Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .
Антигенная структура вируса иммунодефицита человека и гуморальный иммунитет . 10
Лабораторная диагностика инфекции, вызываемой ВИЧ. \ 14
Использование синтетических антигенных
детерминант для диагностики 20
1. 4. Выбор эпитопов, используемых для диагнос
тики 21
1. 5. Использование коньюгатов пєптидое в качест
ве антигенов в иммуноферментном анализе 24
1.6. Использование пептидов для определения
антител в сыворотках. . . < 26
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристика используемых сывороток крови 29
Характеристика синтетических антигенных детерминант 33
Проведение твердофазного иммуноферментного анализа 38
2. 4. Проведение иммуноблоттинга 40
2.5. Математическая обработка результатов .... 41
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Формирование панели сывороток 42
Разработка условий твердофазного ИФА с использованием синтетических пептидов 48
Изучение антигенной активности и диагностической значимости синтетических пептидов. ... 57
Определение чувствительности и специ -фичности разработанной тест -системы "Пептест"
и сравнение ее с другими диагностическими препа
ратами 71
4. ОБСУЖДЕНИЕ 83
ВЫВОДЫ. 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
- 4 -СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВИЧ 1(2) Вирус иммунодефицита человека первого (второго) типа
Введение к работе
Помимо инфекции, вызываемой ВИЧ 1, в последнее время все более широкое распространение получает вирус иммунодефицита человека второго типа (ВИЧ 2). Несмотря на то, что в СССР выявлено только несколько случаев инфекции ВИЧ 2, большой поток иностранных студентов из регионов эндемичных по ВИЧ 2, может привести к широкому распространению этого вируса в нашей стране. В связи с этим разработка диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ 2 является актуальной.
Большинство методов диагностики ВИЧ -инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в крови или других биологических жидкостях. С этой целью чаще всего используются различные методики, основанные на принципах иммуноферментного анализа (ИФА). С целью исключения возможных ложноположительных реакций, полученных на первом этапе исследования сыворотки, про-
водится подтверждение этого результата с помощью иммунного блоттинга. Однако применение подтверждающих тестов значительно повышает стоимость обследования и интерпретация результатов иммунного блоттинга представляет определенную сложность и требует специальной подготовки. Избежать большого количества лож-ноположительных реакций можно повышая качество тест-систем, применяемых на первом этапе обследования.
Эффективность диагностики зависит от качества и специфичности антигенов, используемых в тест -системе, ее оптимизации и стандартизации.
В первых диагностических тест-системах использовались антигены ВИЧ, полученные из культуры клеток, зараженных ВИЧ. Недостатками таких тест систем являются: 1) недостаточно высокая специфичность; 2) низкая стабильность антигенов в процессе хранения; 3) недостаточная стандартность и . воспроизводимость результатов 4) необходимость соблюдения особых мер безопасности в процессе производства и использования тест -систем. Кроме того в СССР отсутствуют клеточные линии - продуценты ВИЧ.
Одним из путей совершенствования диагностических тест -систем является использование пептидных аналогов основных им-мунодоминантных эпитопов ВИЧ, полученных методом химического синтеза (синтетические пептиды) и генной инженерии (рекомби-нантные белки). Достоинствами таких тест -систем являются: 1) высокая специфичность; 2) возможность проведения дифференциации между двумя типами ВИЧ; 3) более высокая стандартность и воспроизводимость теста; 4) невысокая стоимость; 5) отсутствие необходимости в особых мерах безопасности.
Однако при разработке и оценке качества диагностикумов на основе пептидных аналогов зпитопов ВИЧ, необходимо использовать достаточное количество образцов сывороток крови, полученных из различных географических зон, в связи с возможными вариациями антигенов вируса, а соответственно и специфичности антител. Кроме того в состав панели необходимо включать сыворотки крови от лиц, инфицированных ВИЧ, находящихся на разных стадиях заболевания, а именно, период ранней сероконверсии, развернутую клиническую и терминальную стадии, а также образцы сывороток от детей, инфицированных ВИЧ.
Несмотря на то, что качество используемых тест-систем постоянно повышается, избавиться от всех недостатков пока не удалось. Недостаточная чувствительность тест -систем снижает эффективность обследования населения, а большое количество ложноположительных реакций приводит к значительной затрате средств на проводимое обследование. Применение тест -систем, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью позволило бы избавиться от перечисленных недостатков. Таким образом разработка и внедрение диагностических тест-систем, обладающих такими качествами и позволяющих выявлять антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2, является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы является совершенствование серологической диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, путем разработки диагностической тест -системы, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, для выявления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следу-
- 8 -ющие задачи:
Охарактеризовать антительный ответ к отдельным антигенным структурам ВИЧ и сформировать панель сывороток крови, содержащих антитела к ВИЧ.
Изучить антигенные свойства синтетических пептидов с помощью созданной панели сывороток.
Подобрать оптимальный состав смеси антигенов на основе синтетических антигенных детерминант для иммуноферментной тест-системы, выявляющей антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.
Оценить чувствительность и специфичность разработанной тест -системы и сравнить ее с другими диагностикумами.
Научная новизна полученных данных.
Научная новизна представляемой работы заключается е том, что дается характеристика синтетических антигенных детерминант, аналогов различных участков белков ВИЧ, по их способности взаимодействовать с антителами к ВИЧ, что позволило оценить роль различных участков белковых молекул в развитии иммунного ответа и выбрать иммунодоминантные эпитопы ВИЧ.
Учет штаммоспецифических различий в сиквенсе эпитопов поверхностных гликопротеинов позволил разработать оптимальный сорбент для ИФ тест-системы.
Предложен метод сорбции биотинилированных синтетических антигенных детерминант на твердую фазу с использованием стреп-тавидина в качестве носителя, что привело к повышению чувствительности реакции и сокращению количества антигена при сорбции.
Практическая ценность работы.
Практическая значимость работы заключается в том, что на
- 9 -основании полученных материалов была разработана тест -система "Пептест", предназначенная для выявления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2. В настоящее время разработанная тест-система внедряется в НПО "Вектор" г.Новосибирск под названием "ВИЧ-тест 1+2".
Используя данные, полученных при создании панели сывороток крови, содержащих антитела к ВИЧ, разработан критерий оценки результатов тестирования сывороток крови методом иммунного блоттинга, а также схема проведения серологической диагностики. Данные материалы учитывались при разработке методических рекомендаций "Серологическая диагностика инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека, иммуноферментными методами".
- 10 -I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Антигенные структуры вируса иммунодефицита человека и гуморальный иммунитет.
Вирус иммунодефицита человека является этиологическим агентом, вызывающим у человека заболевание иммунной системы, приводящее к развитию синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД). Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - это ретровирус, который поражает преимущественно клетки, имеющие рецептор CD4.
На рисунке 1 схематически приведен геном вируса и его основные антигены. Ген gag кодирует р55 - полипротеин предшественник. При его расщеплении образуются меньшие структурные белки р17 и р24. Ген env кодирует высоко иммуногенный предшественник гликопро-теин - gpl60. При его расщеплении образуются гликопротеины gp!20 и gp41. Ген рої кодирует фермент обратную транскриптазу (р66/р51) и белок эндонуклеазу р31.
Исследования, проведенные с помощью методов иммунного блот-тинга и радиоиммунопреципитации, показали, что антитела против gpl60, gpl20, р24 и р17 при инфекции ВИЧ появляются первыми, через 2-4 недели выявляются антитела к gp41 и антигены молекул, еєсом от 50 до 65 кД (2-8). Антитела к р31 формируются в период от 3 до 6 недель, после появления самых ранних антител (2,5,8). Титр всех антител продолжает нарастать в течение нескольких месяцев и затем стабилизируется у бессимптомных носителей. У пациентов с прогрессирующим заболеванием по мере приближения к СПИД, продукция антител к р24 ослабевает и они исчезают у 2/3 пациентов (9,10), а антитела к поверхностным антигенам - gp41, gp!20 и gp 160 остаются
rev \tat
vpr
\vpu rev
LTR
gp 460
f)47 p2A p15
P7 p9 p22 рбб/рбі рЗ/ gp/20 дрЦ
Рисунок 1. Строение генома и основные антигены ВИЧ 1.
*.
(2,8,11-13). Антитела к р31 также исчезают при приближении к СПИД, но не в тот период, когда исчезают антитела к р24, а позже(ІЗ). Также важно наличие антител к р17, т. к. антитела к этому белку появляются одними из первых и пропадают при ухудшении состояния пациента раньше, чем антитела к р24, что позволяет назначить необходимое лечение своевременно. Кроме того, в ряде случаев антитела к р24 исчезают и появляется антиген р24, но этот процесс бывает не связан с ухудшением состояни пациента, а изучения уровня антител к р17 и р24 позволяет повысить надежность предсказания течения инфекции (14).
Во многих исследованиях, проведенных различными авторами, дату инфицирования установить не удалось, но сероконверсия с характерной картиной антительного ответа имела место во время или вскоре после развития острого симптомакомплекса, вызываемого ВИЧ. Эти случаи описаны для групп реципиентов крови, наркоманов, вводящих наркотик внутривенно и гомосексуалистов (4, 15-17). Сероконверсия наблюдается у большинства лиц в течение 2-3 месяцев после первичных проявлений ВИЧ инфекции. Однако, данные, полученные в последнее время свидетельствуют о том, что вирус может находиться в латентном состоянии, сроки которого точно не определены (18). И только пременение метода PCR(polymerase chain reaction - реакция цепной полимеризации ) позволит установить длительность этого периода. Кроме того, по данным некоторых авторов, у этих лиц присутствуют антитела к,регуляторному белку, кодируемому геном nef (19).
Из серологических методов при изучении сероконверсии лучше использовать те, которые обладают наибольшей чувствительностью при
- 13 -определении антител р24 или к поверхностным гликопротеинам с высоким молекулярным весом. Burke и др. (13) показали, что чувствительность комерческих наборов для определени антител к индивидуальным вирусным белкам значительно отличается, в частности, тест-система фирмы "Abbot" больше отражает уровень антител к gp41 и р31, тогда как другие тест-системы больше коррелируют с уровнем антител к р24, особенно наборы фирмы "Du Pont". Таким образом, данные о се-роконверсии будут различаться в зависимости от применяемой тест-системы (5).
Как и при других заболеваниях вирусной этиологии, невозможно определить антитела к ВИЧ на ранних стадиях. Кроме того описаны случаи, когда у пациентов выделяли вирус, но они при этом оставались серонегативными(26,27). Такая ситуация встречается крайне редко, кроме периода в течение трех, а иногда больше месяцев, пока не образуются антитела к вирусу.
Данные, приведенные выше, относятся к ВИЧ 1, но в последнее время появилась информация о распространении ВИЧ 2 ео всем мире и в СССР (44-46). ВИЧ 1 и ВИЧ 2 различаются по молекулярному сиквен-су более чем на 55%, но они имеют много общих черт в морфологии, геномной организации, а также в биологии. Так же как ВИЧ 1, штаммы ВИЧ 2 обладают антигенной и биологической гетерогенностью (47у). Антитела в сьшоротках крови, полученных от лиц, инфицированных ВИЧ 2, могут перекрестно реагировать с антигенами ВИЧ 1 (48-50). Перекрестная реактивность наблюдается и при использовании метода им-муноблоттинга. Чаще всего такая перекрестная реактивность отмечается с белками, кодируемыми геном gag, хотя антитела к поверхностным белкам ВИЧ 2 также могут связываться, но в меньшей
- 14 -степени, с поверхностными белками ВИЧ 1 (51-54).
Использование очищенных белков из ВИЧ 1 и ВИЧ 2 при проведении иммуноблоттинга, а также синтетических пептидов из иммунодоми-нантных областей трансмембранных белков ВИЧ 1 и ВИЧ 2 показало, что некоторые сыворотки крови взаимодействуют и с белками из ВИЧ 1 и из ВИЧ 2 (46-60). В ряде работ было высказано предположение, что такие лица инфицированы и ВИЧ 1 и ВИЧ 2. У нескольких пациентов было проведено выделение обеих вирусов и определена их провирусная ДНК с помощью PCR (61,62).
Сравнение продуктов регуляторних генов из ВИЧ 1 и ВИЧ 2 показало, что белки из ВИЧ 1 nef, tat, rev и vpr имеют соответственно 34, 31, 36 и 35% идентичности по аминокислотам с ВИЧ 2, но ген vpu уникален для ВИЧ 1 (63,64), a vpx для ВИЧ 2 (65,66).
1. 2. Лабораторная диагностика инфекции, вызываемой ВИЧ.
В СССР как и в США с 1985 года началось проведение массового обследования доноров и других групп населения на наличие антител к ВИЧ(20,21). Во всех странах был рекомендован к применению для контроля за эпидситуацией иммуноферментный метод. Применение имму-ноферментного анализа (ИФА) и его широкое распространение обусловлено тем, что при ИФА возможен контроль за качеством и стандартизация используемых реагентов (антигенов и антител), обладающих высокой специфичностью. Кроме того при ИФА используются меченные реагенты, позволяющие регистрировать образование комплексов антиген-антитело современными физико-химическими способами, обеспечивающими высокую чувствительность, точность и объективность учета
- 15 -результатов. Инструментальное оснащение анализа позволяет использовать его для массовых обследований при решении проблем эпидемиологии, защиты банков крови, диспансеризации населения. Кроме того проведение ИФА гораздо дешевле, чем проведение других методов. Хотя теоретически окончательный ответ об инфицированности и инфекци-онности должен основывается на обнаружении вируса в тканях или жидкостях организма(22).
Применяемая в настоящее время, техника для культивирования вируса иммунодефицита человека громоздка и дорогостояща, методики выделения вируса продолжительны во времени и имеют недостаточную чувствительность (23,24). Учитывая все перечисленные недостатки, становится очевидным, что выделение вируса может применяться только в научных целях.
Альтернативный подход заключается в непосредственном определении антигенов ВИЧ. И хотя этот метод был многообещающим для применения в клинике, в настоящее время он широко не применяется, ввиду низкой эффективности 24,25). Поэтому определение антител к ВИЧ в настоящее время остается основой для скрининга банков крови и работ клинических лабораторий.
Несколько лабораторных методов применяется для определения антител к ВИЧ. В настоящее время твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА) и иммунный блоттинг (Western blott) используются наиболее часто соответственно для скрининга сывороток крови и подтверждения, полученных положительных результатов, другие методы, в основном используются в научно-исследовательской работе: радиоим-мунощ)еципитация, непрямая иммунофлюоресценция и др. (36,37). Нес-мотря на то, что все используемые методы различаются по сложности
определения антител, цене, времени проведения анализа, специфичности и чувствительности, но все они нуждаются в специфических антигенах вируса, т. к. принцип этих методов основан на взаимодействии антиген-антитело. Качество проводимого анализа, как правило, определяется качеством используемого антигена.
Так при проведении иммуноферментного анализа большое количество ложноположительных реакций получают в тест-системах, где в качестве антигена используется вирус, выращенный на линии клеток Н9. Эта реактивность вызвана наличием антигенов II HLA класса, которые присутствуют в линии этих клеток, а у лиц с множественными переливаниями крови вырабатываются aHTHHLA-DR4 антитела, их взаимодействие и приводит к возникновению ложноположительных реакций. Однако антитела к ДТ?4 элиминируются при соответствующей адсорбции. Для исключения этой группы ложноположительных реакций рекомендуется проведение контрольного теста с антигенами, полученными от неинфи-цированных клеток Н9. Однако, взаимодействие антител с чистыми клетками и с зараженными не освобождает от необходимости проведения подтверждающих тестов (33). Тест-системам, где используется вирус, выращенный на культуре клеток СЕМ (Genetic Systems Corp., Seattl, Washington) присущь тот же недостаток, неизбавлены от него и технологии с использованием рекомбинантных антигенов(І).
Ложноположительные реакции встречаются часто также у пациентов с иммунологическими отклонениями : гематологическими злокачественными заболеваниями ( 7%), острыми ДНК-вирусными инфекциями (5%), и у лиц в сыворотках которых обнаруживали ревматоидный фактор, антитела к нуклеиновым кислотам и другие аутоантитела (17%), а также у реципиентов, получивших трансплантант (28- 30). Ретрос-
- 17 -пективное исследование с помощью иммуноферментных тест-систем показало, что высокий уровень ложноположительных реакций дают пациенты с множественной миеломой(21%); первичным билиарным циррозом (20%); первичным склерозивным холангитом (12%) (30) и обнаружены они также у 13% из 95 пациентов с алкогольным гепатитом (31).
Обнаружен высокий уровень ложноположительных реакций у лиц, подготовляемых к пересадкам почек - для них характерен высокий уровень реакций с панелью нормальных лимфоцитов. Получен также высокий процент ложноположительных реакций при постановке подтверждающего теста - иммуноблоттинга (5%) - в подобных популяци-ях(33,34,35).
Как основной метод для подтверждения положительных результатов, полученных на первом этапе обследования, используется иммунный блоттинг, хотя его чувствительность ниже, чем тИФА (38) и составляет иногда 88% (39). В качестве антигена в иммуноблоттинге используется смесь антигенов ВИЧ. Антигены ВИЧ, раделенные элект-
v чес*и
рофорети согласно молекулярному весу, переносятся на нитроцеллю-лозную мембрану, что позволяет в дальнейшем определить наличие антител к отдельным вирусным белкам. Состав антигена и качество связывания могут значительно варьировать в зависимости от источника антигена и метода приготовления.
Вначале исследований, проводимых с помощью иммуноблоттинга CDC (Center for Disease Control) рекомендовал считать результат положительным даже если выявлялись антитела только к р24, но в дальнейшем было показана неправильность данного утверждения (40). В настоящее время положительным принято считать результат в том случае, если присутствуют антитела не менее, чем к двум поверх-
- 18 -ностным гликопротеинам.
У некоторых пациентов при тестировании в иммуноблоттинге не выявляются антитела к поверхностным гликопротеинам. Такой результат расценивается как "сомнительный". Некоторые пациенты с "сомнительным" результатом в иммуноблоттинге находятся на ранней стадии инфекции ВИЧ и имеют "неполный серологический ответ". Последующее тестирование сывороток таких пациентов позволит наблюдать серокон-версию - появление антител к другим антигенам БИЧ. Тем не менее существуют данные о том, что многие пациенты, в сыворотках крови которых выявлялись антитела только к р24 или к другим белкам из gag или рої, относились к группам низкого риска заражения. У них не наблюдалось появление антител к другим белкам, и не было получено подтверждение об инфицированности ВИЧ с помощью других методов (40,41). Одно из самых подробных исследований было проведено Poel и др. (42). Они наблюдали за 7 донорами, у которых наблюдалась непонятная реактивность с р24 в иммуноблотте. Серологическое тестирование и попытки выделить вирус в культуре показали, что у доноров не имелось признаков инфекции, вызываемой ВИЧ 1, ВИЧ 2, HTLV 1 и HTLV 4. У них не было выявлено никаких факторов риска заражения. Наблюдение за 10 реципиентами, получившими кровь от этих доноров, показало, что через 6 месяцев после трансфузии у них не выявлялось ни серологических, ни клинических признаков какой либо инфекции. Другими авторами (43) также отмечалась реактивность с р24 и/или р55кд. Наблюдения в течение 5 лет за лицами сыворотки крови которых давали такую реакцию, показали, что результат иммуноблоттинга оставался идентичным. Дополнительные тестирования другими методами ( непрямая иммунофлюоресценция, радиоиммунная приеципитация)были
- 19 отрицательные 43).
Достижения в гсшюй технологии и химии дали возможность использовать для диш'ностики ВИЧ инфекции белки, полученные путем экспрессии в бактериях (67) и синтетические пептиды, как дешевый источник антигеноЕ. Оба метода имеют ср.ои недостатки и свои достоинства. Так белки, полученные рекомбинантной ДНК технологией должны быть высоко очищены при использовании в тИФА, чтобы избежать ложноположитсльпых реакций, причиной которых могут быть белки клеток и бактерий, вызывающих перекрестную реакцию. Антигены высокой чистоты трудно выделить и часто необходимо прибегать к дорогим методам и проводить дополнительные исследования. Пептиды, полученные гешюипжоиерпым способом, содержат много зпитопов в отличии от синтетических, которые могут состоять только из «?.5-30 аминокислотных остатков, что в большинстве случаев по длине представляет один эпитоп. Синтез более длинных пептидов, несмотря на все достижения в химии в течение последних лет, является очень сложным и дорогим. Однако использование автоматических систем позволяет проводить синтез пептидов за короткое время и в довольно больших количествах. Кроме того синтетические пептиды свободны от контаминирующих белков и могут быть использованы после однократной очистке на колонке.
Для скрининга сывороток необходимо применять набор пептидов, представляющих несколько зпитопов. Необходимо учитывать, что в результате генетических различий в иммунной системе каждого индивидуума, антитела в сыворотках, полученных от различных лиц, могут не взаимодействовать с одним и тем же эпитопом(68).
- 20 -1.3. Использование синтетических антигенных детерминант для
диагностики. В последнее время пептиды стали широко использоваться в науке и медицине. В частности, синтетические пептиды были предложены как специфические антигены р, диагностических иммуноферментных тест-системах для определения антител в сьшоротке крови (70-76). Одно из основных преимуществ пептидных тест-систем в том, что они позволяют легко и быстро установить субтип инфекционного вируса, например ВИЧ 1 или ВИЧ 2 (73,77). Кроме того применение твердофазного метода (78) и адаптация его к автоматическим системам, позволяет синтезировать пептиды в относительно короткое время и с высоким выходом.
Так как олигопептиды представляющие основную последовательность эпитопов имеют ограниченный размер, их использование в диагностических тест-системах возможно только после выяснения предоминантных антигенных сайтов, которые узнаются в иммунном ответе и участвуют при связывании специфических антител.
Синтетические олигопептиды используются в диагностических тест системах, в основном, для определения гуморального иммунного ответа, развивающегося во время инфекции. В большинстве вирусных систем гуморальный иммунный ответ с продукцией молекул антител направлен против вирусных белков, которые входят в состав оболочки вируса или поверхностных структур.
Идентификация и характеристика антигенных сайтов является необходимой когда пептиды используются как антигены для определения антител в сыворотке или для получения специфической антипептидной сыворотки животных. Самые маленькие эпитопы для распознавания ан-
- 21 -титол, которые были описаны, имели длину от 4 до 6 аминокислот (79,80), в основном же применяются пептиды от 12 до 20 аминокислот. Эти последовательности формируют соответствующие эпитопы, которые создаются третичной структурой при свертывании аминокислотной цепи, так же как это происходит в нативном вирусе.
В течение последних лет используются дяе основные процедуры для выяснения аминокислотной последовательности эпитопов:
1)аналиъ аминокислотной последовательности и предсказание эпитопов антигена с помощью компьютерных программ, основанных на теоретических и эмпирических данных, связывающих аминокислотную последовательность со структурными конформационными параметрами, и 2) синтез перекрывающихся пептидных участков всей последовательности белка или использование пептидных фрагментов, полученных протеолитическим расщеплением очищенных полипептидов и тестирование этих фрагментов на способность связываться с антителами в сыворотках крови, полученных от инфицированных лиц.
Причины неузнаЕанин пептидов антителами в' сыворотках крови многочисленны. К этому могут привести изменения, вызванные отсутствием последовательностей, стабилизирующих данную структуру эиитопа в белке, или мимикрия эпитопов белков хозяина с выбранной областью, представленной в виде олигопептида, даже без гомологии в сиквенсе. Подобное исследование было проведено Goysen (79). В большинстве случаев только экспериментальное исследование соответствующих синтетических пептидов может показать возможность их применения.
1. 4. Выбор эпитопов, используемыу для диагностики.
Хотя точная информация, касающаяся структуры белков и облас-
тей, расположенных на их поверхности, может быть получека только такими методами, как дифракция рентгеновских лучей (81) и ЯМР спектроскопия, в последнее время найден определенный алгоритм, общий для определения антигенных сайтов. Были разработаны программы для компьютеров, основанные на наблюдениях, которые помогают идентифицировать последовательность эпитопов вплоть допервичной аминокислотной последовательности.
Для предсказания непрерывных антигенных сайтов и иммунодоми-нантных детерминант в белке важно не только анализировать индивидуальные параметры, которые являются общими дли эпитопов, такие как гидрофильность (82), доступность на поверхности (83) или вероятность вторичных структур (84,Ob), но объединяя эти величины разрабатывать алгоритмы (86).
При выборе пептидов необходимо помнить, что участок белка аналогом которого они являются, должен быть расположен на поверхности структуры, образованной белком и мембраной, и не содержать N-глико-зилированные сайты, так как структура эпитопов может быть сильно изменена введением карбоксильной группы (87). Антитела в сьшоротках крови пациентов , которые вступают ео взаимодействие с модифицированными эпитопами часто направлены против гликозилированных групп или структурных детерминант, полученных в результате модификаций. Так же аптисыЕоротка,полученная от жиеотных может не узнавать эпи-топ в нативном не модифицированием полипептиде (88).
Фосфорелирование пептидов, как было показано, ведет к изменению основной структуры, что в свою очередь приводит к изменению антигенных детерминант (88).
В случае трансмембранного белка ВИЧ 1 можно предсказать распо-
ложение только одной диагностически значимой области - этот сайт находится в области богатой цепями и предшествует гликозшитрованно-му участку. Рядом исследователей было показано, что этот участок довольно консервативен, и пептиды из этой области постоянно узнаются сыворотками крови от инфицированных ВИЧ пациентов, и в связи с этим они являются постоянным компонентом тест-систем для диагностики ВИЧ (76,89).
Несмотря на развитие, более надежного метода, прогнозирующего антигенные эиитоиы, Geysen и др. (90) разработали другой подход для анализа иммунодоминантных участков, который заключался в синтезе коротких перекрывающихся пептидов на химически активированных по-листереновых шпильках. После защиты боковых групп эти фиксированные пептиды проверялись на взаимодействие с сывороткой от лиц, инфицированных вирусом. Качество идентификации антигенных сайтов с использованием этого метода зависит от оптимизации пептидного синтеза, так как индивидуальные сикеєнсн не могут быть охарактеризованы или очищены вследствие их фиксации на иголках. Неправильная последовательность может привести к отсутствию взаимодействия или к высокой перекрестной реактивности пептидов. Кроме того, пептиды, синтезированные на иголках, должны иметь в длину, по крайней мере, девять аминокислотных остатков, так как более короткие последовательности, особенно неполярных аминокислот, могут образовать довольно стабильные структуры как с пластиковым материалом, так и друг с другом, ведущие к образованию "Липких пептидов" с высоко -неспецифической реакцией со многими белками, в том числе и с молекулами антител. Следовательно положительную специфическую реакцию, которая получается при тестировании очищенных пептидов, "полученных
- 24 -другими методами, можно не обнаружить. Применение метод, где полис-тереновий носитель используется и при синтезе пептидов и при проведении реакции в тИФА, упрощает и удешевляет проведение исследований (100).
Метод получения неконьюгированных свободных пептидов, с помощью многократных пептидных синтезов (91), дает большое количество пептидных аналогов, которые затем используют в тИФА для идентификации эпитопов, путем взаимодействия с антителами в сыворотках кроии, полученных от инфицированных лиц. Этот метод не позволяет определить окончательно взаимодействующий пептид, но имеет преимущество в том, что реагирующий с сывороткой пептид может быть выделен и очищен. Недостаток такого подхода - довольно высокая стоимость синтеза большого количества олигопептидов.
Другое направление в маркировании эпитопов связано с использованием отдельных пептидов, полученных из нативных белков посредством протеолитического расщепления CNCr или разрушения ферментами. Этот метод может быть выбран,когда имеется достаточное количество белков вируса из инфицированных культур или вирусных белков, полученных методом генной инженерии. Продукты ресщепления могут быть очищены и протестированы на взаимодействие с положительной сывороткой. Затем олигопептиды, дающие положительную реакцию сиквенируют-ся.
1. 5. Использование коньюгатов пептидов в качестве антигенов в иммуноферментном анализе.
Процедура конъюгации очищенных антигенов имеет большое влияние на способность антигена взаимодействовать с антителами и на способность антипептидной сыворотки узнавать нативную белковую последова-
- 25 -тельность(5б).
При конъюгации пептид можно представить в виде близком к его нативиому состоянию. Dyrberg и Oldstone (93) отмечали значительную разницу в реактивности сывороток с одним и тем же пептидом к которому антиген присоединен через карбокси- или амино-концевую группу. Ковалентное евиаьшапие с носителем должно преимущественно проводиться через терминальный остаток. Одна из возможностей - зто использование SH групп (94), так как связывание такими реактивами как карбодиимиды (95) или глютаральдегид (96) слитком разрушает и инак-тивирует функциональные антигенные сайты, так как при этом используются карбоксильные или амино функциональные группы из внутренних аминокислот (Glu, Asp, Lys), а не только с концов пептида. Аминокислоты Glu, Asp, Lys гидрофильные и заряженные, что имеет большое значение для формирования антигенного сайта.
Из данных литературы известно о применении ковалентного связывания молекул пальмитиновой кислоты к терминальному остатку лизина в пептиде(82) или связывании пептидов с липосомами( 97). Эти конь-югаты с успехом были применены для получения антипептидных еьшоро-ток(82,97).
Когда используемый в тИФА антиген нуждается в конъюгации пептида с полистероловой поверхностью, наиболее широко применяются два основных метода:
1)связывание Свободных очищенных пептидов путем неспецифической сорбции на поверхность пластика (98) обычно при высоких значе ниях рН или ковалентное связывание пептидов функциональными NH группами после обработки полистереновых лунок глютаральдегидом;
2) использование пептидов ковалентно связанных с белковыми
- 26 носителями (например, бычьим сывороточным альбумином) и использование этих комплексов для адсорбции на поверхность пластика.
Хотя эти методы применяются в различных тест-системах, все они могут привести к изменению или разрушению антигенных детерминант (99).
1.6. Использование пептидов для определения антител в сыворотках.
Системы, где используются синтетические олигопептиды как антигены в диагностических тест-системах, применяются, в основном, для определения антител при вирусных инфекциях в тех случаях, когда выращивание вируса в культуре клеток сопряжено с рядом трудностей.
До того, как приступить к разработке тест системы на синтетических пептидах, необходимо иметь основные знания о биологических чертах вируса, сиквенсе и антигенных вариациях.
Необходимость в существовании простой и безопасной тест-системы для диагностики ВИЧ привела к созданию первых комерческих тест-систем, где в качестве антигена использовались синтетические антшеппне детерминанты (Biochrom KG, LabsisterrE, Johnson and Johnson).
Основные усилия были предприняты для идентификации и локализации диагностически важных эпитопов в последовательности структурных белков и белков поверхностного комплекса. Антитела к эпито-пам, локализованным на наружном отрезке петли gp41 оказались наиболее важными для диагностики инфекции, вызванной* ЪИЧ (74,89).
При разработке тест-систем, основанных на синтетических пептидах, в случае с ВИЧ возникли проблемы, связанные с крайней вариабельностью антигенных сайтов в белках (101). Такая высокая степень вариабельности характерна для антигенных эпитопов, локализованных в основном в комплексе поверхностных белков, но имеет место также и в белках core.
Одно из основных преимуществ использования синтетических пептидов в диагностических системах - это возможность измерения концентрации антител к одному специфическому эпитопу. Недавно было показано, что прогностическим критерием для лиц, инфицированных ВИЧ, может быть определение титра антител против определенных областей поверхностного белка gpl20 (100) и gp41 (102). При тестировании сывороток крови от больного со СПИД было установлено, что ответ гуморального иммунитета направлен, в основном, на пептид из области 315 - 326 аминокислотных остатков в gpl20. У носителей же ВИЧ (без клинических признаков заболевания), несмотря на различие в реактивности и титре антител у разных образцов (от разных лиц), реакция наблюдалась к пептидам, полученным из других зпитопов gp!20. Снижение образования антител к определенным эпитопам у пациентов со СПИД может быть использовано, ісак диагностический маркер, когда пациент переходит в терминальную стадию инфекции.
Кроме ТОГО, Определение аНТИТеЛ ПРОТИВ СПеЦИфИЧеСКИХ Э11ИТ01ЮН
позволяет установить различии между вирусными инфекциями, вызванными родственными вирусными штаммами или субтинами тех же вирусных типов. Gnann (73) и Norby (77) показали, что возможно установить разницу между инфекциями,, вызванными ШЧ 1, ВИЧ 2 и SIV, используя пептиды, полученные из трансмембранной области поверхностных белков
- 28 -gp36/gp41, которые отличались друг от друга но последовательности аминокислот. Применение единственного пептида для тестирования сывороток крови может быть полезным при определении вирусных штаммов. Однако тестирование сывороток крови от лиц из географических районов, где среди вирусных изолятов существует большая вариабельность последовательности аминокислот, в тестсистемах с одним пептидом может привести к ложнонегативным результатам.
Вирусные изоляты, имеющие различное происхождение (США, различные районы Африки, Карибские острова), показывают высокую степень антигенных вариаций. Это высокое разнообразие в комбинации с различными иммунными реакциями каждого индивидуума, основанными на генетике HLA-комплекса, приводит к необходимости использовать набор пептидов, представляющих опитопы из одних и тех же или из различных структурных белков. Modrow (68), используя набор ВИЧ 1 и ВИЧ 2 специфических пептидов, последовательности которых езяты из белков оболочки и поверхностных белков, диагностируют инфекцию, вызванную вирусами ВИЧ, и устанавливают разницу между двумя типами вирусов даже тогда, когда сыворотки не реагируют с отдельным эиитопом или реагируют перекрестно с одним из пептидов.
Область белка, длиною 12-20 аминокислотных остатков, которая не дает перекрестных реакций или белковые последовательности,гомологичные для двух типов вирусов, проще получить путем химического синтеза. Такие тест-системы, где в качестве антигенной смеси используется набор синтетических пептидов, находят все более широкое применение для диагностики большого количества вирусных, бактериальных и иммунологических заболеваний, а также для дифференциации штаммов или для определения различных стадий заболевания.
