Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В настоящее время известно, что патогенные энтеробактерии. вызывающие желудочно-кишечные инфекционные заболевания, имеют разную степень вирулентности, от чего впрямую зависит характер патогенеза. Молекулярной основой развития специфических процессов являются факторы патогенности бактерий, наличие которых коррелирует с вирулентностью и связано с функциями адгезии, инвазии, способности к внутриклеточному размножению, ци-тотоксичности. каталитической активностью.
Наряду с изученными факторами патогенности сальмонелл, такими, как липополисахарид клеточной стенки, в работах Finley et al.1988. Foster et al.1990 . Pulkkinen et'al.,1991 указано на существование целого ряда маркеров вирулентности, функции которых неизвестны и требуют изучения.
В 1977 г Степановой Л.К. и соавт. на различных моделях in vivo и in vitro была достоверно выявлена корреляция между присутствием поверхностного К-антигена (Аг) сальмонелл и вирулентностью бактерий. К-Аг присутствует на клеточной поверхности 33-х серогрупп сальмонелл в разной степени и является фосфорилирован-ным белково-липо-полисахаридным нетоксичным комплексом, хорошим иммуногеном. отличающимся по серологическим, физико-химическим свойствам и химической структуре от других антигенов сальмонелл. Предположительно, его функцией является защита от фагоцитоза и, как следствие, способность к эффективному внутриклеточному размножению. В работе Токаренко Л.Г., 1980 сделан вывод о корреляции наличия К-антител в сыворотке больных сальмонеллезом с тяжестью патогенеза и развитием бактерионосительства. В 1984 г Агеевой В. А. разработана брюшнотифозная вакцина, где К-Аг является составляющим компонентом и обеспечивает выраженную поливалентную защиту от сальмонеллезной инфекции.
Таким образом. К-Аг является важным маркером вирулентное сальмонелл, функции которого однозначно не выяснены. Применяем! до настоящего времени методы изучения К-антигена не позволяют pi шить проблему перекрестной специфичности К-антигенов различи! видов сальмонелл и других энтеробактерий, разработать точное те< тирование степени вирулентности выделенных штаммов. В этой свя; актуальным представляется получение моноклональных антител (МЮ к К-Аг.
Получение и характеристика панели МКА к К-АГ позволит на 0( нове современных методов иммуноанализа решить проблему индивиді альности препаратов, выявить, свойственны ли К-Аг только отдел! ным серогруппам или большинству сальмонелл, оценить его наличие других энтеробактерий, также обладающих способностью к внутрикле точному размножению и расширить практическую область применени научных разработок по данной теме.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы являете получение и характеристика панели моноклональных антител к К-ан тигену сальмонелл.
Экспериментальные задачи исследования:
-
Охарактеризовать используемые в работе препараты К-антиге нов сальмонелл в биохимическом отношении.
-
Получить панель моноклональных антител к К-Аг S.typhimuri urn, охарактеризовать свойства полученных МКА .
3.Изучить перекрестную реактивность полученных МКА по отно шению к К-Аг других серогрупп сальмонелл и видов энтеробактерий применяя очищенные препараты Аг и целые бактериальные клетки.
4.Охарактеризовать иммунодоминантные и минорные антигенны детерминанты К-АГ.
5. Показать возможность применения полученных МКА в диагнос тической тест-системе на основе иммуноферментного анализа.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведения настоящей работы впервые получена панель МКА к К-антигенам сальмонелл. С их помощью достоверно показано наличие иммунодоминантных общеродовых детерминант К-Аг разных серогрупп сальмонелл, отсутствие выраженного перекреста с другими видами энтеробактерий. Впервые показано наличие минорных детерминант, характерных для К-антигенов S.typ-піїшгішп и S. typhi и узкоспецифичных по отношению к целым клеткам. Выявлен единственный достоверный случай перекреста между К-и О-антигенами S.typhi.
С помощью эпитопного анализа охарактеризована общеродовая антигенная детерминанта К-Аг. доказано отличие связывающих эпито-пов К-Аг от основных антигенов сальмонелл.
Показана возможность применения полученных МКА при профилактическом тестировании пищевых продуктов с высокой чувствительностью выявления маркера вирулентности сальмонелл методом двойного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Определены параметры разработанной тест-системы. Разработанная система не имеет аналогов, так как применяемые в настоящее время зарубежные и отечественные диагностикумы используют смесь МКА к О-Аг сальмонелл. Наша система основана на выявлении общеродового маркера вирулентности и таким образом, тестирует степень патогенности выявленных бактерий.
Впервые проведено сравнительное изучение белковой части К-Аг S. typhimurium и S.typhi современными методами, показано, что данные препараты являются родственными по своей структуре, но имеются и различия по содержанию белка и аминокислотному составу.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Настоящее исследование позволило получить достоверные данные о К-Аг как об общеродовом маркере сальмонелл, не свойственном другим видам энтеробактерий.
Результаты работы вносят вклад в понимание иммунного ответа на бактериальные антигены, могут быть использованы при аналогичных работах по получению и характеристике МКА к бактериальным антигенам.
Полученные и охарактеризованные в результате проведенных исследований МКА целесообразно использовать:
-
в качестве лиганда для аффинной очистки К-Аг и его последующего использования в составе иммунобиологических препаратов;
-
при изучении функций К-Аг в микробной клетке, выявлении возможного рецептора на поверхности клетки организма хозяина;
-
возможно применение МКА к К-Аг в качестве протективного препарата при сальмонеллезной инфекции подобно запатентованным и официально применяющимся при лечении эшерихиозов МКА к Escherichia coli;
-
разработанная тест-система на основе полученных МКА и ИФА параллельно с другими иммунологическими методами используется группой по проблеме сальмонеллеза в МГУ им. Ломоносова для профилактического тестирования пищевых продуктов. Полученные в процессе работы МКА к другим Аг сальмонелл позволят полностью перевести профилактическое тестирование на новую основу;
-
разработанный метод выявления К-антигена в предложенном виде может быть применен для определения степени вирулентности клинически выделенных штаммов сальмонелл, а также выявления антигена в сыворотке больных на ранней стадии. Возможен.. прогноз формирования бактерионосительства.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии Биологического ф-та МГУ.
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 печатных работы.
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, вьводов и списка цитируемой литературы (147 ссылок). Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 50 рисунков.
