова, 2013).
Генетические факторы играют ключевую роль в формировании важных в
клинико-эпидемиологическом отношении свойств патогена, включая
лекарственную устойчивость, вирулентность и повышенную способность к трансмиссии. Изучение особенностей генетики возбудителя туберкулеза, включая его принадлежность к той или иной генетической группе и закономерности формирования лекарственной устойчивости и повышенной вирулентности, является необходимым звеном в комплексе мер борьбы с туберкулезом и его трансмиссией и разработки новых методов его диагностики, лечения и профилактики.
К настоящему времени имеются лишь единичные данные по популяционно-генетической структуре штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих в Самарской области, распространенности различных генетических групп и их ассоциированности с лекарственной устойчивостью и вирулентностью.
Цель работы: выявление генетической структуры популяции и закономерностей циркуляции и распространения основных генетических групп M. tuberculosis в Самарской области, а также их ассоциаций с вирулентностью и устойчивостью к противотуберкулезным препаратам.
Задачи исследования:
-
С помощью методов молекулярного генотипирования определить основные генетические группы и кластеры штаммов M. tuberculosis, циркулирующие в Самарской области.
-
Выявить закономерности распространения генетических групп и кластеров штаммов M. tuberculosis в районах Самарской области и медицинских учреждениях, где пациенты проходят лечение от ТБ.
-
Выявить закономерности трансмиссии штаммов M. tuberculosis, устойчивых к противотуберкулезным препаратам, включая штаммы с множественной и обширной лекарственной устойчивостью и установить их ассоциированность с генетическими группами и кластерами M. tuberculosis.
-
Провести анализ полиморфизмов в генах M. tuberculosis, ассоциированных с вирулентностью: генов фосфолипазы С (plcA, plcB, plcC), липазы (lipR), поликетидсинтазы (pks15/1) и сенсорной гистидинкиназы (dosT), выявить закономерности их связи с генетическими группами и кластерами M. tuberculosis, а также чувствительностью к противотуберкулезным препаратам.
Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено масштабное исследование популяционно-генетической структуры штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в Самарской области. Продемонстрировано преобладание штаммов генетической группы Beijing и штаммов Евро-Американской линии, а также появление штаммов генетических групп EAI и Delhi/CAS, ранее не
зарегистрированных в регионе. Показана неравномерность распространенности
кластера Samara4 и ряда мелких кластеров группы Beijing по медицинским
учреждениям, а также ассоциации между проживанием в крупных городах и
риском заражения штаммами Beijing, а в сельской местности – со штаммами
других групп. Выявлены ассоциации лекарственной устойчивости к
противотуберкулезным препаратам с генетической группой Beijing и рядом
наиболее крупных ее кластеров, в частности Samara4, Samara24 и Samara16.
Обнаружены ассоциации между полиморфизмами в гене plcA и генетической
группой LAM (кластерами Samara227 и Samara228), в генах dosT и pks15/1 и
всей группой Beijing, а также в гене lipR с большинством кластеров групп
Ghana, Cameroon, Uganda и S. Установлены ассоциации между
полиморфизмами в генах dosT и pks15/1 и лекарственной устойчивостью, а также в генах plcA и lipR и лекарственной чувствительностью.
Научно-практическая значимость. На основании материалов
диссертации нами внесены предложения по совершенствованию методов лабораторной диагностики туберкулеза, которые могут быть использованы в работе ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер имени Н.В. Постникова» и иных противотуберкулезных учреждений. В целом результаты работы по выявлению ряда генетических групп, закономерностей их циркуляции и ассоциированности с лекарственной устойчивостью могут быть использованы в качестве основы для оптимизации методов диагностики, профилактики и лечения пациентов Самарской области и других регионов Российской Федерации, включающей в себя своевременную коррекцию схем химиотерапии, совершенствование инфекционного контроля для борьбы с трансмиссией наиболее вирулентных штаммов микобактерий, а также разработку долговременной стратегии по борьбе с туберкулезом.
Сведения о распространенности определенных генетических групп и их ассоциированности с лекарственной устойчивостью могут быть использованы для разработки и апробации новых методов лабораторной диагностики туберкулеза фирмами-изготовителями диагностикумов. Полученные нами теоретические данные об ассоциированности различных типов полиморфизмов в геноме M. tuberculosis могут послужить основой дальнейших исследований,
направленных на изучение эволюции и популяционной генетики бактерий комплекса M. tuberculosis.
Результаты работы могут быть использованы при чтении спецкурсов на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на II Всероссийской научной конференции с международным участием «Научное творчество XXI века» (Красноярск, 2010); Международной научно-практической конференции “Теоретические и прикладные проблемы науки и образования” (Курск, 2010); семинаре Joint NIAID-ISTC Workshop ‘Research Opportunities in TB Drug Discovery and Diagnosis‘ (Москва, 2010); 21-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям ECCMID 2011 (Милан, Италия, 2011); 32-м ежегодном конгрессе Европейского сообщества микобактериологов ESM 2011 (Любек, Германия, 2011); Международной научно-практической конференции “Физиологические механизмы адаптации живых систем” (Сухум, 2011); II Международной научно-практической конференции «Социальные и медико-биологические вопросы адаптации» (Курск, 2011); Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курск, 2012); 17-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций, и 5 статей в зарубежных журналах, включенных в международные системы цитирования Pubmed, Scopus и др.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 161 листе, содержит 14 рисунков и 38 таблиц. Список литературы включает 247 источников, из которых 174 – зарубежных.
Полиморфизмы в геноме M. tuberculosis, их применение в филогенетических и эпидемиологических исследованиях туберкулеза
Своеобразие культуральных, биохимических и иных фенотипических свойств возбудителя туберкулеза, а также развитие устойчивости к антибактериальным препаратам, определяется особенностями генотипа микобактерий, к которым, в частности, относятся довольно большой размер генома (более 4 миллионов пар нуклеотидов), а также выраженный дисбаланс типов нуклеотидов в пользу гуанина и цитозина (Cole et al., 1998б). К настоящему времени установлены основные генетические механизмы развития лекарственной устойчивости, а также определены подходы к изучению генетических основ вирулентности, патогенности и особенностей трансмиссии M. tuberculosis. Существенный прогресс в указанной области был достигнут за последние 25 лет, главным образом с использованием методов генотипирования, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Генотипирование микроорганизмов (в широком смысле) основано на выявлении индивидуальных и групповых различий между нуклеотидными последовательностями исследуемых штаммов. До начала 1990-х г.г. геном M. tuberculosis считался полностью стабильным и практически не имеющим полиморфизмов, при этом для определения различий между клиническими изолятами M. tuberculosis использовались методы, основанные на изучении морфологии колоний, сравнительных уровней роста, чувствительности к определенным антибиотикам и типирова-нии фагов. Однако они не обладали достаточной чувствительностью, что существенно ограничивало возможности изучения эпидемиологии ТБ. Лишь в середине 1980-х г.г. для определения различий между клиническими изолятами впервые были использованы молекулярные методы. К концу 2013 года полностью секвениро-ваны de novo геномы штаммов комплекса M. tuberculosis, представляющих основные филогенетические группы комплекса (M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG Pasteur, M. canetti, M. leprae, M. tuberculosis H37Rv и M. marinum) (Cole et al., 1998а; Cole et al., 2001; Garnier et al., 2003; Brosch et al., 2007; Stinear et al., 2008; Bentley et al., 2012). Микобактерии туберкулезного комплекса представляют собой пример крайней внутривидовой генетической гомогенности со степенью синонимичных нук-леотидных полиморфизмов, оцененной в 0,01-0,03% (Cole et al., 1998б; Fleischmann et al., 2002), и отсутствием горизонтального переноса генов, в отличие от большинства бактериальных патогенов (Gutacker et al., 2002; Supply et al., 2003). Скорее всего, это свидетельствует об относительно недавнем обособлении данного комплекса микобактерий от общего предка (Gutierrez et al., 2006).
Тем не менее, с использованием высокочувствительных методов к середине 90-х г.г. было показано, что эти мономорфные виды имеют полиморфные участки генома (Mathema et al., 2006), которые можно подразделить на 3 основные группы, включающие в себя однонуклеотидные замены, полиморфизмы длинных последовательностей и полиморфизмы в повторяющихся последовательностях (Рисунок 4).
Последние подразделяются на рассеянные повторы (прямые (например, DR-регион) и вставочные (например, IS-элемент) повторы) и тандемные повторы (прямые непрерывные повторы, расположенные по принципу “голова-хвост”). По размеру повторяющегося элемента эти полиморфизмы подразделяются на микросателлиты и минисателлиты (повторы с длинами повторяющихся последовательностей 1-10 и 10-100 п.н. соответственно) (Рисунок 5).
Современные методы молекулярно-эпидемиологического типирования ми-кобактерий основаны, как правило, на выявлении и сравнительной характеристике относительно быстро эволюционирующих полиморфизмов в повторяющихся последовательностях генома микобактерий (Шемякин, 2000; Николаевский, 2004). Выбор этих методов обусловлен, главным образом, их высокой разрешающей споaсобностью (чувствительностью), которая позволяет охарактеризовать штаммы и выявить различия и сходства между ними даже при полном отсутствии эпидемиологической информации. С методологической точки зрения их можно разделить на методы, в которых не используется амплификация участков генов, и методы, основанные на использовании ПЦР. Первая группа методов включает в себя, прежде всего, типирование по наличию так называемых инсерционных последовательностей (IS, англ. – insertion sequences), т.е. мобильных генетических элементов длиной до 2500 п.н., широко распространенных в большинстве бактериальных геномов. К таким методам относятся определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов в IS6110 и генотипирование полиморфных ГЦ-богатых повторяющихся последовательностей (PGRS, англ. – polymorphic GC-rich repetitive sequences).
В настоящее время чаще используются методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот. К ним относятся сполиготипирование, VNTR-типирование, анализ геномных делеций, однонуклеотидных замен и полиморфизмов длинных последовательностей.
Сполиготипирование основано на выявлении наличия и порядка расположения спейсеров, разделяющих прямые повторы в специфическом локусе генома M. tuberculosis (DR-локус, англ. – direct repeats) длиной 4392 п.н. (позиции 31190185-3123576). У микобактерий было выявлено 43 типа спейсеров, из которых 37 являются характерными для M. tuberculosis, а еще 6 дополнительно характеризуют штамм M. bovis BCG. В результате гибридизации меченых биотином ПЦР-продуктов с 43 синтетическими олигонуклеотидными пробами, ковалентно связанными с нейлоновой мембраной, получается паттерн, который можно детектировать путем хемилюминесценции. Для этого мембрана со связанными ПЦР-продуктами вначале обрабатывается стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена, а затем жидкостью для хемилюминесценции. Возникающая при этом флюоресценция детектируется путем экспозиции высокочувствительной рентгеновской пленки с мембраной, при этом на пленке создаются отпечатки – паттерны сполиготипиро-вания (Kamerbeek et al., 1997). Результаты метода сполиготипирования хорошо воспроизводимы, они могут быть легко интерпретированы и компьютеризированы.
Сполиготипирование, несмотря на его относительно низкую разрешающую способность, хорошо подходит для первоначального анализа популяционной структуры M. tuberculosis и определения основных генетических групп (семейств); для проспективных молекулярно-генетических исследований оно применимо лишь в сочетании с другими методами.
Важным преимуществом метода сполиготипирования является то, что он гораздо менее требователен к количеству и чистоте исследуемой ДНК. Кроме того, сполиготипирование различает штаммы с низким числом копий IS6110. Однако в целом разрешающая способность сполиготипирования меньше, чем у IS6110 RFLP-типирования, что можно объяснить тем, что оно направлено на единственный ло-кус, занимающий менее 0,1% генома M. tuberculosis, тогда как IS6110 RFLP-анализ охватывает распределение IS6110-элемента на протяжении всего генома.
Цифровой формат данных сполиготипирования позволил впервые класси фицировать генотипы микобактерий по группам (Beijing, Haarlem, S, EAI и т.д.) и разработать всемирную постоянно обновляемую компьютерную базу сполиготи пов. Самая новая ее четвертая версия (SpolDB4) содержит несколько тысяч различ ных сполиготипов, выделенных от пациентов, родившихся в 141 стране мира (Brudey et al., 2006). Для работы с SpolDB4 была разработана web-программа для определения семейства сполиготипов (http://cgi2.cs.rpi.edu/ bennek/SPOTCLUST.html). С выходом базы данных SpolDB4 была проведена оценка распределения групп (семейств) вида M. tuberculosis в различных регионах мира, в ходе которой и получены уникальные данные о происхождении представителей микобактериаль-ного комплекса и ассоциированности отдельных семейств микобактерий с человеческими популяциями.
Филогенетическая и филогеографическая классификация микобактерий туберкулезного комплекса
В последние годы были разработаны и получают все большее распространение методы полного геномного секвенирования нового поколения (Whole Genome Sequencing или Next Generation Sequencing), основанные, главным образом, на создании библиотек фрагментов размерами 50-100 п.н. с последующей многократной их гибридизацией с олигонуклеотидными пробами, иммобилизованными на пластиковых или иных носителях, позволяющей добиться существенного повышения точности и воспроизводимости результатов (например, технологии фирмы «Illumina»). В самое последнее время стоимость секвенирования одного штамма составила около 200 долларов США, что позволило к 2013 году проанализировать геномы сотен штаммов микобактерий, принадлежащих к различным генетическим группам (Casali et al., 2012; Casali et al., 2014). Внедрение подобных технологий позволяет перейти от целевого подхода (выявления полиморфизмов в отдельных генах) к геномному, т.е. широкомасштабному сравнению изучаемых штаммов по всем имеющимся полиморфизмам, что позволит получить более точные сведения о генетических механизмах вирулентности, развития лекарственной устойчивости, эпидемиологических и филогенетических особенностях штаммов и взаимосвязи различных генетических маркеров между собой. При этом, однако, следует иметь в виду, что полиморфизмы в повторяющихся последовательностях (VNTR) в настоящее время не могут быть надежно выявлены методами полного геномного секвенирования, и для изучения таковых необходимо использовать традиционные ПЦР-методы.
На основании результатов молекулярно-генетического анализа, выполненного с использованием методов анализа повторяющихся последовательностей, LSP и SNP, а также полного геномного секвенирования, к настоящему времени разработана филогенетическая классификация штаммов комплекса M. tuberculosis, включающая в себя 6 основных линий: Индо-Океанскую (EAI), Восточно-Азиатскую (Beijing), Индо-Восточно-Африканскую (CAS), Евро-Американскую (Haarlem, LAM, S, Uganda, Ghana, Cameroon, URAL и X), Западно-Африканские 1 и 2 (M. africanum). Основным преимуществом этой классификации является то, что она рассматривает эволюцию комплекса M.tuberculosis в тесной связи с историей человечества и историческими путями миграции человечества (Gagneux et al., 2006; Reed et al., 2009). Согласно этой классификации, наиболее древними линиями являются Западно-Африканские, более эволюционно молодыми – Восточно-Азиатские и Евро-Американские, тесно связанные с Юго-Восточной Азией и Европой, соответственно. 1.4. Распространенность генетической группы Beijing в мире первые генотип Beijing был описан в 1995 г. van Soolingen и соавт. при анализе штаммов, полученных в Китае и Монголии (van Soolingen et al., 1995). Дальнейшее изучение этой группы штаммов показало, что она гораздо чаще встречается в Восточной Азии, нежели в других регионах. Предполагается, что штаммы данной группы обособились в районе г. Пекина и далее распространились в другие регионы, дав эволюционную линию под названием Beijing.
Мокроусов предположил, что генотип Beijing появился в Северном и Центральном Китае около 2000 лет назад, а его появление в других регионах мира связано с перемещением человека: в Средние века генотип Beijing появился в России, в XVII веке – в Южной Африке, а в XIX веке – в Австралии (Mokrousov, 2008а; Dabernat et al., 2014). Согласно другой гипотезе, распространение штаммов Beijing по территории России и других стран бывшего СССР в XX веке носило «взрывной» характер, первоначально распространившись среди русских строителей Китайско-Восточной железной дороги, а затем в лагерях ГУЛАГа и гражданском обществе СССР (Синьков, 2011).
Из Восточной Азии генотип Beijing распространился на большую часть Центральной, Западной и Северной Азии, причем распространение происходит довольно быстро. Так, в одном исследовании показано, как группа штаммов Beijing, занесенное в район Западно-Капской провинции в Южной Африке примерно 400 лет назад (van Helden et al., 2002), составляет уже около 30% всех циркулирующих в этом районе штаммов (Bifani et al., 1996). Согласно данным различных авторов, распространенность штаммов группы Beijing возрастает в странах мира, чрезвычайно удаленных друг от друга: Малави, Кубе, странах бывшего СССР и некоторых частях Западной Европы (Glynn et al., 2002; Glynn et al., 2005). Кроме того, за последние два десятилетия штаммы группы Beijing вызвали множество крупных вспышек ТБ, в том числе лекарственно-устойчивого, в различных регионах мира (Frieden et al., 1996; Agerton et al., 1999; Caminero et al., 2001; Bifani et al., 2002; Narvskaya et al., 2002; Johnson et al., 2006; Affolabi et al., 2009). Существуют различные гипотезы, объясняющие успех в распространении генотипа Beijing, связанные как с особыми свойствами самого генотипа, так и с внешними факторами, а именно естественным отбором, движимым различными причинами. Одна из гипотез называет такой причиной массовую вакцинацию БЦЖ, обладающей меньшими защитными свойствами против штаммов Beijing, чем против других штаммов. Другой возможной причиной считается противотуберкулезная терапия, к которой штаммы Beijing могут быть менее восприимчивыми, нежели другие (van Soolingen et al., 2001). Однако необходимо отметить, что широкое применение вакцины БЦЖ и противотуберкулезной терапии началось лишь в прошлом веке, тогда как распространение Beijing наблюдалось задолго до этого (Wirth et al., 2008). Данный факт позволяет предположить, что штаммы Beijing обладают особыми генетическими и фенотипическими свойствами, обуславливающими их преимущества над другими штаммами M. tuberculosis в плане вирулентности (например, передачи, перехода латентного заболевания в активное, приобретение лекарственной устойчивости) (de Jong et al., 2008).
Распространенность генетических групп m. tuberculosis по районам самарской области
Анализ исследуемых изолятов M. tuberculosis методами сполиготипирования и многолокусного VNTR-типирования с использованием референтной базы MIRU-VNTRplus позволил установить, что около всех штаммов (71,6%, 934 из 1304), циркулировавших в Самарской области в 2008-2009 г.г., составляли штаммы генетической группы Beijing (Tаблица 7, рисунок 9), при этом доля штаммов семейств, принадлежащих к Евро-Американской линии (в которую входят группы Haarlem, LAM, S, Uganda, Ghana, Cameroon, URAL и X), составила 23,2% (303 из 1304). Наибольшее количество штаммов Евро-Американской линии, обнаруженных в Самарской области, относилось к группам LAM (8,9%, 116 из 1304) и URAL (7,5%, 98 из 1304). Штаммы остальных генетических групп встречались значительно реже (0,3-5,7%). На группы EAI и Delhi/CAS в исследуемой выборке приходилось лишь по одному штамму. Семь штаммов (0,5%) не были определены до генетической группы использованными в исследовании методами.
Больные легочным туберкулезом, от которых были получены штаммы микобакте-рий, используемые в нашем исследовании, проходили стационарное лечение в девяти специализированных больницах и диспансерах, расположенных в городах Самара (Самарский областной противотуберкулезный диспансер (СОПТД) и Самарская областная туберкулезная больница (СОТБ)), Тольятти (Тольяттинский противотуберкулезный диспансер), Сызрань (Сызранский противотуберкулезный диспансер), Новокуйбышевск (Новокуйбышевский противотуберкулезный диспансер), Чапаевск (Чапаевский противотуберкулезный диспансер), Отрадный (Отрадненский противотуберкулезный диспансер), Кинель (Кинельский противотуберкулезный диспансер) и Похвистнево (Похвист-невский противотуберкулезный диспансер). Наибольшее количество больных находилось на излечении в СОПТД и СОТБ (384 и 459 соответственно), наименьшее – в Кине-ле (11 больных).
Больные туберкулезом в нашем исследовании проживали в 9 городах и 22 районах Самарской области. Не имели определенного места жительства на момент исследования 59 пациентов (Таблица 8).
С целью выявления особенностей эпидемиологии штаммов микобактерий, циркулирующих в Самарской области, на основании результатов многолокусного VNTR-типирования нами был проведен кластерный анализ штаммов с использованием программы Bionumerics, при этом штаммы генетической группы Beijing и остальные (не 59
Beijing) штаммы анализировались раздельно. Общее количество проанализированных штаммов составило 1304. У 50 штаммов (из них 33 штамма группы Beijing и 17 штаммов других групп) профиль VNTR не определился полностью даже после двух последовательных повторов анализа VNTR-MIRU. Таким образом, кластерный анализ был проведен на материале 1254 штаммов.
Разрешающая способность и вариабельность отдельных VNTR локусов, используемых при генотипировании, оказалась неодинаковой (таблицы 9 и 10). Для штаммов группы Beijing наибольшее количество аллельных вариантов было зарегистрировано для локусов VNTR 1982 (11 аллельных вариантов) и VNTR 3232 (15 аллельных вариантов), наименьшее – для локусов MIRU 23 (4 аллельных варианта) и MIRU 31 (5 аллель-ных варианта). Разрешающая способность (выраженная индексом Хантера-Гастона) была наибольшей для локусов VNTR 4052 (0,678) и VNTR 3232 (0,658). Наименьшая разрешающая способность отмечена у локуса MIRU 23 (0,013) (Таблица 9).
Для штаммов, не относящихся к группе Beijing, вариабельность и разрешающая способность локусов VNTR, была несколько иной. Наибольшее количество аллельных вариантов зарегистрировано для локусов VNTR 3232 (17 вариантов), VNTR 1982 и MIRU 10 (по 12 аллельных вариантов). Наибольшая разрешающая способность была продемонстрирована локусами VNTR 3232 (0,855) и VNTR 1982 (0,813), наименьшая – MIRU 24 (0,005), ETR-B (0,052) и MIRU 20 (0,074) (Таблица 10).При проведении кластерного анализа уровень кластеризации для группы определялся как отношение количества штаммов, входящих в состав кластеров, к общему количеству штаммов в выборке. Штаммы, не входящие ни в один кластер, считались уникальными. Общее количество кластеров, определенных методом многолокусного типи-рования, в исследуемой популяции M. tuberculosis составило 178, при этом среди штаммов группы Beijing их было 101, среди остальных штаммов – 77. Общий уровень кластеризации составил 81,6% (1024 из 1254). Уровни кластеризации среди двух групп были достоверно различны: в группе Beijing – 87,7% (790 из 901), а среди остальных групп штаммов - 66,3% (234 из 353) (RR=1,323, 95% CI=1,22-1,43).
Некластеризованных (уникальных) штаммов значительно больше было обнаружено в группе штаммов, не относящихся к Beijing. Их количество составило 119 (33,7% от общего количества штаммов в группе), в то время как среди штаммов Beijing было обнаружено 111 некластеризованных штаммов, или 12,3%.
Для анализа распределения кластеров и уникальных профилей VNTR группы штаммы Beijing и штаммы остальных генетических групп рассматривались отдельно. В каждой группе выбирались 5 крупнейших кластеров (содержащих наибольшее количество штаммов), остальные кластеризованные штаммы включались в единую группу (Таблицы 11 и 12). Уникальные штаммы и штаммы с неполным профилем составляли еще две анализируемые группы.
Ассоциированность полиморфизмов генов plcA, plcB, plcC, lipR, dosT и pks15/1 с генетическими группами M. tuberculosis
Распространенность полиморфизмов среди различных генетических групп характеризовалась выраженной неоднородностью. Статистически значимые различия были обнаружены для полиморфизмов в генах plcA, dosT, pks15/1 и lipR (р 0,001), в то время как существенных различий в распространенности полиморфизмов в генах plcB и plcC обнаружено не было.
Различия в распространенности полиморфизмов в генах dosT и pks15/1 в Самарской популяции объяснялись главным образом их выраженной ассоциированностью со штаммами генетической группы Beijing (RR=7,070, 95% CI=5,35-9,34 и RR=7,784, 95%CI=5,79-10,46). Так, среди штаммов указанной группывставки в гене pks15/1 и точечные мутации в гене dosT были обнаружены у 910 и 927 штаммов (98,4% и 99,4% от общего количества штаммов Beijing соответственно), в то время как среди всех остальных групп эти признаки наблюдались лишь у 12,6% и 14,1% штаммов (Таблицы 30 и 31).
Мутации в гене plcA наблюдались главным образом среди штаммов, принадлежащих к генетической группе LAM (n=30, 35,7%), в то время как они были крайне редки среди иных групп, в том числе группы Beijing. Мутации в гене lipR были ассоциированы главным образом с группами Ghana, Cameroon, Uganda и S (RR=7,017, 95% CI=5,57-8,85), в то время как у групп Beijing, LAM, URAL, Haarlem существенно преобладали интактные гены (Таблица 27).
Наши данные относительно ассоциированности полиморфизмов в генах pks15/1 и dosT с генетической группой Beijing хорошо согласуются с ранее опубликованными данными. В частности, в работах Constant et al. (2002) и Gagneux et al. (2007) вставки размером 7 п.н. в гене pks15/1 рассматривается как один из важнейших генетических маркеров штаммов группы Beijing, при этом способность этих штаммов к выработке фенолгликолипидов является важным фактором вирулентности таких микроорганизмов. В нашем исследовании 98,4% штаммов Beijing характеризовались наличием мутаций в гене pks15/1, что, по-видимому, является свидетельством повышенной вирулентности штаммов группы Beijing и одним из факторов их эволюционного успеха. Наши результаты также подтверждают ранее опубликованные данные (Chaiprasert et al., 2006) о том, что мутантный ген может также встречаться среди штаммов других генетических групп и, таким образом, все же не является абсолютным маркером группы Beijing. Среди исследованной выборки 46 штаммов Евро-Американской линии (12,6%) имели мутации в гене pks15/1 и, следовательно, сохраняли способность к выработке фенольных гликоли-пидов, потенциально повышающих их вирулентность. Тем не менее, наши результаты подтвердили ранее опубликованные данные о том, что в значительном большинстве случаев штаммы Евро-Американской линии (генетические группы 2 и 3) характеризуются интактным геном pks15/1 и, таким образом, не способны к выработке фенольных гликолипидов.
В исследовании A. Fallow показана выраженная корреляция специфической точечной мутации (однонуклеотидной замены) в гене dosT и гиперэкспрессии генов системы DosR, наблюдающейся среди штаммов группы Beijing (Fallow et al., 2010). Благодаря гиперэкспрессии генов данной системы группа Beijing получает преимущество перед другими группами в условиях гипоксии и повышенной концентрации оксида азота, что является еще одним фактором ее эволюционного успеха. В нашем исследовании мутация в гене dosT обнаружена у 99,4% от всех изученных штаммов Beijing, что полностью согласуется с ранее опубликованными данными. Тем не менее, в этом же исследовании было подчеркнуто, что незначительное количество штаммов Beijing могут сохранять интактный ген, что также было обнаружено у шести (0,6%) штаммов в нашем исследовании.
Полученные в данном исследовании результаты по преобладанию полиморфизмов в гене plcA среди штаммов генетической группы LAM также согласуются с опубликованными ранее данными. Так, в исследовании Dubiley с соавт. была показана ассоциированность штаммов группы LAM-RUS, циркулирующих в Российской Федерации с мутацией в гене plcA (Dubiley et al., 2007). В нашем исследовании также большинство мутантных по данному гену штаммов принадлежали именно группе LAM (85,7%). Функциональная роль таких мутаций в настоящее время неясна и требует дальнейших исследований в области протеомики и метаболомики.
Относительно полиморфизмов в гене lipR, наши данные не подтвердили ранее обнаруженных ассоциаций дикого типа гена со штаммами, принадлежащими к основной генетической группе 2 (Cameroon, Uganda, X, Haarlem и LAM) (Sheline et al., 2009). Напротив, нами были обнаружено существенное превалирование штаммов с мутантным геном среди генетических группы Ghana, Cameroon, Uganda и S (Таблица 29). Одним из объяснений может служить недостаток данных и неопределенность систематического положения данных групп в филогенетической структуре вида M. tuberculosis. Анализ ассоциированности полиморфизмов в генах plcA, plcB, plcC, lipR, dosT и pks15/1 с наиболее распространёнными в Самарской области кластерами штаммов выявил ряд закономерностей. Распространенность полиморфизмов в данных генах представлена в таблицах 32-36.
