Содержание к диссертации
Введение 6
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
Мультифакторность ревматоидного артрита 13
Генетические основы ревматоидного артрита 16
1.3. Основные теории, объясняющие ассоциацию генов HLA П класса
с развитием рвматоидного артрита 18
Гипотеза общего эпитопа 18
Гипотеза взаимного влияния генов локусов HLA DRB1, DQA1, DQB1 22
Гипотеза устойчивости к развитию ревматоидного артрита ...24
1.4. Полиомрфизм генов HLA П класса и аутоантитела 27
Цитруллин и цитруллинация 32
Антитела против цитруллинированных пептидов при ревматоидном ратрите 33
Диагностическое и прогностическое значение антицитруллиновых антител 36
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1. Иммуногенетические исследования 40
Характеристика обследованных больных 40
Характеристика контрольной группы 42
Методы иммуногенетического типирования 43
2.2. Серологические исследования 45
Характеристика обследованных лиц 45
Методы серологического исследования 46
2.3. Статистическая обработка результатов 48
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 52
3.1. Полиморфизм генов HLA П класса в ассоциации с ревматоидным
артритом, предрасполагающие и протекторные гены 52
3.1.1. Полиморфизм генов локуса DRB1 в ассоциации с
ревматоидным артритом 53
Распределение генов HLAII класса в зависимости от возраста начала ревматоидного артрита 55
Распределение аллельных вариантов гена HLA DRB1 *04 у больных ревматоидным артритом 57
Полиморфизм генов локусов DQA1 и DQB1 в ассоциации с ревматоидным артритом 60
Распределение гаплотипов у больных ревматоидным артритом 62
raiuiOTfflibiDQAl-DQBl 62
Гаплотипы DRB 1-DQA1-DQB1 64
3.2. Сравнительная оценка аутоантител различных типов при
ревматоидном артрите 67
3.2.1. Сравнительная распространенность аутоантител различных
типов и их комбинации у больных ревматоидным артритом 67
3.2.2.Чувствительность и специфичность 69
3.2.3. Ассоциация гена DRB1 *04 с наличием антител к
модифицированному цитруллинированному виментину 74
Глава 4. Заключение 77
Выводы 87
Приложение 88
Список литературы 91
Список сокращений
АИТ — аутоиммунный тиреоидит
АПК — антиген представляющие клетки
ВКР — В клеточный рецептор
ДК - дендритные клетки
ИСЗД — инсулинозависимый сахарный диабет
ИФА - иммуноферментный анализ
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РА - ревматоидный артрит
РФ - ревматоидный фактор
СКВ — системная красная волчанка
Тх - Т-хелпер
А — аминокислота аланин
АСРА — антитела к цитруллинированным пептидам
ACR - американская коллегия ревматологов
AFA - антифилаггриновые антитела
АКА — антикератиновые антитела
APF - антиперинуклеарный фактор
ССР -циклический цитруллинированный пептид
D — аспарагиновая кислота
Е — глютаминовая кислота
HLA — лейкоцитарный антиген человека
HV3 - третья гипервариабельная область
IFN - интерферон
IL - интерлейкин
К - аминокислота лизин
МНС - главный комплекс гистосовместимости
NLR - Nod-подобные рецепторы
PAD - пептидиларгининдеиминаза
Q —аминокислота глютамин
R - аминокислота аргинин
RAP- гипотеза устойчивости к развитию ревматоидного артрита
SE - общий эпитоп
TKR -рецептор Т клеток
TLR - Toll подобные рецепторы
TNF - фактор некроза опухоли
Treg - Т-регуляторные лимфоциты
>
Введение к работе
Актуальность темы. Ревматоидный артрит (РА) является одной из актуальных медико-социальных проблем. Это обусловлено отсутствием четких представлений об этиологии и патогенезе РА, комплексного мультифакторного заболевания, для которого характерны гетерогенная клиническая картина, преимущественное поражение лиц трудоспособного возраста, ранняя инвалидизация, снижение качества и продолжительности жизни больных. Все сказанное создает трудности в ранней досимптоматической и дифференциальной диагностике РА, подборе эффективных методов лечения.
Анализ результатов молекулярно-генетичесішх исследований показал, что в развитии РА значительная доля всей генетической составляющей (30-40%) принадлежит генам HLA II класса главного комплекса гистосовместимости человека. Об этом свидетельствуют результаты экспериментальных работ и клинических исследований: наличие в фенотипе определенных генов HLA П класса локусов DRB1, DQA1 и DQB, а также определенных гаплотипических сочетаний ассоциировано с высоким или же минимальным риском развития данной аутоиммунной патологии во многих европейских популяциях. Такие ассоциации являются предметом изучения направления «HLA и болезнь» [24]. На сегодняшний день наименее изученной в этом плане является территория Российской Федерации, что связано с ее большой протяженностью, различиями географических и экологических районах проживания населения и его многонациональностью. В последние годы получены результаты о предрасполагающей роли гена DRB1*04 в популяции руссішх Московской области [16] и в популяции башкир Челябинской области [8].
К сожалению, несмотря на установление множества существенных патогенетических деталей, механизм инициации и персистенции заболевания полностью не раскрыты, что иллюстрируется недостаточной диагностической эффективностью используемых критериев, предложенных в 1987 году Американской коллегией ревматологов (ACR) на ранних этапах развития РА. Поэтому наряду со всесторонним изучением иммуногенетических аспектов интенсивно исследуются иммунологические показатели РА, аутоиммунного нарушения, сопровождающегося продукцией специфических для РА аутоантител различных типов. С 2008 года, помимо ревматоидного фактора, одного из «старейших» лабораторных показателей РА, в критерии ACR внесен еще один, более специфический — наличие антител к цитруллинированным пептидам, как дополнительный критерий иммунологического варианта РА [19].
В то же время, несмотря на то, что ассоциативная связь РА с генами HLAII была обнаружена 30 лет назад, а высокоспецифичные для РА антицитруллиновые антитела были открыты более 40 лет назад, только в начале XXI века были выполнены работы, показывающие связь этих показателей, в частности ассоциацию аллелей генов HLAII класса с продукцией специфических аутоантител, играющих важную роль в проявлении клинических симптомов заболевания.
Цель работы
Анализ ассоциации полиморфизмов генов HLA П, определяющих чувствительность / устойчивость к ревматоидному артриту, с наличием аутоантител различных типов (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса IgM) с целью выделения комплексного
информативного лабораторного маркера риска развития ревматоидного артрита в русской популяции Челябинской области. Задачи
Изучить особенности распределения аллелей и генов локусов DRBl, DQAl, DQBl HLA П класса и их гаплотипических сочетаний в русской популяции больных ревматоидным артритом.
Установить аллели, гены и гаплотипы HLA П класса, определяющие предрасположенность или устойчивость к ревматоидному артриту в популяции русских Челябинской области.
Определить распространенность аутоантител различных типов (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса IgM) и их комбинаций у больных ревматоидным артритом.
Оценить чувствительность и специфичность аутоантител различных типов у больных ревматоидным артритом.
Оценить диагностическую эффективность и информативность определения комплекса иммуногенетического и серологических показателей в лабораторной диагностике ревматоидного артрита.
Научная новизна
Определены особенности распределения аллелей и генов локусов DRBl, DQAl, DQBl HLA П класса у больных ревматоидным артритом и здоровых лиц в популяции русских Челябинской области.
, Впервые представлены данные об аллелях, генах и гаплотипах локусов DRB1 и DQAl, DQBl HLA II класса, определяющих предрасположенность и устойчивость к развитию ревматоидного артрита в популяции русских Челябинской области:
предрасположенность к РА определяют: ген HLA DRB1*04, аллели DRB1*0401, DQA1*0301, DQB1*0302, генотипы DRBl*01/04, DRB1*03/04 и гаплотипы DQ3, DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*301 и DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302.
устойчивость к РА определяют: гены DRB1*11, DRB1*13, DRB1*15, аллели DQA1*102, DQA1*103, DQBl*0602-8, гаплотипы DRB1*07-DQA1*0201-DQB1*0201, DRBl*13-DQAl*103-DQBl*0602-8, DRBl*15-DQAl*102-DQBl*0602-8.
Новыми являются данные о частоте встречаемости, чувствительности и специфичности основных серологических показателей у больных ревматоидным артритом: антител к модифицированному цитруллинированному виментину (анти-MCV), суммарного ревматоидного фактора (РФсум) и ревматоидного фактора класса IgM (POjgM) и их комбинаций. Показано, что наиболее специфичным тестом для диагностики РА является определение анти-MCV антител. Максимальные значения специфичности достигаются при определении комбинации МСЧ+/РФсу}Л+, MCV+/POIgM+ и одновременном обнаружении трех типов аутоантител, что позволяет проводить дифференциальную диагностику РА от группы заболеваний, протекающих с поражением суставов.
Показана высокая информативная значимость определения комбинации иммуногенетического маркера и серологического показателя анти-MCV в лабораторной диагностике ревматоидного артрита. Для комбинации DRBl*04+aHra-MCV характерна максимальная чувствительность (1,0) и высокая специфичность (0,75). Эти данные позволяют заключить, что позитивность по двум показателям: DRB1*04 и анти-MCV, является высоко чувствительным и
специфическим лабораторным маркером при выделении группы риска среди родственников больных РА.
Основные положения, выносимые на защиту
Носительство определенных аллелей, генов и гаплотипов HLA П класса определяет риск развития ревматоидного артрита в русской популяции Челябинской области.
Высоко специфичным для диагностики ревматоидного артрита является определение антител к модифицированному цитруллинированному виментину. Максимальная специфичность достигается при определении комбинации антител трех типов (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса IgM), что позволяет дифференцировать ревматоидный артрит от группы заболеваний, протекающих с поражением суставов.
Определение комбинации иммуногенетического (носительство гена DRBP04) и серологических (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса IgM) показателей может служить высоко чувствительным и специфическим лабораторным маркером риска развития ревматоидного артрита в русской популяции Челябинской области.
Практическая значимость
Данные о распределении полиморфизмов генов локусов DR и DQ HLAII класса в группе больных РА и контроле могут использоваться в качестве группы сравнения при проведении иммуногенетических исследований в таких разделах научных направлений как «Генетическое разнообразие человека» и «HLA и болезни».
Новый подход к оценке генетической предрасположенности/ устойчивости к развитию РА на основании ассоциации аллелей, генов, генотипов и гаплотипических сочетаний HLA II класса можно использовать для молекулярной диагностики РА и генетического прогнозирования в семьях больных РА русской популяции Челябинской области.
Одновременное выявление у больных РА трех серологических показателей (антител к модифицированному цитруллинированному виментину, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса IgM) позволит проводить дифференциальную диагностику группы больных РА от группы заболеваний, протекающих с поражением суставов.
Определение ассоциации аутоантител различных типов, их комбинации между собой и с иммуногенетическим показателем (носительство гена DRB1 *04) может служить лабораторными маркерами риска развития РА среди родственников больных русских Челябинской области и позволит выработать наиболее эффективную тактику профилактики и лечения РА.
Полученные результаты могут быть использованы в лабораторной практике в рамках технологий молекулярной медицины в качестве вспомогательных факторов, способных дополнить классические факторы риска развития ревматоидного артрита при формировании группы риска.
Реализация результатов исследования
Результаты исследования внедрены в практику зональной лаборатории иммунологического типированния ткани ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови», ревматологических отделений МУЗ Городская клиническая больница
№6 и НУЗ «Дорожная клиническая больница на ст. Челябинск ОАО РЖД» г. Челябинска. Основные положения работы используются в научно-педагогической деятельности кафедры микробиологии ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет» в лекционном курсе «HLA и болезни».
Апробация работы
Материалы диссертации доложены: на конференции, посвященной 25-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории Челябинской государственной медицинской академии - «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Челябинск, 2006); на всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (г. Пермь, декабрь 2006 г.); на международной конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (г. Киров, июнь 2007 г.); на конференции «Фундаментальное и прикладное значение оценки гена иммунного ответа» (г. Челябинск, январь 2008 г.)
Публикации
По теме работы опубликовано 15 научных работ.
