Введение к работе
Актуальность проблемы. Легкие цепи иммуноглобулинов являются одним из основных структурных элементов, участвующих в формировании антиген-связывающего центра антител, В здоровом организме легкие цепи существуют в основном в составе молекул иммуноглобулинов, циркулирующих или находящихся в цитоплазме и на мембранах клеток В-лимфоцитарно-го ряда. Небольшое количество легких цепей находится в свободном виде.
При В-клеточных новообразованиях пролиферация злокачественного клона приводит к нарушению нормального соотношения В-лимфоцитов, несущих на своей мембране или в цитоплазме иммуноглобулины к- и Я-типа, и к соответствующему сдвигу в концентрации циркулирующих иммуноглобулинов. Дисбаланс в синтезе тяжелых и легких цепей, часто наблюдающийся при трансформации В-клеток, приводит также к появлению в крови повышенного количества свободных легких цепей (СЛЦ) одного типа (моно-клональных СЛІД), экскреторные формы которых называются белками Бенс-Джонса (ББД). Выявление легких цепей в составе ассоциированных с клетками или циркулирующих иммуноглобулинов, а также моноклональных СЛІД в сыворотке крови и в моче имеет важное значение для диагностики, классификации н контроля эффективности лечения В-клеточных новообразований.
В последние годы появились сообщения о диагностической значимости выявления СЛІД в спиномозговой жидкости при рассеянном склерозе - хроническом заболевании центральной нервной системы, сопровождающемся интратекальным синтезом иммуноглобулинов (Rudick et al., 1986; Fagnart et al.,1988; Lolli, Amaducci, 1989; Sindic, Laterre, 1991).
Потребность в надежных методах диагностики перечисленных заболеваний определяет необходимость получения высокоспецифичных реагентов для выявления легких цепей, находящихся в составе иммуноглобулинов или в свободном виде. Наличие на легких цепях двух типов антигенных детерминант - постоянно экспрессированных, и скрытых, то есть маскирующихся в структуре молекул иммуноглобулинов и экспрессированных только на СЛІД (Schiller et al., 1973; Calvanico, 1984; Solomon, 1985) - определяет возможность дифференцированного иммунохимического выявления легких цепей, свободных и связанных с тяжелыми цепями. Получаемые с помощью гибридомной технологии моноклональные антитела (МКАТ) направлены против единичной антигенной детерминанты и гомогенны по химическому строению, что обеспечивает их преимущества в специфичности и стандартности в сравнении с поликлональными антисыворотками (Kohler, Milstein, 1975). Поэтому использование МКАТ при разработке методов определения СЛІД в биологи-
2 ческих жидкостях, содержащих иммуноглобулины - сыворотке крови, моче и спиномозговой жидкости (СМЖ), позволяет значительно повысить специфичность и воспроизводимость диагностических тестов. При создании диагностических тест-систем в настоящее время наиболее широко используется иммуноферментный анализ (ИФА), обеспечивающий высокую чувствительность обнаружения и количественное измерение анализируемых соединений. В сочетании с МКАТ ИФА является одним из наиболее надежных и удобных иммунохимических методов диагности:-.;і многих заболеваний. Поэтому получение МКАТ к соединениям, ва::шым с клинической точки зрения, и создание на их основе диагностических иммуноферментных тест-систем является одной из актуальных задач прикладной иммунологии.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в получении МКАТ к легким цепям иммуноглобулинов человека и создании на их основе диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления и типирования моноклональных иммуноглобулинов и количественного определения свободных к- и Х- цепей.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Получить МКАТ к легким цепям иммуноглобулинов человека к- и X-
типа, распознающие эпитопы двух типов - постоянно экспрессированные и
скрытые ( экспрессированные только на СЛЦ).
2. Исследовать возможность применения МКАТ против постоягю
экспрессированных эпитопов к- и Я.-цепей для выявления и ТИПИрОР«."Г"
моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных В-неоплазиямп с
помощью ИФА.
-
Исследовать возможность использования МКАТ к разным эпитопам легких цепей для создания двухдетерминантных иммуноферментных методов количественного определения свободных к- и Л-цепей в различных биологических жидкостях.
-
Оценить пригодность созданных на основе МКАТ методов количественного определения СЛЦ для диагностики множественной миеломы.
-
Исследовать диагностическую значимость количественного определения свободных к- и Л-цепей при рассеянном склерозе.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Получен ряд МКАТ, взаимодействующих с постоянно экспрессиро-
ванными и скрытыми эпитопами к- и А.-цепей иммуноглобулинов человека.
2. Показана возможность применения МКАТ против постоянно
экспрессированных эпитопов к- и А.-цепей для выявления и типирования
моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных с В-клеточными новообразованиями с помощью методов иммуноферментного анализа.
-
На основе МКАТ к скрытым и постоянно экспрессированным эпи-топам легких цепей разработаны иммуноферментные методы количественного определения свободных к- и Х-цепей в сыворотке крови, моче, спино-мозговой жидкости.
-
Количественное определение свободных к- и Я,-цепей в сыворотке крови и моче может использоваться для диагностики и мониторинга В-кле-точных новообразований.
-
Содержание СЛІД к-типа в СМЖ является высокоинформативным показателем при дифференциальной диагностике рассеянного склероза.
Научная новизна работы:
-
Получены два семейства МКАТ против легких цепей иммуноглобулинов человека к- и Х.-типа, распознающие постоянно экспрессированные и скрытые эпитопы.
-
На основе сочетанного применения МКАТ против 'скрытых и постоянно экспрессированных эпитопов разработаны иммуноферментные тест-системы для количественного определения свободных к- и Л-цепей в сыворотке крови, моче, СМЖ.
-
Тест-система для количественного определения свободных Х- цепей, не обладающая перекрестной реактивностью с иммуноглобулинами, предложена впервые и не имеет аналогов.
4. Впервые предложено использовать количественное определение
свободных к- и Х-цепей для выявления и типирования моноклональных СЛІД в
сыворотке крови и моче больных множественной миеломой.
5. Впервые для выявления и определения типа легких цепей монокло
нальных иммуноглобулинов в сыворотках больных множественной миеломой
предложено использовать иммуноферментные методы на основе МКАТ.
6. Выявлена высокая диагностическая значимость количественного
определения свободных к-цепей при рассеянном склерозе.
Практическое значение исследования. Иммуноферментные методы количественного определения свободных к- и Х-цепей на основе полученных МКАТ являются простыми и высокочувствительными методами выявления ББД в моче и моноклональных СЛІД в сыворотке больных В-лимфопролифе-ративными заболеваниями и могут использоваться для диагностики и оценки эффективности лечения этих заболеваний.
Методы ИФА с использованием полученных МКАТ против постоянно экспрессированных эпитопов легких цепей можно применять для выявления и типирования моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных
4 множественной миеломой и другими В-лимфопролкф'-'ративными заболеваниями.
Метод количественного определения свободных к-цепей в СМЖ можно использовать для дифференциальной диагностики рассеянного склероза, в том числе на ранних стадиях. Содержание свободных \-цепей может быть использовано в качестве дополнительного диагностического критерия при рассеянном склерозе.
Апробация работы. Материалы диссуг^ции были доложены на Всесоюзных конференциях "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1988, 1990), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований" (Москва, 1989), на рдбочем совещании невропатологов России в рамках научной конференции "Нейроиммунология на пороге XXI века" (Санкт-Петербург, 1993), 2nd International Congress ISNIM, Paestum (Salerno), Italy (1993), International conference "Biotechnology St.Petersburg'94" (Санкт-Петербург, 1994), а также на заседании проблемной комиссии по медицинской биотехнологии ЦНИРРИ (1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включая 18 таблиц и 18 рисунков. Работа состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 166 отечественных и зарубежных публикаций.
