Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы
Глава 1. Иммунобиологическая функция кожи 20
1.1. Строение кожи 20
1.2. Вещества, влияющие на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов, апоптоз кератиноцитов 27
1.3. Иммунологическая функция кожи 34
1.3.1. Иммунологически активные клетки кожи 34
1.3.2. Цитокины и кожа 43
1.3.2.1. Интерлейкины 44
1.3.2.2. Интерфероны 65
1.3.2.3. Хемокины 67
1.3.2.4. Колониестимулирующие факторы 68
1.3.2.5. Факторы роста 69
1.3.2.6. Факторы некроза опухолей 72
1.4. Нейроиммунокожная система 72
Глава 2. Влияние экзогенной рнк на иммунный ответ 75
Глава 3. Псориаз. нарушения при псориазе. методы лечения псориаза 77
3.1. Этиология и патогенез псориаза 77
3.2. Патологическая пролиферация и дифференцировка кератиноцитов...78
3.3. Патогенез псориаза на клеточном уровне 79
3.4. Трансмембранные сигнальные преобразовательные системы 88
3.5. Белки острой фазы воспаления и псориаз 88
3.6. Перекисное окисление липидов и состояние мембран при псориазе...89
3.7. Системные нарушения при псориазе 89
3.8. Нервная система и псориаз з
3.9. Цитокины при псориазе 91
3.10. Взаимоотношение между иммунной системой и кератиноцитами при псориазе 102
3.11. Методы лечения псориаза 109
Часть 2. Иммунотропные препараты из кожи. разработка получения, физико-химические и иммунобиологические свойства и перспектива клинического применения (Собственные исследования)
Глава 4. Материалы и методы исследования 115
4.1 .Материалы исследования 115
4.2.Физико-химические методы 115
4.2.1. Определение концентрации белка по методу Лоури 115
4.2.2. Определение концентрации белка биуретовым методом 116
4.2.3. Определения концентрации РНК 116
4.2.4. Определение концентрации углеводов 118
4.2.5. Определение концентрации общих липидов 119
4.2.6. Гель-хроматография 119
4.2.7. Гель-хроматография высокого давления (ВЭЖХ) 121
4.2.8. Высокоэффективная жидкостная хроматография в обращенной фазе 122
4.2.9. Метод изоэлектрофокусирования в тонком слое агарозы 122
4.2.10. Метод вертикального ступенчатого электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия .125
4.2.11. Метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 7М мочевины 130
4.2.12. Метод масс-спектрометрии 132
4.3. Иммунобиологические методы 133
4.3.1. Определение количества антителообразующих клеток селезенки
мышей на пике первичного иммунного ответа 133
4.3.2. Метод восстановления чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро 134
4.3.3. Метод восстановления чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин виво 137
4.3.4. Метод определения уровня сывороточной тимической активности 138
4.3.5. Метод получения кератиноцитов человека 140
4.3.6. Пролиферация кератиноцитов человека 141
4.3.7. Дифференцировка кератиноцитов человека 141
4.3.8. Культура эпидермоидных клеток карциномы человека А431... 142
4.3.9. Культура эмбриональных фибробластов человека 143
4.3.10. Определение содержания цитокинов 143
4.3.10.1. Трансформирующий фактор роста-бетаї и бета2 143
4.3.10.2. Интерлейкин-4 144
4.3.10.3. Интерлейкин-1 бета 145
4.3.10.4. Фактор некроза опухолей-альфа 146
4.3.10.5. Эпвдермальный фактор роста 148
4.4. Фармакологические методы 150
4.4.1. Кожно-резорбтивное действие 150
4.4.2. Острая токсичность 150
4.4.3. Хроническая токсичность 152
4.4.4. Анафилактический шок 153
4.4.5. Активная кожная анафилаксия 155
4.5. Статистическая обработка результатов 156
Глава 5. Результаты и их обсуждение 157
5.1 .Разработка ацетонового метода получения иммунотропных препаратов 157
5.1.1. Процентное содержание белка, РНК, углеводов и общих липидов в иммунотропных препаратах 161
5.1.2. Влияние препаратов на количества антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа 162
5.1.3. Влияние препаратов на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро 165
5.1.4. Гель-хроматография высокого давления иммунотропных препаратов 168
5.1.5. Изоэлектрофокусирование иммунотропных препаратов 169
5.1.6. Электрофорез иммунотропных препаратов в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 171
5.1.7. Электрофорез иммунотропных препаратов в полиакриламидном геле в 7М мочевине 176
5.1.8. Влияние иммунотропных препаратов на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре.. 180
5.1.9. Определение содержания в иммунотропных препаратах некоторых цитокинов 183
5.1.10. Фармакологические свойства К-активина 186
5.1.11. Лечение больных псориазом К-активином путем наружного применения 193
5.1.12. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография К-активина 196
5.1.13. Масс-спектрометрия К-активина 198
5.1.14. Влияние К-активина на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин виво 201
5.1.15. Влияние К-активина на уровень сывороточной тимической активности 202
5.1.16. Влияние К-активина на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 206
5.1.17. Влияние К-активина на пролиферацию эмбриональных фибробластов человека 207
5.1.18. Определение содержания в К-активине некоторых цитокинов...208
5.1.19. Физико-химические и иммунобиологические свойства К-активина 210
5.1.20. Заключение 212
5.2. Разработка метода получения иммунотропных препаратов, включающего этапы высаливания 215
5.2.1. Процентное содержание белка, РНК, углеводов и общих липидов в препаратах 218
5.2.2. Влияние препаратов на количества антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа 219
5.2.3. Влияние препаратов на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро 220
5.2.4. Изоэлектрофокусирование иммунотропных препаратов 221
5.2.5. Электрофорез иммунотропных препаратов в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 222
5.2.6. Влияние иммунотропных препаратов на пролиферацию эпидермоидных клеток карциномы человека А431 223
5.2.7. Сравнительная характеристика иммунотропных препаратов, полученных ацетоновым методом и методом, включающим этапы высаливания 224
5.2.8. Заключение 233
5.3. Разработка безацетонового метода получения иммунотропных
препаратов 234
5.3.1. Процентное содержание белка, РНК, углеводов и общих липидов в препаратах 237
5.3.2. Влияние препаратов на количества антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа 238
5.3.3. Влияние препаратов на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро 239
5.3.4. Изоэлектрофокусирование иммунотропных препаратов 240
5.3.5. Электрофорез иммунотропных препаратов в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 242
5.3.6. Влияние хранения на физико-химические и иммунологические свойства препаратов, полученных безацетоновым методом 243
5.3.7. Сравнительная характеристика иммунотропных препаратов, выделенных ацетоновым и безацетоновым методами 249
5.3.8. Заключение 258
ГЛАВА 6. Общее заключение 259
Выводы 272
Список литературы
- Иммунологически активные клетки кожи
- Патогенез псориаза на клеточном уровне
- Гель-хроматография высокого давления (ВЭЖХ)
- Влияние препаратов на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро
Введение к работе
Актуальность исследования. Разработка новых иммунотропных препаратов является актуальной проблемой современной иммунологии. Кожа представляет собой богатый источник иммунобиологически активных веществ. В ней обнаружены клетки и медиаторы, принимающие участие как в естественном (врожденном), так и в адаптивном иммунном ответе. В коже выявляют несколько субпопуляций дендритных клеток [Lew W. et al., 2004; Becker Y., 2003; Wollenberg A. et all, 2002; Пащенков M.B. и др., 2001; Ярилин А.А., 1994; Stingl G., 1994]. Лимфоциты осуществляют свои функции в организме, в том числе и в коже, путем постоянной рециркуляции [Катунина О.Р., 2005; Lew W. et al., 2004; Ковальчук Л.В., 2003; Зимина И.В., Лопухин Ю.М., Арион В.Я., 1994; Ярилин А.А., 1994; Скрипкин Ю.К., Лезвинская Е.М., 1989]. В нормальной коже обнаруживается небольшое количество естественных киллеров [Cameron A.L. et al., 2002]. Они относятся к клеткам естественного (врожденного) иммунитета и способны оказывать прямое цитотоксическое действие на злокачественно-трансформированные и вирусинфицированные клетки. Гистиоциты - макрофаги дермы реализуют первую линию иммунной защиты, но принимают участие и в адаптивном иммунитете [Ярилин А.А., 1994]. Большую роль в реализации иммунного ответа играют эндотелиальные клетки сосудов. Они имеют на своей поверхности молекулы адгезии, которые взаимодействуют с соответствующими молекулами на поверхности лимфоцитов и гранулоцитов и обеспечивают миграцию клеток из кровяного русла в ткани, в том числе и в кожу [Lew W. et al., 2004; Зимина И.В., Лопухин Ю.М., Арион В.Я., 1994; Ярилин А.А., 1994]. Тучные клетки (лаброциты, мастоциты) кожи участвуют в аллергических реакциях, немедленного и замедленного типов. Лейкоциты могут покидать кровеносное русло, попадая сначала в дерму, а затем в эпидермис. Нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, выявляемые в коже, принимают участие в иммунологической функции кожи как клеточные факторы естественного
иммунитета. Фибробласты, фиброциты, меланоциты, клетки Меркеля, адипоциты вносят свой вклад в иммунологическую функцию кожи за счет взаимодействия с клетками иммунной системы и синтеза ряда цитокинов [ЯрилинА.А., 1994].
Выявлена иммунологическая функция кератшюцитов. Эмбриональные кератиноциты секретируют гормон тимуса тимопоэтин, аналогичный тимопоэтину, выделенному из тимуса взрослых особей [Audhia Т.К., Goldstein G., 1988]. Кератиноциты взрослых особей секретируют эпидермальный фактор дифференцировки лимфоцитов (ELDIF), ингибируїощий пролиферацию и стимулирующий созревание лимфоцитов [J.F. Nicolas, 1988].
Помимо клеток большую роль в функционировании иммунной системы играют такие медиаторы иммунного ответа, как цитокины: интерлейкины, интерфероны, хемокины, факторы некроза опухолей, колониестимулирующие факторы, факторы роста, а также противомикробные пептиды [Зимина И.В., Лопухин Ю.М., Арион В.Я., 1994; Ярилин А.А., 1994; Ковальчук Л.В., 2003]. Все сказанное выше говорит о том, что кожа является богатым источником для получения иммунологически активных веществ, хотя используется для этого очень редко.
Существует взаимосвязь между процессами, протекающими в коже и иммунной системой. Многие заболевания кожи протекают на фоне иммунодефицитного состояния. Так при псориазе выявляются нарушения в естественном (врожденном) и адаптивном иммунитете [Катунина О.Р., 2005; Короткий Н.Г. и др., 2005; Lew W. et al., 2004; Nickoloff B.J. et al., 2004; Bos J.D., De Rie M.A., 1999; Ortonne J.-P., 1999]. Кроме того, основным проявлением псориаза является гиперпролиферация и незавершенность дифференцировки кератиноцитов. Доказанным фактом при псориазе является сдвиг регуляции Т-лимфоцитов в сторону Т-хелперов типа 1 и цитотоксических Т-лимфоцитов типа 1 [Lew W. et al., 2004; Austin L.M. et al., 1999].
Разработка новых иммунотропных препаратов, регулирующих иммунологические процессы и процессы, протекающие в коже, является актуальной проблемой современной иммунологии.
Цель работы. Разработать методы получения иммунотропных препаратов из кожи, изучить физико-химические и иммунобиологические свойства препаратов и оценить возможность применения одного из них для лечения псориаза.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Разработать методы получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи.
Определить содержание белка, углеводов, РЫК и общих липидов в полученных препаратах.
Изучить некоторые иммунологические свойства полученных препаратов (влияние на количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа и на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей).
Исследовать полученные препараты методами изоэлектрофокусирования в агарозе, электрофореза в полиакриламидном геле, а отдельные препараты методами высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Изучить влияние полученных препаратов на процессы, протекающие в коже (на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и на пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А431).
Изучить фармакологические свойства препарата, ингибирующего пролиферацию и стимулирующего дифференцировку кератиноцитов человека (К-активина): кожно-резорбтивное действие, острую и хроническую
токсичность, аллергизирующее действие (в реакциях анафилактического шока и активной кожной анафилаксии).
Изучить физико-химические и иммунобиологические свойства К-актявина (методами обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, влияние на созревание Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей ин виво, влияние на уровень сывороточной тимической активности, на пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А431 и эмбриональных фибробластов человека).
Изучить содержание в К-активине и некоторых иммуногрошшх препаратах цитокинов: трансформирующих факторов роста-бетаї и -бета2, интерлейкина-4, интерлейкина-ібета, фактора некроза опухолей-альфа и эпидермального фактора роста.
Сравнить физико-химические и иммунологические свойства аналогичных препаратов, полученных ацетоновым методом и методом, включающим этапы высаливания.
Сравнить физико-химические и иммунологические свойства аналогичных препаратов, полученных ацетоновым и безацетоновым методами.
Научная новизна работы
Разработаны три новых метода получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи: ацетоновый, безацетоновый и метод с высаливанием.
С использованием новых методов получены новые иммунотропные препаратьт из кожи свиньи, влияющие на показатели гуморального и клеточного иммунитета, а также на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А 431.
Изучены физико-химические свойства новых иммунотропных препаратов из кожи свиньи: содержание белка, углеводов, РНК и общих
липидов; гетерогенность, pi и молекулярные массы белков, белковых субъединиц и РНК. Изучено содержание некоторых цитокинов в отдельных препаратах.
Разработан новый иммунотропный препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин.
Изучены фармакологические свойства К-активина: кожно-резорбтивное действие, острая и хроническая токсичность, аллергизирующее действие (в реакциях анафилактического шока и активной кожной анафилаксии). В настоящее время материалы по К-активину находятся в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора».
Изучен механизм действия К-активина: препарат ингибирует пролиферацию и стимулирует дифференцировку кератиноцитов человека. Помимо этого он повышает сывороточную тимическую активность и стимулирует созревание Т-лимфоцитов.
Сравнение аналогичных препаратов, но полученных тремя различными методами, показало, что они отличаются как по физико-химическим, так и по иммунологическим свойствам.
Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования. Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин. Метод лечения псориаза запатентован. В настоящее время материалы по К-активину находятся в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздравнадзора».
Разработаны новые иммунотропные препараты из кожи. Методы их получения запатентованы. После проведения доклинических и клинических испытаний они могут быть использованы в качестве иммунокорригирующих препаратов, а также препаратов, стимулирующих или ингибируїощих процессы кератинизации, заживления ран в дерматологии и косметологии.
Разработаны новые методы получения иммунотропных препаратов из кожи свиньи, которые могут быть использованы для получения препаратов из других источников. По материалам диссертации получены три патента. Основные положения, выносимые на защиту
Разработаны три новых метода получения эндогенных иммунотропных препаратов из кожи свиньи: ацетоновый, безацетоновый и метод с высаливанием.
Продемонстрирована эффективность иммунотропных препаратов из кожи свиньи, полученных новыми методами, по влиянию на показатели гуморального и клеточного иммунитета, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека в первичной культуре и пролиферацию культивируемых эпидермоидных клеток карциномы человека А 431.
Разработан новый препарат для лечения псориаза путем наружного применения - К-активин.
Выявлена тимоподобная активность препарата из кожи (К-активнна): восстановление сниженной сывороточной тимической активности у тимэктомированных мышей и стимуляция созревания Т-лимфоцитов.
Механизмом действия К-активина, эффективного в клинике при лечении псориаза, является ингибирование пролиферации и стимуляция дифференцировки кератиноцитов, повышение сывороточной тимической активности и стимуляция созревания Т-лимфоцитов.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на: - 2-м Международном симпозиуме «Реабилитация иммунной системы», Дагомыс, 1990; 1-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1992; Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии, Алма-Ата, 1992; 1-м Съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992; 8-th International Symposium on Infections in the Immunocompromised Host, Davos, Switzerland, 1994; - XY International Congress of Allergology and Clinical Immunology, Stockholm, Sweden, 1994; - 1-ом
Международном конгрессе по иммунореабилитации, Сочи, 1994; - 3-м Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1996; -Всероссийской конференции "Биология клетки в культуре", Санкт-Петербург, 1996; - 2-м Национальном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии", Москва, 1998; - на 2-м конгрессе с международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация", Москва, 1998; - V Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1998; - 2-м Съезде иммунологов России, Сочи, 1999; - 4-м симпозиуме "Неинвазивные физико-химические методы диагностики", Москва, 2000; - VIII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 2001; - V Всероссийской конференции "Паллиативная помощь в онкологии", 2001; - 5-м Конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", Москва, 2002; - Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака», Москва, 2002; - 5-й конгресс с международным участием "Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении", Египет, 2003; - 1-й Всероссийской конференции по иммунотерапии, Сочи, Дагомыс, 2003; -Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии», Москва, 2005; - XI Международный конгресс по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, Тенерифе, Испания, 2006.
Награды. Доклад «Ростовые факторы и цитокины кожи» ("Growth Factors and Cytokines from Skin"), представленный на 8-м Международном симпозиуме по инфекциям у иммунокомпромиссного хозяина, который проводился в Давосе (Швейцария) в 1994 году, получил награду - President Award (8-th International Symposium on Infections in the Immunocompromised Host, Davos, Switzerland, 1994).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 научных работ. Получено три патента РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 320 страницах, включая 17 таблиц и 44 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография содержит 429 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.
Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Часть исследований, составивших предмет диссертации, была выполнена совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной иммунологии (зав. лабораторией - академик РАЕН, д.б.н., профессор Арион В.Я.), лаборатории клеточных культур (зав. лабораторией -д.б.н., профессор Капитанов А.Б.), лаборатории экспериментальной гемосорбции и окислительных методов детоксикации (зав. лабораторией -к.м.н. Мартынов А.К.) ФГУ «НИИ физико-химической медицины Росздрава», сотрудниками лаборатории проблем клеточной пролиферации (зав. лабораторией - д.б.н., профессор Терских В.В.) Института биологии развития им. Н.К. Колоцова РАН, сотрудниками кафедры иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (зав. кафедрой - академик РАЕН, д.м.н., профессор Ковальчук Л.В.), сотрудником экспериментально-биологической лаборатории (зав. лабораторией - д.б.н., профессор Степаненко Р.Н.) ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России.
Иммунологически активные клетки кожи
Достижения иммунологии позволили Д. Стрейлейну в 1983 году сформулировать понятие: "лимфоидная ткань, ассоциированная с кожей" (383). Этим термином он предложил обозначить компоненты иммунной системы, локализованные в эпидермисе: антигенпредставляющие клетки, Т-лимфоциты, тропные к эпидермису, кератиноциты и регионарные лимфоузлы. Позднее это понятие было распространено на всю кожу (161). В коже обнаружены факторы естественного иммунитета, а также клетки и медиаторы адаптивного иммунитета.
Установлено, что лимфоциты осуществляют свои функции в коже путем постоянной рециркуляции (32, 30, 120, 92, 164). Т-лимфоциты составляют 90% всех лимфоцитов кожи и располагаются преимущественно в верхних слоях дермы. Небольшое количество Т-лимфоцитов присутствует и в эпидермисе. В-лимфоциты составляют около 10% лимфоцитов кожи и встречаются в средних и глубоких слоях дермы (92, 32, 257). Обнаружено, что Т-лимфоциты нормальной кожи в периваскулярных областях состоят почти из одинакового количества хелперов и супрессоров. Большинство из них активированы, о чем свидетельствует экспрессия HLA-DR и рецепторов в интерлейкину-2 (92,161).
Было обнаружено, что огромное большинство Т-клеток, инфильтрующих кожу и субпопуляция циркулирующих Т-клеток памяти/эффекторых клеток экспрессирует кожный лимфоцит-ассоциированный антиген (CLA). К настоящему времени появились доказательства того, что CLA является хоминговым рецептором вовлеченным в селективную миграцию клеток памяти/эффекторных Т клеток в кожу (273). Миграция кожно-хоминговых Т-клеток через цитокин-активированные эндотелиальные клеточные слои человека вовлекает взаимодействие антигенов CLA, VLA-4 и LFA-1. Считают, что CLA привлекает Т-клетки к местам воспаления кожи путем взаимодействия с эндотелиальным клеточным лигандом Е-селектином (CD62E). При этом происходит взаимодействие LFA-1 с ICAM-1 и VLA-4 с VCAM-1; это кончается увеличением адгезии Т-клеток и их миграцией через цитокин-активированные эндотелиальные клетки (362).
Была показана ключевая роль тимуса в индукции кожно-хоминговых специфичностей на Т клетках (406). Было обнаружено, что хоминговые специфичности для кожи появляются на девственных Т клетках внутри тимуса, независимого от антигена. Они выявлены как на ар Т-клетках, так и на эмигрирующих 8у Т-клетках и идентичны таковым зрелых Т клеток (406).
Т-лимфоциты кожи несут на своей поверхности как ар-, так и у5-Т-клеточный рецептор. уб-Т-клетки редко обнаруживаются в селезенке, пейеровых бляшках и паренхиме лимфатических узлов, но широко распространены в периферической крови, лимфатических сосудах, эпителии нелимфоидных тканей, включая кожу, кишечник и др. (103). Преобладающими внутриэпителиальными Т-лимфоцитами являются сф-Т-клетки, хотя содержание внутриэпителиальных уб-Т-клеток может доходить до 20% (103). Обнаружено, что уб-Т-клетки распознают антиген без предварительного процессирования и участия молекул HLA комплекса (103). Предполагают, что они создают первую линию защиты от инфекции. уб-Т-клетки разных тканей относятся к различным субпопуляциям. Они способны мигрировать в кожу из тимуса. Среди у8-Т-клеток, также как и среди сф-Т-клеток, выделяют ТЫ и Th2 субпопуляции, продуцирующие соответствующие цитокины (103). у5-Т-клетки участвуют в регуляции иммунитета и активно взаимодействуют с оф-Т-клетками. Было показано, что уб-Т-клетки регулируют процессы кератинизации, продуцируют фактор роста кератиноцитов и играют важную роль в сохранении эпителиальной целостности (103).
Эпидермис здорового человека содержит дендритные эпидермальные Т-клетки (ДЭТК), относящиеся к у5-Т-клеткам, что ранее было показано для мышей (103). Они способны продуцировать ИЛ-1 альфа, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-7, ИЛ-13, ФНО, ГМ-КСФ, ИФ-гамма. Предполагают, что они взаимодействуют с кератиноцитами и клетками Лангерганса. ДЭТК секретируют фактор роста кератиноцитов. Кератиноциты, в свою очередь, секретируют хемокины, привлекающие ДЭТК в эпидермис. ДЭТК способны дифференцироваться в ТЫ и Th2 клетки (103).
Естественные киллеры (NK-клетки) являются одной из основных популяций лимфоцитов. Они представляют собой большие гранулярные лимфоциты. Гранулы естественных киллеров содержат перфорин, гранзимы и хондроитинсульфат А. На них отсутствуют основные маркеры В- и Т-лимфоцитов: Ig и CD3 молекулы. В нормальной коже при использовании иммунопероксидазной техники обнаруживается небольшое количество клеток, экспрессирующих маркеры естественных киллеров (CD 16, CD56, CD57, CD94, CD158A) и естественных Т-киллеров (CD161). Количество этих клеток в коже увеличивается при псориазе (166).
В эпидермисе находятся клетки Лангерганса - дендритные клетки, белые отросчатые эпидермоциты. За последние годы пересмотрена роль дендритных клеток в организме. В настоящее время их относят к наиболее мощным антигенпредставляющим клеткам (72). Отличительные признаки клеток Лангерганса: экспрессия CD 1а, Е-кадгерина и лангерина, а также наличие цитоплазматических гранул Бирбека (148, 373). Е-кадгерин -гомофильная молекула адгезии, которая опосредует взаимодействие клеток Лангерганса с кератиноцитами и "направляет" предшественники клеток Лангерганса в эпидермис (72, 380, 30). Гранулы Бирбека представляют собой цитоплазматические полимембранные структуры, в состав которых входит белок лангерин. Предполагают, что они являются или хранилищем антигенов, или резервным запасом фосфолипидных мембран (72). Клетки Лангерганса пребывают в эпидермисе примерно 3 недели. Захватив чужеродный антиген, они созревают и мигрируют в Т-клеточные зоны регионарных лимфоузлов, где принимают участие в образовании пула интердигитирующих дендритных клеток и активируют Т-хелперы. Поглощение и представление антигена клетками Лангерганса разобщены. Поглощение антигена происходит в коже, а представление - в регионарных лимфоузлах (72). Представление эндоцитированных антигенов осуществляется молекулами МНС II класса. Клетки Лангерганса не продуцируют ИЛ-10 после СО40-активации, а также не поддерживают пролиферацию и дифференцировку В-клеток в отличие от других дендритных клеток (72). Дифференцируются из плюрипотентной стволовой кроветворной CD34+ клетки. Клетки Лангерганса составляют 2-4% от всех эпидермальных клеток, являются циркулирующими клетками (19, 30, 380, 372, 231).
Патогенез псориаза на клеточном уровне
Нейроиммунокожная система Misery L. предложил концепцию нейроиммунокожной системы, поскольку эти три системы связаны анатомически и физиологически (304). Между нервной системой, иммунной системой и кожей имеются физические связи типа клеточных контактов между волокнами нервов, клетками кожи и иммунными клетками, химические связи типа кожной секреции нейромедиаторов и их рецепторов на клетках кожи и функциональные связи, например, модуляция кожных и иммунных функций нейромедиаторами. Наблюдается взаимодействие между кожей, нервной системой и иммунитетом в течение определенных болезней.
Среди большого числа нейромедиаторов и нейрогормонов около 20 было обнаружено в коже человека. Это такие нейропептиды как: субстанция Р, нейропептид Y, вазоактивный интестинальный пептид, пептид гистидин-изолейцин, соматостатин, нейротензин; пептид, родственный гену кальцитонина; нейрокинины; пептид, освобождающий гастрин и брадикинин. Среди нейрогормонов обнаружены пролактин, мелано-стимулирующий гормон, адренокортикотропный гормон и катехоламины: энкефалины, эндорфины и ацетилхолин (304).
Фактор роста нервов обнаружен в коже человека и его роль не ограничена ростом нервов. Он более сильный индуктор пролиферации кератиноцитов, чем эпидермальный фактор роста. Он вызывает экспрессию bcl-2 и предотвращает апоптоз кератиноцитов и меланоцитов. Клетки кожи обладают нейронными свойствами. Они экспрессируют маркеры нейронов и Шванновских клеток и рецепторы к нейротрансмиттерам, продуцируют нейромедиаторы (304).
Эпителиальное или невральное происхождение клеток Меркеля всё ещё подвергается спорам, хотя есть предположение, что они происходят из базальных кератиноцитов. Клетки Меркеля обладают характеристиками как нервных, так и эпителиальных клеток. Они экспрессируют такие маркеры нервных клеток как белок S100, нейрон-специфическую энолазу, белок нейрофиламентов, белковый продукт гена 9.5 (PGP9.5, хромогранин, синаптофизин), продуцируют фактор роста нервов и его рецептор (304). В то же время они экспрессируют эпителиальные маркеры. Клетки Меркеля обладают электрическими свойствами. В покое мембранный потенциал клеток Меркеля составляет -54 mV. В этих клетках обнаружены гранулы и нейросекреторные пузырьки. Гранулы присутствуют в цитоплазме, экспрессируют хромогранин, предназначенный для нервных и кожных клеток. Нейросекреторные пузырьки экспрессируют синаптофизин и неиромедиаторы (304).
Клетки Лангерганса и их предшественники экспрессируют белок S100 и нейрон-специфическую энолазу. После денервации они способны синтезировать белковый продукт гена 9.5. Клетки Лангерганса продуцируют про-опиомеланокортин - предшественник меланостимулирующего гормона, адренокортикотропного гормона и бетта-эндорфина. Неиромедиаторы и нейропептиды способны модулировать функцию этих клеток (304).
Предполагается, что некоторые базальные кератиноциты дифференцируются в клетки Меркеля. Кератиноциты способны синтезировать неиромедиаторы: про-опиомеланокортин, ацетилхолин, допамин, адреналин и норадреналин. Они экспрессируют рецепторы к субстанции Р; пептиду, освобождающему гастрин; пептиду, родственному гену кальцитонина, нейропептиду Y, ацетилхолину и меланостимулирующему гормону. Меланоциты экспрессируют белок S100, ферменты, вовлеченные в синтез катехоламинов, рецепторы к мелано-стимулирующему гормону. Катехоламины индуцируют экспрессию адренорецепторов на меланоцитах. В дерме фибробласты имеют рецепторы к субстанции Р, бомбезину и соматостатину. В подкожном жире на адипоцитах присутствуют рецепторы к катехоламинам (304).
Существует физическая связь между нервными волокнами и клетками кожи. Между нервными волокнами и клетками Меркеля такая связь была показана довольно давно. Недавно показано, что клетки Лангерганса, кератиноциты и меланоциты имеют контакт с нервными волокнами. Все эти данные говорят о тесном функциональном взаимодействии между нервной системой, иммунной системой и кожей (304). Помимо цитокинов, нейромедиаторов и нейрогормонов, существует еще один класс биологически активных молекул, которые также влияют на иммунный ответ - это РНК.
Было обнаружено, что введение экзогенной РНК оказывает влияние на различные системы организма, в том числе и на иммунную. Большое количество исследований было проведено с использованием низкомолекулярной дрожжевой РНК и лекарственного препарата нуклеината натрия, который относится к этому виду РНК (26, 27, 28). Дрожжевая РНК, а также сингенная и аллогенная РНК высших животных обладали адъювантным действием: усиливали первичный и вторичный иммунный ответ, сокращали индуктивную фазу антителогенеза. Это было показано как для растворимых антигенов, так и для корпускулярных (28,9,11).
Гель-хроматография высокого давления (ВЭЖХ)
Нервная система играет большую роль при псориазе. Психологический стресс часто провоцирует болезнь или вызывает обострение. Хорошо известно действие психотерапии и психотропных лекарств у больных псориазом. После денервации кожи псориаз часто регрессирует При этом большую роль играет субстанция Р (304). Аффинность, распределение и плотность эпидермальных рецепторов к субстанции Р сильно модифицирована при псориазе. Концентрация субстанции Р в коже снижается, в то время как концентрация вазоактивного кишечного пептида повышается. Вазоактивный кишечный пептид увеличивает концентрацию кератиноцитов, а субстанция Р - снижает. Фактор роста нервов повышен в псориатической коже. В крови концентрация определенных нейромедиаторов изменяется. Повышается секреция бета-эндорфина. Предполагают, что это связано больше с клетками воспаления, чем с нервными волокнами (304).
Из-за преобладающей экспрессии ИЛ-2 и интерферона-гамма при псориазе, и недостатке ИЛ-4 и ИЛ-10 полагают, что псориаз характеризуется цитокинами типа ТЫ. Интерлейкин 1 Функциональная активность ИЛ-1 в коже, пораженной псориазом, уменьшена по отношению к нормальной коже (177, 178). ИЛ-1 обнаружен в псориатичских бляшках и чешуйках (159). Его источником могут быть клетки Лангерганса, гранулоциты, кератиноциты. Он может частично отвечать за увеличение притока гранулоцитов и увеличение проявления воспаления, включая эритему и отек (159).
Уровни ИЛ-1-альфа в базальных кератиноцитах нормальной кожи и непораженной псориатической кожи были выше по сравнению с его уровнем в пораженной псориазом коже. Антагонист рецептора ИЛ-1 и рецептор ИЛ-1 типа II оба были значительно повышены в базальном и супрабазальном уровнях пораженного эпидермиса (188). Значительная обратная корреляция была обнаружена между экспрессией ИЛ-1-альфа и этими двумя антагонистами ИЛ-1. Гибридизация тРНК ин ситу подтверждает данные окрашивания. Уровень мРНК антагониста рецептора не был повышен в пораженном псориазом эпидермисе, что говорит о том, что повышенная экспрессия этого белка может происходить на уровне трансляции (188). Более чувствительный метод ПЦР демонстрирует явное повышение экспрессии тРНК ИЛ-1-бета в эпидермальных клетках пораженного псориазом эпидермиса. Было обнаружено присутствие тРНК рецептора ИЛ-1 типа І в эпидермальных клетках нормальной кожи и пораженной псориазом кожи. Уровни тРНК секретируемых изоформ антагониста рецептора были повышены в эпидермальных клетках пораженного псориазом эпидермиса параллельно с уровнем ИЛ-1-бета. В отличии от них уровни тРНК внутриклеточных изоформ антагониста рецептора типа Т и II и уровень тРНК рецептора типа II не были повышены в эпидермальных клетках пораженного псориазом эпидермиса. Это исследование показывает определенный фенотип эпидермальной системы ИЛ-1 при псориазе. Он показывает, что экспрессия изоформ ИЛ-1 и его рецепторов существенно изменена, что результируется в преобладании антагонистов ИЛ-1, что может представлять ответ отрицательной обратной связи на агонисты ИЛ-1, приводящий к снижению реактивности ИЛ-1 (188). В то же время уровень ИЛ 1 альфа в сыворотке крови больных псориазом не имел значительных отличий от здоровых доноров (222). Интерлейкин-2 Интерлейкин-2 играет ключевую роль в патофизиологии псориаза, т.к. он активирует Т-клетки. В последние годы терапия псориаза развивалась в направлении по предотвращению активации Т-клетки, блокируя продукцию IL 2 или ингибируя его действие (361). Выявлено повышение концентрации ИЛ-2 в периферической крови больных псориазом (55).
Было исследовано содержание ИЛ-4 и ИФ-гамма в пораженной и непораженной коже больных распространенным псориазом в прогрессивную стадию и у здоровых лиц (20). В результате исследования было выделено две группы больных. Больные первой группы (64% больных) показали высокое содержание ИФ-гамма в пораженной и непораженной коже по сравнению со здоровыми лицами (20). Содержание ИФ-гамма в непораженной коже больных псориазом было в 1,4 раз, а в пораженной - в 2 раза больше, чем в здоровой коже. Содержание ИЛ-4 у них практически не отличалось от нормы (20). Больные второй группы (36%) больных) показали высокое содержание ИЛ-4 в пораженной и непораженной коже по сравнению со здоровыми донорами. Содержание ИЛ-4 в непораженной коже больных псориазом было в 8 раз, а в пораженной - в 17 раз больше, чем в здоровой коже. Содержание ИФ-гамма у них практически не отличалось от нормы.Установлено, что при торпидных, плохо поддающихся антипсориатической терапии формах псориаза происходит снижение уровня ИЛ-4 в сыворотке крови (55). ИЛ-4 был применен для лечения псориаза и дал хорошие результаты (296).
Влияние препаратов на восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро
Эритроциты барана вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл физиологического раствора в концентрации 400 млн/мл мышам СВА. Одновремнно подкожно вводили испытуемые препараты в дозе 1,10 и 100 мкг на мышь. На пятые сутки животных забивали, извлекали селезенки и помещали в пробирки, содержащие 2,5 мл среды 199 при температуре тающего льда. Гомогенизировали селезенки в слабо притертом гомогенизаторе и фильтровали через нейлоновую сетку. Подсчитывали количество ядросодержащих клеток в готовой суспензии. Расплавляли агарозу в физиологическом растворе в концентрации 10 мг/мл на кипящей водяной бане. В водяную баню, нагретую до 50С, помещали стакан с 25 мл среды 199, добавляли 0,4 мл отмытых эритроцитов барана и в последнюю очередь добавляли 10 мл расплавленной агарозы. Водяную баню устанавливали в режиме вибрации для предотвращения оседания эритроцитов барана. Смесь разливали по 1 мл в гемагглютационные пробирки, разргретые до 50С. и добавляли туда по 0,05 мл взвеси спленоцитов.Содержимое пробирок осторожно встряхивали и переносили в чашки Петри. После застывания агарозы чашки помещали на 2 часа в воздушный термостат с температурой 37С. Наслаивали 1,5 мл комплемента, разведенного в 10 раз средой 199, и инкубировали 30 мин. при той же температуре. Подсчитывали число зон гемолиза, что соответствует количеству антителообразующих клеток селезенки, на 1 млн. спленоцитов. Определяли процент АОК по отношению к контролю, принимая среднюю арифметическую в контрольной группе за 100%. Все результаты соотносили со средней арифметической в контрольной группе.
Метод восстановления чувствительности Т-лимфоцитов селезёнки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна ин витро (185) Тимэктомия Мыши C57B1/6J тимэктомируются в возрасте 6-7 недель. Им внутрибрюшинно вводится раствор гексенала из расчёта 2 мг в 0,25 мл физиологического раствора на мышь; делается разрез по стернальной линии до уровня второго ребра. Тимус отсасывается с помощью вакуумного насоса, кожа зашивается. Перед использованием в опыте всегда проверяется отсутствие остатков тимуса у мышей.
Приготовление клеточной суспензии спленоцитов
После забоя тимэктомированной мыши выделяют селезенку, помещают ее в холодный раствор среды 199 и гомогенизируют в гомогенизаторе. Клеточную суспензию спленоцитов пропускают через капроновый фильтр в пластмассовую круглодонную пробирку. Все процедуры следует проводить быстро и на холоде (2 - 4 С).
Клетки селезенки отмывают трижды в питательной среде путем центрифугирования при 300 g при 4С. После третьего отмывания среду сливают, к осадку клеток прибавляют 1 - 2 мл свежей питательной среды и аккуратно ресуспендируют клетки. Далее подсчитывают количество ядросодержащих клеток селезенки общепринятым методом в камере Горяева с использованием 3%-ной уксусной кислоты, лизирующей эритроциты. Концентрацию клеток доводят до 3 х 107 клеток в 1 мл питательной средой.
Определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток в суспензии определяют с помощью окраски клеток в 0,25% растворе трипанового синего, приготовленного на физиологическом растворе. Мертвые клетки окрашиваются в синий цвет. Количество жизнеспособных клеток должно составлять не менее 90%. Приготовление рабочего раствора азатиоприна. Азатиоприн хранится при +4С. Для приготовления концентрированного раствора 1 мг азатиоприна растворяется в 1 мл 0,2 М NaHCCV Na2C03 буфера, рН 9.8 и хранится при 4С до 6 дней. Перед экспериментом из концентрированного готовится рабочий раствор, содержащий 20 мкг/мл азатиоприна: к 0,1 мл исходного раствора добавляется 4,9 мл среды 199 и тщательно перемешивается.
Приготовление рабочего раствора исследуемого препарата.
Навеска препарата массой 1 мг растворяется в 1 мл среды 199. Из этого раствора готовится рабочий раствор исследуемого препарата: к 0,1 мл исходного раствора добавляется 0,9 мл среды 199 - концентрация 100 мкг/мл. Приготовление азатиопринового буфера. К 0,1 мл исходного 0,2М раствора буфера NaHC03-Na2C03 добавляется 4,9 мл среды 199 и тщательно перемешивается. Приготовление эритроцитов барана.
Используют свежие эритроциты барана (ЭБ), которые могут храниться в течение 2-3 недель в консерванте (в растворе Олсвера) при 4 С. Эритроциты отмывают при 400 g в тех же условиях, что и клетки селезенки. После третьей отмывки супернатант отсасывается, отбирается 0,1 мл осадка клеток и разводится средой 199 в 100 раз. Таким образом, получается 1%-ный раствор эритроцитов барана, что соответствует концентрации - 12x107 клеток в миллилитре.
