Введение к работе
'Ч'с3..1^-0-?
Актуальность проблемы. Исследования в области молекулярной генетики главного комплекса гистосовместимости значительно расширили наши представления о степени полиморфизма региона HLA-D, что находит своё выражение как в картировании на этом участке 6-ой хромосомы новых генов (HXA-DRB5) (J.Kawaiet al.,1990), так и в расширении перечня их аллельных вариантов. (J.Bodmer et al.,1991). Этому способствовало внедрение в практику новейших методов, позволяющих изучать микрополиморфизм HLA на уровне ДНК -рестриктного анализа, "прогулки по хромосоме", олиготипирования, секвенирования генов.
На основе данных о дополнительном полиморфизме шл и
разработки методов ДНК-гипирования в настоящее время продолжается
поиск генетических маркеров для заболеваний человека С
наследственной предрасположенностью. Гибридизацией
аллельспецифичных олигонуклеотидных зондов с геномными ДНК в ряде случаев были установлены высокоассоциированные с. некоторыми заболеваниями аллели НЬА. Так, наряду с известными данными о позитивной ассоциированности ревматоидного артрита (РА) с серологически выявляемой специфичностью HLA-DR4 в результате олигонуклеотидного типирования был показан более тесный характер ассоциированности этого заболевания с некоторыми ей аллелышми вариантами, чем с широкой специфичностью HLA-DR4 {G.Nepom et al.,1989).
Было также установлено, что этническая принадлехшость обследуемых лиц оказывает влияние кок на закономерности распределения молекулярных вариантов HLA-DR4 в здоровой популяции, так и на характер ассоциативных связей с РА.
Вместе с этим, подобные исследования полиморфизма гена HLA-DRB1 04 и установление ассоциированных с РА аллелей этого гена у нас в стране ещё не проводились. Отсутствует информация о частоте аллельных вариантов HLA-DEB1 04-гена как в здоровой популяции, так и среди больных РА, проживающих в Западной Сибири.
Между тем, широкая ласпространённость РА в данном регионе и связанные с ним ранняя временная нетрудоспособность, инвалидизация больных в молодом возрасте, а также необходимость дифференцированного подхода в диагностике заболеваний на основе учёта этнической принадлежности обследуемых лиц ( N.Meiira.1988) делают важным исследование полиморфизма гена HLA-DRB1 04 среди больных РА и здоровых жителей Западной Сибири.
Весьма противоречивыми оказались представленные в литературе результаты по оценке ассоциированности РА с аллелями другого гена
HXA-DQB1 03, тесно сцепленного С HLA-DRB1 04-ГЄН0М
(D.Singal et al,1987; G.Nepom et al.1989j
Ранее было установлено, что третьему гйпервариабельному региону гена HLA-DRB1, в котором сосредоточены основные различия между аллельными вариантами HLA-DR4, соответствует часть а-спирали белковой молекулы НЬА класса II, которая взаимодействует на поверхностной мембране со структурой Т-клеточного рецептора
{В..Lang et al.,1988). Показано, что это взаимодействие, обусловленное структурными особенностями ША антигенпрезентирующих клеток, определяет эффективность иммунного ответа на чужеродные антигены (К.Нхгауашаидвб'). Исследование антигенраспознающей функции, в зависимости от генотипа H1A-DHB1 04 и HTA-DQB1 клеток-респондеров, также представляет определённый теоретический интерес, так как это позволяет приблизиться к пониманию
молекулярных механизмов генетики иммунного ответа, который может контролироваться НХА-молекулами на центральном уровне через позитивную селекцию предшественников Т-лимфоцитов.
Всё изложенное выше явилось основанием для проведения настоящего комплексного структурно-функционального исследования некоторых генов региона HLA-D.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение закономерностей распределения аллелышх вариантов ге-тов
HXA-DRB1 04 И HIA-DQB1 у НЬАЧЖ4-П03ИТИВНЫХ бОЛЬНЫХ РА И ЗДОрОВЫХ
жителей Западной Сибири и различий функциональной активности антигенраспознашдах клеток в алло-СКЛ, обусловленной полиморфизмом этих НХА-генов.
Соответственно поставленной цели перед исследованием были выдвинуты следующие задачи:
1. Установить серологические специфичности НХА-га, с которыми
связан наибольший риск развития РА у европеоидов в Западной
Сибири и оценить вклад HLA-Ш в клинический полиморфизм
заболевания.
2. Провести сравнительный анализ распределения аллельных
вариантов генов HLA-DFB1 04 и HLA-DQB1 среди здоровых жителей
Западной Сибири в сопоставлении с лицами монголоидного и
кавказоидного происхождения, проживающих в других регионах мира.
3. Идентифицировать аллельные варианты генов HLA-DEB1 04 и
HLA-DQB1 у HlA-DR4-no3HTHBHHx лиц в Западной Сибири,
ассоциированные с развитием РА, клиническими вариантами его
течения и эффективностью терапии.
4. Исследовать спонтанную и стимулированную в
однонаправленной СКЛ пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови у НЬА-БК4-позитивннх больных РА и здоровых лиц в зависимости от аллельной HLA-DRB1 04- И HLA-DQB1 ггоинадлежности.
Научная новизна работы. Применение аллельспецифичных олигонуклеотидов позволило впервые в СССР выявить молекулярные
Варианты гена KLA-DRB1 04 - HIA-DRB1 0404 И HLA-DRB1 0408, ДЛЯ
которых показана более тесная связь с заболеванием (RR=12.02), чем для широкой серологической специфичности HLA-DR4 (RR=3.95). Негативный характер ассоциированности с РА выявлен для других
аллелей ЭТОГО гена - HLA-DRB1 0403 и HLA.-DRB1 0407.
Наши исследования также показали, что частота аллелей гена HLA-DQB1 03 не отличается в группах НЪА-ВД4-позитивных больных РА и здоровых лиц в обследуемой субпопуляции. Вместе с этим у здоровых европеоидов Сибири впервые обнаружена не встречающаяся ранее ассоциация HLA-DR4 с НЪА-DQwi (аллели HLA-DQB1 0501 и
HLA-DQB1 0601 ).
При сравнительном анализе характера распределения аллельных вариантов генов. HLA-DRB1 04 и HLA-DQB1 03 среди лиц европеоидного происхождения, проживаквшх в Западной Сибири и некоторых других странах Западной Европы и США, были выявлены как существенные различия, так и сходства в распределении этих аллелей, что может формировать своеобразный маркерный "портрет" субпопуляций.
Были показаны изменения антигенраспознающей функции Т-клеток в зависимости от их HLA-DRB1 04 и HXA-DRQB1 -генотипа в однонаправленной - алло-СКЯ. Установлено, что клетки, несущие HLA-DRB1 0403 и -DRB1 0407 являются высоко отвечающими по
сравнению С НІД-ШВ1 0404 и -DRB1 0408 (р<0.01). Невыявляющийся у больных РА генотип HLA-DQB1 0501 и DQB1 0601 маркирует низкую спонтанную пролиферативную активность.
Практическая ценность работы. В результате проведенного
исследования показано, что диагностическая значимость
иммуногенетических методов при установлении заболевания может быть
существенно повышена с помощью молекулярно-генетических подходов
на основе ДНК-типирования. Это связано с тем, что
высокоспецифичные олигонуклеотиды, гибридизующиеся с
комплементарными участками ДНК, позволяют идентифицировать не выявляющиеся серологическими методами молекулярные варианты, которые в большей степени (в 3 раза), чем серологические специфичности ассоциированы с развитием РА.
Метод ДНК-типирования олигонуклеотидаш апробирован на базе лаборатории радиохимии НИБХ АН СССР. Подобраны экспериментальные условия, сохраняющие строгую специфичность и высокую чувствительность метода. Обнаруженные закономерности в характере распределения аллолей "КХА-ШЕ1 0404 и -DFB1 0408 могут быть основанием для рекомендации применения данного метода в клинической практике при диагностике РА в обследованной субпопуляции.
На защиту выносятся следующие ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ:
1. Ассоциированность Ра у европеоидов Западной Сибири,
длительное время проживающих среди коренного монголоидного
населения, с аллельными вариантами гена KLA-DBB1 04 - HLA-BR31
0404 и HLA-DRB1 0403 носит более тесный характер в сравнении с
серОЛОГИЧеСКИ Идентифицируемой СПеЦИфИЧНОСТЬЮ HLA-DR4.
-
Распределение аллелей генов HXA-DEB 04 и HXA-DQB1 03 среда европеоидов Западной Сибири существенно отличается от его характера у кавказоидного населения других стран мира, и его определение, вероятно, может быть использовано для лопулядаонио-генетических исследований не только на этническом, но и на национальном уровне.
-
Аллели генов НХА-МВ1 и -DQB1 являются общими маркёрами интенсивности спонтанной и стимулированной аллоантигенами пролиферагивной активности лимфоцитов. Накопление или снижение частоты этих аллелей среди больных РА является истиной причиной сделанных ранее заключений о снижении пролиферативной активности клеток при РА.
4. Отсутствие полной ассоциированности РА с серологически
выявляемыми специфичностями НЬА-системы может быть связано с
наличием у этих больных идентичных структур ДНК в третьем
гипервариабельном регионе второго экзона гена hla-dkbi,
взаимодействующего с Т-клеточным рецептором, и не выявляемыми с
помощью антител.
Апробация работы и публикации. Полученные результаты были доложены и обсуадены на I Всесоюзном симпозиуме по иммуногенетике (Новосибирск, 1939 г.), I Всесоюзном съезде иммунологов (Дагомыс, 1989 г.), I Всесоюзном симпозиуме иммунологов (Цхалтубо, Т990 г.), II Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990 г.), IV Всесоюзном съезде ревматологов (Минск, 1991 г.).
Апробация работы состоялась на расширенном семинаре
Института клинической иммунологии СО АМН СССР 10 октября 1991 г.
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста. В её состав входят введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты исследовании и их обсуждение, изложенные в 3 главах, заключение и вывода. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 23 таблицами. Список литературы состоит из 310 источников, из них 55 работ отечественных авторов.
