Содержание к диссертации
Введение 4
Глава 1. Генетический полиморфизм цитокинов и ревматоидный артрит
12
Полиморфизм генов цитокинов: понятие, виды, функциональное значение, генетический компонент ревматоидного артрита 12
Полиморфизм гена TNFa, связь с РА 18
Гены вне кластера шестой хромосомы. Полиморфизм генов IL-ip, IL-lRa и ревматоидный артрит 24
Гены вне кластера шестой хромосомы. Полиморфизм гена IL-4, влияние на возникновение и клинический полиморфизм РА 29
Глава 2. Материалы и методы 33
Обследуемые лица 33
Методы исследования 37
2.2.1. Выделение ДНК из клинических образцов 37
2.2.2 Определение полиморфизма генов цитокинов 37
2.3. Статистическая обработка результатов 42
Глава 3. Распределение аллелей, генотипов генов IL-lRa, IL-lp, IL-4, TNFa у представителей русской и башкирской популяций Челябинской
области 48
Глава 4 Ассоциация полиморфизма генов IL-lRa, IL-ip, IL-4, TNFa с
предрасположенностью и клиническими вариантами ревматоидного
артрита 54
Распределение аллелей, генотипов генов IL-lRa, IL-lp, IL-4, TNFa в группе больных РА русской и башкирской популяций Челябинской области 54
Распределение аллелей, генотипов генов IL-lRa, IL-lp, IL-4, TNFa в группах больных РА русской и башкирской популяций с различным
- клиническим течением заболевания 64
Глава 5. Ассоциация комбинаций генотипов генов IL-lRa, IL-lp, IL-4,
TNFa с PA 73
Заключение 86
Выводы 99
Приложение 100
Список использованной литературы 112
Список используемых сокращений
ПААГ Полиакриламидный гель
ПДРФ Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПНР Полимеразная цепная реакция
РА Ревматоидный артрит
СПИД Синдром приобретенного иммунодефицита
CD4 Маркер Т-хелперов
CTLA-4 Cytotoxic Т lymphocyte-associated antigen-4
HLA Человеческий лейкоцитарный антиген
IFN интерферон
IL Интерлейкин
IL-IRa Рецептор-антагонист интерлейкина-1
LTa Лимфотоксин a
MIF Macrophage migration inhibitory factor, хемокин
ингибирующий миграцию макрофагов
МНС Major histocompatibility complex, главный комплекс
гистосовместимости
NF-кВ Ядерный фактор кВ
PAD 14 peptidyl arginine deiminase, пептидил аргинин
деиминаза PTPN 22 protein tyrosine phosphatase N22, протеин тирозин
фосфатаза N22
RANK рецептор -активатор NF-kB
SE Shared epitope, общий эпитоп
SNP Single Nucleotide Polymorphism, полиморфизм no
одному нуклеотиду
STR short tandem repeats, короткие тандемные повторы
TGFa Трансформирующий фактор роста a
TLR Toll like receptors, толл-подобные рецепторы
Th Т-хелперы
TNFa Фактор некроза опухолей a
VNTR variable number of tandem repeats, варьирующее
число тандемных повторов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ревматоидный артрит (РА) - сложнонаследуемое
мультифакторное заболевание с неизвестной этиологией [16, 84]. В
настоящее время принято считать, что в
предрасположенность/устойчивость к этому заболеванию вносят вклад гены иммунного ответа и другие, не установленные на сегодняшний день, а также факторы окружающей среды [11, 16, 82, 84 116, 153]. Возможно, инициацию заболевания вызывают микроорганизмы [9], вступающие в определенные, нередко непредсказуемые отношения с организмом хозяина, несущего особые варианты генов, продукты которых прямо или косвенно участвуют в защите организма хозяина. На сегодня хорошо известно, что РА ассоциирован с носительством определенных аллельных вариантов генов HLA-DRB1 [76, 82], и эти ассоциации имеют этнические различия [5, 35].
Однако гены HLA обеспечивают только часть общего генетического риска, примерно у 25% больных не обнаружено генов предрасположенности к РА в пределах главного комплекса гистосовместимости, и в то же время здоровые лица являются носителями генов предрасположенности к РА второго класса HLA [167]. Скрининг генома показал участие в восприимчивости к РА других генов, рассеянных по всему геному [82, 96]. Несмотря на исследования в этой области, вопрос об этиологии заболевания до сих пор остается открытым [90, 116]. Проблема РА рассматривается как приоритетное направление «Декады костей и суставов 2000 - 2010», которая проходит под эгидой ВОЗ во многих странах мира, включая Россию [16, 22].
Территория Челябинской области представлена
многонациональным населением, среди которого распространенными являются русская, популяция европеоидного происхождения, и башкирская - микст-популяция [45], с набором комплекса генов иммунного ответа, с высокой частотой встречающихся у монголоидных популяций [36]. В исследованиях И.В. Девальд и Е.Б. Хромовой, проведенных в лаборатории молекулярной иммуногенетики УрО РАН, показано наличие различий в ассоциации РА с генами и гаплотипами HLA II: DRBl, DQAl, DQB1 между русскими и башкирами: у русских установлены аллельные варианты генов и гаплотипы, предрасполагающие к РА, а у башкир превалируют гены и гаплотипы HLA, определяющие протекцию к PA: DRB1*07,*12,*13 и целый гаплотип - В* 13 - DRB1*07- DQA1*0201- DQB 1*0201. Если у европеоидов аутоиммунные заболевания часто связаны с гаплотипом В* 15- DRB1*04 [35], то у башкир, больных РА, такой гаплотип не был представлен, что может являться их особенностью как популяции монголоидов, а наличие РА ассоциировалось с DRB 1*17(03) [12].
В свете того, что РА является хроническим воспалительным заболеванием, совершенно ясно показано в ряде работ, что развитие воспалительного процесса, его исход будет определяться во многом цитокинами, создающими регуляторную биоактивную сеть сигналов, определяющих не только врожденный иммунный ответ, но и формирование адаптивного иммунного ответа, в том числе его направленность, выраженность, персистенцию [52, 74, 116, 123, 139]. Опубликованы работы, посвященные изучению определения уровней различных цитокинов в циркуляции в физиологических условиях и при патологии [22, 33, 51, 68], и оценка интерлейкин-продуцирующей способности отдельных клеток иммунного ответа in vitro [79, 135], и
значительно меньше — генам цитокинов, их рецепторов, транскрипционным регуляторным факторам, посттрансляционной модификации цитокинов [17, 27, 79, 97, 101]. Многие авторы считают, что большую роль в развитии предрасположенности и вариабельности течения мультифакторных заболеваний играют не столько отдельные аллели генов, сколько их сочетания [34, 37, 38, 63], прежде всего в сетевых взаимодействиях клеток воспаления, обеспечивающих «цитокиновьтй разговор». Накопление данных о распределении аллельных вариантов, генотипов и гаплотипов генов цитокинов среди различных популяций позволит приблизиться к пониманию ряда механизмов развития мультифакторных заболеваний и лечь в основу как профилактической медицины, так и подходов к лечению и созданию технологий получения современных лечебных препаратов [8, 28, 96]. Однако данные, полученные в работах этого направления исследований немногочисленны и чрезвычайно противоречивы, но их можно суммировать по определенным группам:
1. Для генов цитокинов и их рецепторов отмечены популяционные
различия [48, 56, 69, 89, 97].
2. Различные аллели генов цитокинов имеют ассоциацию с
различным уровнем продукции цитокинов и
чувствительностью/устойчивостью к инфекционным и аутоиммунным
заболеваниям [41, 72, 101].
3. Группа генов, которые, практически, конститутивно
активируются при любом воспалении, составляет широко
востребованный «воспалительный/хемотаксический цитокиновый»
кластер, который ко-активируется в содружестве с другими кластерами
генов, и их продукты взаимозависимо функционируют в клетках, прямо
или косвенно определяющих течение иммунного ответа. Активация
экспрессии генов различных кластеров контролируется в основном через активацию TLR-ассоциированных сигнальных путей [29], и профиль транскрипционной программы обеспечивает «общий ответ» клеток хозяина, определяемый как «видовой ответ тревоги». Исходя из сказанного, можно предположить, что кластер «воспаления» состоит из многих генов, их вариабельностей и комбинаций, которые работают в строгом взаимодействии друг с другом, что позволяет говорить о важности межгенных и внутригенных отношений в формировании общих и специфических защитных ответов организма-хозяина, дестабилизация которых может привести к пролонгированной хронической воспалительной реакции и аутоиммунному процессу.
Результаты недавних исследований показали, что развитие воспалительного ответа на встречу с инфекционными агентами определяется цитокиново-хемокиновой сетью, эффективность которой зависит от реализации общей и специфической программы активации транскрипции генов, работающих в тесном содружестве, несмотря на свое расположение на разных хромосомах [29].
Данная работа посвящена исследованию полиморфизма нескольких генов цитокинов про- и противовоспалительного действия у больных РА двух основных популяционных групп: русских и башкир, проживающих на территории Челябинской области.
Цель исследования
Установить особенности распределения аллелей и генотипов генов основных цитокинов у здоровых представителей и больных ревматоидным артритом русской и башкирской популяций и оценить наличие межгенных и внутригенных взаимодействий этих генов в ассоциации с ревматоидным артритом с целью выделения маркеров предрасположенности/устойчивости к данному заболеванию.
Задачи исследования
Выявить общие черты и различия в распределении аллельных вариантов и генотипов генов IL-lRa, IL-4, IL-lp, TNFa между группами практически здоровых лиц русской и башкирской популяций для формирования контрольных групп.
Изучить особенности распределения аллелей и генотипов генов IL-lRa, IL-4, IL-lp, TNFa у больных ревматоидным артритом в сравнении со здоровыми лицами в русской и башкирской популяциях.
Определить частоты встречаемости аллелей и генотипов генов IL-lRa, IL-4, IL-ip, TNFa при различных клинических вариантах ревматоидного артрита у русских и башкир.
4. Оценить ассоциацию межгенных и внутригенных
взаимодействий в виде сочетаний генотипов генов цитокинов с
предрасположенностью/устойчивостью к ревматоидному артриту
русской и башкирской популяций.
Научная новизна
Впервые дана характеристика распределения частот генов основных цитокинов: аллельных вариантов и генотипов, в русской и башкирской популяциях Челябинской области.
Показано наличие межпопуляционных различий в частотах встречаемости аллельных вариантов и генотипов генов цитокинов IL-lRa, IL-lp, IL-4, TNFa у больных РА русских и башкир.
Новыми являются данные об ассоциации комбинаций конкретных генотипов генов цитокинов IL-ip и IL-4, лежащих на разных хромосомах и характеризующихся альтернативной функцией своих продуктов при воспалении, а также генотипов TNFa, входящих в различные гаплотипы, с устойчивостью/ предрасположенностью к РА башкирской и русской популяций.
Основные положения, выносимые на защиту
Для русской и башкирской популяций Челябинской области характерны межпопуляционные различия в распределении полиморфных генов IL-IRa, IL-4, -238 G/A TNFa.
В башкирской популяции протекторным к ревматоидному артриту является генотип С/Т +3953 IL-ip, а поздний возраст начала ревматоидного артрита ассоциирован с генотипом 2г/2г VNTRIL-4.
В русской популяции только у женщин установлен маркер предрасположенности к ревматоидному артриту - SNP -1031 Т/С TNFa, а клинические варианты — ранний возраст начала ревматоидного артрита и возникновение системных проявлений, соответственно, ассоциированы с генотипами +3953С/Т гена IL-ip, и -308G/A TNFa.
4. Среди всех изученных межгенных и внутригенных
взаимодействий генов цитокинов для формирования
предрасположенности/устойчивости к ревматоидному артриту имеют
значение следующие комбинации: у башкир с
чувствительностью/устойчивостью к ревматоидному артриту
ассоциированы различные генотипы комбинации генов цитокинов +3953
IL-ip и VNTR IL-4, у русских - чувствительность к ревматоидному
артриту ассоциирована с комбинациями генотипов гена TNFa G/A-308 -
С/А -863 и G/A-308 - Т/С -1031.
Теоретическая и практическая значимость работы Результаты сравнительного анализа аллелей, генотипов, внутригенных и межгенных связей генов основных цитокинов в ассоциации с РА у русской и башкирской популяционных групп позволили установить наличие межпопуляционных различий и показать значимость конкретных генотипов генов IL-ip, IL-4, TNFa в создании генетических комбинаций, способных выступить в качестве маркеров
предрасположенности/устойчивости к РА у русских и башкир. Данные о носительстве определенных генотипов, образованных полиморфными сайтами в генах TNFa и IL-1(3, могут служить теоретической базой в разработке вопросов фармакогеномики и предложены в качестве дополнительных диагностических маркеров РА.
Полученные данные могут быть использованы в популяционньтх исследованиях в рамках научного направления «Генетическое разнообразие человека», а также в работах по разделам экологическая, эволюционная и инфекционная иммуногенетика. Кроме того, обследование двух популяций Челябинской области - русских и башкир, связано с необходимостью получения данных о распределении частот аллелей и генотипов генов цитокинов среди многонационального населения евроазиатской части России и включения полученных сведений в регистр доноров костного мозга.
Анализ полиморфизма генов цитокинов IL-IRa, IL-4, IL-lp, TNFa у русских и башкир Южного Урала проводится впервые.
Внедрение результатов исследования. Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при преподавании отдельных тем курса иммунологии на биологическом факультете ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет».
Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы обсуждались на конференциях: «IV конференция Иммунологов Урала» (г. Уфа, 2005), «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (г. Челябинск, 2006), «V конференция Иммунологов Урала» (г. Оренбург, 2006), Конференция молодых ученых, поев, памяти профессора Н.Н. Кеворкого «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (г. Пермь 2006), XI Всероссийском научном форуме с международным участием имени
академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2007), международная конференция «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (г. Киров, 2007), «VI конференция Иммунологов Урала» (г. Ижевск, 2007), конференция зональной лаборатории иммунологического типирования тканей «Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008).
По материалам диссертации опубликовано 20 работ.
