Введение к работе
Актуальность проблемы.
Молекулы HLA второго класса - это мембранные гликопротеины, имеющие гетеродимерное строение. Они принимают участие в контроле иммунного ответа, презентируя фрагменты антигена Т-лимфоцитам. Система HLA класса II характеризуется высокой степенью аллельного полиморфизма и играет ключевую роль в совместимости тканей при трансплантации. В настоящее время также показана ассоциация конкретных генотипов HLA с рядом патологий (заболеваний), в первую очередь аутоиммунных, что может быть положено в основу формирования групп риска, доклинической диагностики и прогноза течения заболеваний. Кроме того, являясь одной из наиболее полиморфных систем, позволяющих идентифицировать разных индивидуумов, HLA представляет интерес для судебно-медицинских и других исследований.
При типировании комплекса HLA до сих пор в основном применяли серологические и клеточные методы. Однако отсутствие специфических сывороток на многие аллельные вариации, а также принципиальные ограничения, связанные с полиморфизмом обоих цепей молекул HLA класса II, часто приводят к недовыявлению антигенов и к неоднозначному типированию.
В последнее время активно развиваются альтернативные методы типирования, основанные на детекции нуклеотидных замен в генах HLA. Это, прежде всего, такие методы, как: (a) SSP (sequence specific primers) -типирование с помощью набора различных пар праймеров, каждая из которых амплифицирует определенную группу аллелей либо единичную аллельную вариацию; (б) SSO - (sequence specific oligonucleotide) метод, основанный на гибридизации олигонуклеотидньгх праймеров с амплифицированным участком ДНК (A.Abe и соавт. 1992, T.H.Eiermann и соавт. 1991); (в) метод RFLP (restriction fragment length polymorphism), использующий разницу длин фрагментов ДНК, полученных в результате
перевара продуктов амплификации набором рестриктаз (J.J.Hyldig-Nielson и соавт. 1987, H.Inoko 1988); (г) SSCP (single-strand conformation polymorphism), отличающий аллели по разности электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов ДНК, обусловленной характерными элементами вторичной структуры (P.Patel и соавт. 1992), и другие методы.
Несмотря на определенные преимущества каждого из уже существующих методов, все они обладают по-крайней мере одним из следующих недостатков: а) длительное (более 4-5 часов) время типирования; б) высокая трудоемкость; в) высокая стоимость типирования; г) повышенные требования к качеству образцов ДНК. Указанные недостатки затрудняют использование методов генотипирования в условия> клинической лаборатории и не позволяют проводить ургентнос типирование, что имеет принципиальное значение при подборе совместимых пар донор-реципиент при органной трансплантации.
Все изложенное выше определяет актуальность данной работы.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящей работы состоит в разработке метод; мультипраймерной ПЦР (MSSP - mixture of sequence specific primers) длі типирования генов HLA класса II, позволяющего в условиях клиническоі лаборатории в течение 2,5 - 3 часов проводить типирование генов HL/ класса II. .
В соответствии с намеченной целью в процессе работа предполагалось решение следующих задач:
1. Отработать нетрудоемкую и недорогую методику выделения ДНК
позволяющую в короткое время (порядка 30 мин) выделять ДНК и
образцов крови.
2. Разработать схему амплификации и анализа ПЦР-продукто
обеспечивающую надежное типирование с возможно менее жестким]
требованиями к качеству образцов ДНК и общим временем типирования менее 3 часов.
3. Проанализировать аллельный полиморфизм генов HLA класса II и
выбрать систему праймеров позволяющих надежно амплифицировать все
известные аллельные варианты генов HLA - DRBI, DQA1 и
дифференцировать их по разнице длин ПЦР-продуктов.
4. Провести проверку специфичности разработанной системы
типирования на международной стандартизированной панели HLA-
типированных образцов ДНК.
Научная новизна.
Впервые для типирования генов HLA был использован принцип мультипраймерной ПЦР с последующей детекцией в полиакриламидном или агарозном геле и дискриминацией аллелей генов HLA по разнице длин продуктов амплификации.
Впервые в России разработан оригинальный метод HLA-генотипирования, позволяющий в течение 2,5 - 3 часов в условиях клинической лаборатории проводить типирование образцов крови.
Впервые, с использованием разработанного метода генотипирования, стало возможным проводить перспективное ургентное ДНК-типирование доноров при подборе HLA-совместимьгх пар донор-реципиент для органной трансплантации.
Практическая значимость.
Практическая значимость данной работы определяется, прежде всего, двумя факторами:
1) разработанная система генотипирования позволила использовать перспективное генотипиропание локуса HLA класса II при подборе пар донор-реципиент для органной трансплантации, что значительно улучшило индекс совместимости и дает основания предполагать существенное увеличение эффективности трансплантации;
2) Простота, минимальная трудоемкость и относительно низкая цена разработанной системы позволяет внедрить методы генотипирования в клиническую практику для формирования групп риска ряда заболеваний, для которых показана ассоциация с определенными HLA-генотипами (инсулин-зависимый сахарный диабет и др.), а также расширить исследования проблемы "HLA и болезни" на генетическом уровне.
Публикации.
Материалы диссертации опубликованы в 18 печатных работах, изданных в России и за рубежом, а также доложены на: 12tli European Immunology Meeting (Barcelona, Spain, 1994), International Conference 'The major histocompatibility complex in medicine" (Adelaide, Australia, 1994), Joint Meeting of British Society for Histocompatibility and Immunogenetics and European Foundation for Immunogenetics (Brighton, 1995), 12th International Histocompatibility Workshop and conference (Paris, France, 1996)..
Объем и структура диссертации.
